Im Februar letzten Jahres (2003), wurde bei fast 9000 Personen rund um den Globus SARS diagnostiziert, wovon etwa 800 an den Folgen dieser Krankheit gestorben sind. Auch dieses Jahr sind wieder im Winter einige (~9) Fälle von SARS aufgetreten, die aber auf einen Vorfall in einem Labor in Beijing zurückgeführt werden konnten (www.wpro.who.int/sars). Der neue Coronavirus Typ wurde aus den befallenen Geweben der Patienten isoliert und als der Auslöser der Erkrankung erkannt. Bisher gibt es keine Behandlungsmöglichkeiten gegen diesen neu aufgetretenen Erreger.
Die Coronaviren sind positiv Einzelstrang (+) RNA Viren und gehören zusammen mit den Arteriviridae und Roniviridae zu der Ordnung der Nidovirales. Das Genom des SARS-Coronavirus umfasst etwa 30 kB und hat am 5´-Ende eine Cap-Struktur und am 3´-Ende eine Poly(A)sequenz. Nach der Infektion wird das 5´ - ORF (open reading frame) zu einem grossen Polyprotein translatiert. Dieses Polyprotein wird durch virale Proteinasen an konservierten Stellen geschnitten, wodurch einige nichtstrukturelle- Proteine, darunter RNA abhängige RNA-Polymerase (REP), Adenosintriphosphatase (ATPase) und Helicase (Hel) freigesetzt werden. Diese Proteine sind ihrerseits für die virale Replikation verantwortlich (Snijder et al., 2003). Diese Arbeit befasst sich mit der Expression, Aufreinigung und Kristallisation des nicht-strukturellen Proteins 8 des SARS Coronavirus. Die Kristallisation ist die Vorraussetzung für die Strukturbestimmung dieses Proteins und benötigt einen sehr hohen Reinheitsgrad des betreffenden Proteins. Die Struktur könnte eventuell helfen, die bis zu diesem Zeitpunkt unbekannte Funktion des Proteins aufzuklären, welches eventuell für die RNA Bindung verantwortlich sein könnte. Die strukturellen Studien könnten auch für das rationale Drug design nützlich sein. Zwar sind aktuell keine Fälle von SARS aufgetreten, doch die Epidemiologen halten ein erneutes Auftreten in der Zukunft für möglich. Deshalb ist es die beste Vorbereitung, sich mit der gesamten Biologie des Virus zu befassen, um auf mögliche Ausbrüche von SARS vorbereitet zu sein.
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung
2. Einleitung
2.1 Coronaviren
2.2 SARS coronavirus und Replikationsstrategie
2.3 Zielsetzung
3. Materialien und Methoden
3.1 Materialien
3.1.1 Chemikalien
3.1.2 Geräte
3.2 Methoden
3.2.1 Expression von nsp8
3.2.1.1 Expression der Vorkultur
3.2.1.2 Induktion und Überexpression von nsp8
3.2.1.3 Ernte und Aufschluss der E. coli Zellen
3.2.2 Aufreinigung von nsp8
3.2.2.1 Aufreinigung mittels NiNTA Affinitätssäule
3.2.2.2 Elution des Nicht-Struktur Proteins8(nsp8) von der NiNTA Affinitätssäule
3.2.2.3 Einengen des Probenvolumens durch Amicon® UFZ
3.2.2.4 Aufreinigung des nsp8 durch Gelfiltration (Grössenfraktionierung)
3.2.2.5 SDS-PAGE
3.2.2.6 Bestimmung der Proteinkonzentration
3.2.2.7 Aufkonzentrierung der nsp8 Proteinlösung
3.2.3 Kristallisation von nsp8
3.2.3.1 Phasendiagramm
3.2.3.1.1 Löslichkeitskurve (Solubility Curve)
3.2.3.1.2 Metastabile Zone (Metastable Zone)
3.2.3.1.3 Nukleationszone (Nucleation Zone)
3.2.3.1.4 Präzipitationszone (Precipitation Zone)
3.2.3.2 Kristallisation mittels Verdunstungsdiffusion am hängenden Tropfen
3.2.3.3 Kristallisation mittels Verdunstungsdiffusion am sitzenden Tropfen
3.2.3.4 Bestimmung der Löslichkeitsgrenze für (NH4)2SO4, PEG 6k und NaCl
3.2.3.5 Kristallisationsexperimente (Allgemein)
3.2.3.6 Kristallisation von nsp8
3.2.3.7 Überprüfung der Kristalle
4. Ergebnisse und Diskussion
4.1 Expression und Aufreinigung von nsp8
4.2 Kristallisation von nsp8
Zielsetzung und Themenfelder
Die vorliegende Arbeit verfolgt das Ziel, das Nicht-Struktur Protein 8 (nsp8) des SARS-Coronavirus für eine Röntgenstrukturanalyse zu kristallisieren, um dessen bislang unbekannte Funktion und mögliche Rolle bei der RNA-Bindung aufzuklären.
