Kardiovaskuläre Erkrankungen stehen in der Todesursachenstatistik der westlichen Welt nach wie vor an erster Stelle. In Europa und den USA sterben jährlich mehr Menschen an den Folgen dieser Erkrankungen als an infektiösen und neoplastischen Erkrankungen zusammen. Neben den Risikofaktoren Zigarettenrauch, männliches Geschlecht, Hyperlipoproteinämie, Diabetes mellitus und Adipositas spielt die arterielle Hypertension eine wichtige Rolle in der Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen (Fried et al., 1998; Lowe et al., 1998; Menotti et al., 2001). Im klinischen Alltag wird häufig eine Blutdruckerhöhung bei systemischer Glucocorticoidgabe beobachtet. Glucocorticoide finden einen breiten Einsatz bei vielen verschieden Erkrankungen wie z.B.: rheumatische Erkrankungen, Kollagenosen, Nierenerkrankungen, Allergien, Lungenerkrankungen (insbesondere Asthma), Tumoren, gastrointestinalen Erkrankungen (M. Crohn und Colitis ulcerosa), endokrinen, neurologischen, dermatologischen, ophthalmologischen Erkrankungen und nicht zuletzt bei Transplantationen zur Bekämpfung der Abstoßungsreaktion (Hricik et al., 1994). Aus diesem Grund ist der Zusammenhang zwischen systemischer Glucocorticoidgabe und Hypertension Thema zahlreicher klinischer und experimenteller Untersuchungen (Saruta, 1996; Whitworth et al.; 1997; Garbe et al., 1997).
Inhaltsverzeichnis
Einleitung
Zusammenhang zwischen systemischer Glucocorticoidgabe und Hypertension
Struktur und Funktion kleiner Arterien
Intima
Media
Adventitia
Die Rolle von NO
NO: Biochemie und Physiologie
Wirkung von NO auf die Gefäßweitenregulierung
Die NO-Synthasen
Die endotheliale NO-Synthese
Problemstellung – Ziel der Untersuchung
Material und Methode
Versuchstiere und Versuchstierhaltung
Untersuchungsmaterial und chirurgische Eingriffe
Das Rückenhautkammermodell an der Maus
Chirurgische Eingriffe
Vorbereitungen
Implantation der Rückenhautkammer
Geräte und Untersuchungstechnik
Postoperative Kontrolle
Fixierung der Tiere
Die nicht-pulsatile Superfusion des
Rückenhautkammergewebes
Technische Untersuchungsmethode
Versuchsdurchführung
Fütterung der Mäuse
Superfusion des Rückenhautkammergewebes
Versuchsdesign
Datenauswertung
Ergebnisse
Vasorelaxation bei Dexamethason-behandelten Mäusen
Vasorelaxation bei L-Arginin-behandelten Mäusen
Anteil der NO-vermittelten Vasodilatation
bei ACh-Stimulierung
Konzentrationsabhängige endotheliale Vasorelaxation
Diskussion
Die Validität des Rückenhautkammermodells an der Maus
Anforderungen eines Tiermodells zur Untersuchung der
Mikrozirkulation
Validität der Superfusion
Bedeutung der Intravitalmikroskopie zur Untersuchung der
Funktion kleiner Gefäße
Einfluß hämodynamischer Parameter
Einfluß der Flußgeschwindigkeit auf den
Gefäßdurchmesser
Einfluß der Gefäßweite auf das Ausmaß der
Vasodilatation
Pathophysiologische Hypothesen zur Wirkung von
Dexamethason auf die endothel-abhängige Vasorelaxation
Einfluß von L-Arginin auf die Verbesserung der durch
Dexamethason gestörten endothel-abhängigen Vasorelaxation
Einfluß anderer vasodilatatorischer Mechanismen
Klinische Bedeutung
Zusammenfassung
Literaturverzeichnis
Danksagung
Lebenslauf
Abkürzungsverzeichnis
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Einleitung
Kardiovaskuläre Erkrankungen stehen in der Todesursachenstatistik der westlichen Welt nach wie vor an erster Stelle. In Europa und den USA sterben jährlich mehr Menschen an den Folgen dieser Erkrankungen als an infektiösen und neoplastischen Erkrankungen zusammen. Neben den Risikofaktoren Zigarettenrauch, männliches Geschlecht, Hyperlipoproteinämie, Diabetes mellitus und Adipositas spielt die arterielle Hypertension eine wichtige Rolle in der Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen (Fried et al., 1998; Lowe et al., 1998; Menotti et al., 2001).