- Molekularbiologische Überexpression von rekombinantem nsp8 in E. coli
- Optimierung von Reinigungsverfahren mittels Affinitätschromatographie und Gelfiltration
- Systematische Untersuchung von Kristallisationsbedingungen mittels "Trial-and-Error"
- Einsatz von Seeding-Methoden zur Induktion von Nukleation und Kristallwachstum
Auszug aus dem Buch
3.2.3.1.2 Die Metastabile Zone (Metastable Zone)
Diese Zone befindet sich in einem kritischen Zustand zwischen Sättigung und Übersättigung. Hier kann noch keine spontane Nukleation erfolgen, das heisst, dass hier das Kristallwachstum nur durch äussere Einflüsse wie Vibrationen, Temperaturänderungen oder Einfügen von Partikeln möglich ist. Allerdings besteht die Gefahr von heterogenen Nukleationen, das heisst, dass keine stabilen und reinen Kristalle zu erwarten sind. Die Breite der metastabilen Zone ist umso breiter, je geringer die Löslichkeit des Proteins ist. Würde man in diese Zone „Saat“, kleine Kristalle, zugefügen, fangen diese oft zu wachsen an, angetrieben durch den Proteinüberschuss in der kritischen Lösung.
Zusammenfassung der Kapitel
1. Zusammenfassung: Gibt einen Überblick über den SARS-Ausbruch 2003, die Biologie des Virus und die Relevanz dieser Arbeit für die zukünftige Forschung.
2. Einleitung: Beschreibt die Familie der Coronaviren, die Replikationsstrategie des SARS-Coronavirus und definiert das Ziel der Kristallisation von nsp8.
3. Materialien und Methoden: Detaillierte Auflistung der eingesetzten Chemikalien, Geräte sowie der experimentellen Abläufe von der Expression bis zur Kristallprüfung.
4. Ergebnisse und Diskussion: Dokumentation der erfolgreichen Aufreinigung von nsp8 und der durchgeführten Kristallisationsversuche unter verschiedenen Bedingungen.
Schlüsselwörter
SARS-Coronavirus, nsp8, Protein-Expression, Affinitätschromatographie, Gelfiltration, Kristallisation, Phasendiagramm, Röntgenstrukturanalyse, Nukleation, Seeding, SDS-PAGE, Proteinreinigung, virale Replikation, Metallo-Additive
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser wissenschaftlichen Arbeit?
Die Arbeit befasst sich mit der biochemischen Charakterisierung des Nicht-Struktur Proteins 8 (nsp8) des SARS-Coronavirus, mit dem Ziel, durch Kristallisation die strukturelle Basis für das Verständnis seiner Funktion zu schaffen.
Welche zentralen Themenbereiche werden bearbeitet?
Die Schwerpunkte liegen auf der Überexpression des Proteins, dessen mehrstufiger Aufreinigung und der methodischen Suche nach geeigneten Bedingungen für die Proteinkristallisation.
Was ist das primäre Forschungsziel?
Das Ziel ist die Erlangung hochreiner nsp8-Kristalle als Voraussetzung für eine Röntgenstrukturanalyse, um potenzielle Bindungsstellen oder Funktionen, insbesondere bei der RNA-Interaktion, zu identifizieren.
Welche wissenschaftlichen Methoden kommen zum Einsatz?
Es wurden molekularbiologische Standardverfahren zur Expression, Affinitätschromatographie (NiNTA), Gelfiltration, SDS-PAGE zur Reinheitsprüfung sowie diverse Kristallisationstechniken (Verdunstungsdiffusion, Seeding) genutzt.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in die detaillierte Beschreibung der Proteinaufreinigung sowie der umfangreichen Versuchsreihen zur Kristallisation unter Variation von Parametern wie pH-Wert, Temperatur und Additiven.
Welche Begriffe charakterisieren die Arbeit am besten?
Neben den technischen Begriffen wie NiNTA-Chromatographie und Gelfiltration sind insbesondere SARS-Coronavirus, nsp8-Protein, Kristallisations-Screening und Seeding-Methoden zentrale Begriffe.
Warum ist eine so hohe Proteinreinheit für die Kristallisation notwendig?
Verunreinigungen durch andere Proteine oder Partikel stören die Ausbildung eines geordneten Kristallgitters und verhindern somit die erfolgreiche Röntgenstrukturanalyse.
Welche Herausforderung stellte sich bei der Kristallisation des nsp8?
Die größte Herausforderung war die Induktion einer kontrollierten Nukleation, wobei oft entweder amorphe Präzipitate oder gelartige Strukturen auftraten, die durch weitere Optimierungen der Puffer und Additive überwunden werden mussten.
- Quote paper
- Wilhelm Bohr (Author), 2004, Expression, Aufreinigung und Kristallisation des nicht-strukturellen Proteins 8 (nsp8) aus dem SARS-Coronavirus, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/32526