Im klinischen Alltag wird häufig eine Blutdruckerhöhung bei systemischer Glucocorticoidgabe beobachtet. Glucocorticoide finden einen breiten Einsatz bei vielen verschieden Erkrankungen wie z.B.: rheumatische Erkrankungen, Kollagenosen, Nierenerkrankungen, Allergien, Lungenerkrankungen (insbesondere Asthma), Tumoren, gastrointestinalen Erkrankungen (M. Crohn und Colitis ulcerosa), endokrinen, neurologischen, dermatologischen, ophthalmologischen Erkrankungen und nicht zuletzt bei Transplantationen zur Bekämpfung der Abstoßungsreaktion (Hricik et al., 1994).
Aus diesem Grund ist der Zusammenhang zwischen systemischer Glucocorticoidgabe und Hypertension Thema zahlreicher klinischer und experimenteller Untersuchungen (Saruta, 1996; Whitworth et al.; 1997; Garbe et al., 1997).
Zusammenhang zwischen systemischer Glucocorticoidgabe und Hypertension
Arterielle Hypertension mit ihren Folgeerscheinungen wie vermehrte Arteriosklerose, Schlaganfall, Hirnblutung, hypertensive Kardiomyopathien und Myokardinfarkt ist eine wesentliche Nebenwirkung systemischer Glucocorticoidgabe. Erhöhter Blutdruck ist sowohl beim Menschen (Lund‑Johansen, 1983; Raison et al., 1988) als auch bei spontan hypertensiven Ratten (Smith und Hutchins, 1979) mit einem erhöhten peripheren Widerstand verbunden. Der Zusammenhang zwischen Glucocorticoiden und Bluthochdruck ist jedoch immer noch sehr wenig untersucht (Wallerath et al., 1999). Sowohl die Natriumretention als auch eine Erhöhung des Sympathikotonus spielen nur eine untergeordnete Rolle bei der Entstehung des corticoidinduzierten Hypertonus. Viel wichtiger hingegen scheint eine Supprimierung des NO-Systems zu sein (Kelly et al., 1998 a). Eine unmittelbare Inhibition der NO-Synthese mit dem L-Arginin-Analogon Nw-Nitro-L-Arginin-Methyl-Ester (L-NAME) induziert eine zeit- und dosis-abhängige arterielle Hypertension (Zatz und Baylis, 1998). Zudem korreliert der Grad der NO-Synthese-Inhibition mit dem Ausmaß und dem Pathomechanismus des Bluthochdruckes. Untersuchungen mit Wistar Ratten haben ergeben, daß eine leichte Inhibition der NO-Synthese eine rein volumenabhängige Hypertension verursacht, während eine hochgradige, fast vollständige Blockierung der NO-Synthese eine renale und systemische Vasokonstriktion hervorruft, die unabhängig von der Salzzufuhr war (Alvarez et al., 2000). Bei in vitro -Versuchen an Aortenringen von Ratten wurde eine Inhibition der Induktion der NO-Synthase und ihre Konsequenzen durch Dexamethason beobachtet (Rees et al., 1990). In vivo - Untersuchungen bei Personen, die mit 80 mg Cortisol/d über den Zeitraum von 5 Tagen behandelt wurden, haben eine signifikante Erhöhung des arteriellen Blutdruckes und eine Verminderung der Plasma Nitrat/Nitrit-Konzentration ergeben (Kelly et al., 1998 b). Versuche mit männlichen Wistar-Kyoto Ratten, denen über einen Zeitraum von 15 Tagen 0,3 mg/kg KG/d Dexamethason per os verabreicht wurde, zeigten eine signifikante Reduktion der NOS III mRNA Expression in der Leber und der Aorta nach bereits 3 Tagen Behandlungsdauer auf 40 % (Leber) bzw. 60 % (Aorta) im Vergleich zu unbehandelten Kontrolltieren. Im Vergleich dazu lag die NOS III mRNA Expression in der Niere der mit Dexamethason behandelten Tiere nach neun Tagen immer noch bei 90 % gegenüber den Kontrolltieren. Sowohl die Konzentrationen von Natrium als auch von Kalium blieben konstant, während die Plasmakonzentrationen von Nitrat/Nitrit auf 40 % gegenüber den Werten der Kontrolltiere abfielen (Wallerath et al. 1999). Andere Versuche mit Deoxycorticosteronacetat behandelten hypertensiven Ratten zeigten sogar eine vermehrte Expression der endothelialen NO-Synthase in den Nieren dieser Tiere (Allcock et al., 1999).
Struktur und Funktion kleiner Arterien
Die Funktion präkapillärer Arteriolen besteht in der Verteilung des Blutes und zwar so, daß jede Kapillare mit Blut in adäquater Menge und dem richtigen Druck versorgt wird. Um diese Rolle erfüllen zu können, hat das kardiovaskuläre System die Möglichkeit, den Widerstand jedes einzelnen Gefäßes durch Veränderung seines Lumendurchmessers zu ändern. Der Lumendurchmesser wird dabei durch den Tonus der glattmuskulären Zellen der Gefäßwand bestimmt. Diejenigen Gefäße, die am meisten zu dem präkapillären Druckabfall beitragen sind die präkapillären Arteriolen. Anatomisch sind sie dadurch charakterisiert, daß sie nicht mehr als eine komplette Schicht glattmuskulärer Zellen in ihrer Gefäßwand besitzen (Mulvany und Aalkjaer, 1990). Diese Gefäße haben einen Durchmesser von < 30-50 µm. Mehr als 50 % des Druckabfalls findet in Arteriolen statt, die einen Durchmesser kleiner als 100 µm besitzen (Mulvany und Aalkjaer, 1990). Als Endorgan des peripheren Widerstandes spielen die Resistenzarteriolen eine besondere Rolle. Abbildung 1-1 zeigt die Druckverhältnisse im peripheren Blutkreislauf.
Histologisch bestehen Resistenzarteriolen generell wie andere arteriellen Gefäße aus einer Intima, einer Media und einer Adventitia. Abbildung 1-2 (Seite 6) zeigt schematisch die Endstrombahn, Präkapilläre Resistenzarteriolen mit glatten Muskelzellen, Kapillaren und postkapillären Venolen. Im histologischen Schnitt ist ein Querschnitt einer Resistenzarteriole mit ihren Wandschichten zu sehen. Man beachte dabei die Schicht glattmuskulärer Zellen in der Media.
Abb. 1-1: Druckverhältnisse im peripheren Blutkreislauf
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
aus: Ganoung, W.F., 1971, Medizinische Physiologie, Springer Verlag
Intima
Die Intima besteht aus Endothelzellen. Sie besitzen eine squamöse Struktur, sind ca. 2 µm dick, 10-20 µm breit und 30-50 µm lang (Carlson et al., 1982) mit spitz zulaufenden Enden und in ihrer langen Achse parallel zur Blutflussrichtung ausgerichtet. Eine Besonderheit bei den Endothelzellen kleiner Arteriolen in Bezug auf die Fähigkeit zur Vasorelaxation und Vasokonstriktion ist ihr Kontakt zu glattmuskulären Zellen der Media (Rhodin, 1980).
Media
Die Media kleiner Arterien besteht zu 70-85 Vol. % aus glatten Muskelzellen (Lee et al., 1983 a). Die Anzahl der glattmuskulären Muskelzellschichten nimmt mit abnehmenden Durchmesser ab. Während in Arteriolen mit einem Durchmesser über 300 µm noch durchschnittlich sechs Muskelzellschichten vorhanden sind, besitzen Arteriolen mit einem Durchmesser von 30 – 50 µm nur noch eine einzelne glattmuskuläre Zellschicht. (Lee et al., 1983 b). Die Muskelzellen sind mechanisch hauptsächlich über Membrankontakt miteinander verbunden, mit einigen wenigen dazwischengelagerten Kollagenfibrillen. Diese Art der Architektur wurde als elektrisches Synzytium bezeichnet (Mulvany und Aalkjaer, 1990).
Adventita
Wie auch in größeren Arterien besteht die Adventitia hauptsächlich aus Bindegewebe (Elastin und Kollagen), Fibroblasten, Mastzellen, Makrophagen und gelegentlich Schwannschen Zellen, (Lee et al., 1983 a; Rhodin, 1980). Die Dicke der Adventitia im Verhältnis zur Gesamtdicke der Wand variiert. Sie ist in den kleinen Zerebralarterien sehr dünn und kann in anderen Regionen bis zur Hälfte der gesamten Wanddicke ausmachen (Rhodin, 1980).
Abbildung 1-2: Histologischer Schnitt von Resistenzarteriolen
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Die Rolle von NO
NO: Biochemie und Physiologie
Stickstoffmonoxid (Nitric-Oxide = NO) ist ein farbloses Gas, welches ein unpaares Elektron besitzt, das über dem Stickstoff und dem Sauerstoffatom delokalisiert ist. Es wird aus der Aminosäure L-Arginin durch drei Isoformen der NO-Synthase synthetisiert. Bei dieser Synthese entsteht als Nebenprodukt die Aminosäure L-Citrullin. Es gibt eine neuronale (NOS I), eine induzierbare (NOS II) und eine endotheliale (NOS III) NO-Synthase (Förstermann et al., 1994, Soubrier, 1999). NO ist ein freies Radikal und wurde als ein Biomolekül mit wichtigen physiologischen Funktionen identifiziert. Als freies Radikal reagiert es in biologischen Flüssigkeiten rasch (innerhalb von 20-40 Sekunden) mit Sauerstoff und Wasser zu einem Nitrit/Nitratgemisch (NO2-/NO3-), oder innerhalb von Sekundenbruchteilen durch Oxidation durch das Superoxid-Anion ·O2- zu Peroxynitrit (ONO2-), welches durch intramolekulare Umlagerung zu NO3- umgewandelt wird. Diese beiden Wege bedeuten gleichzeitig die Inaktivierung des NO-Moleküles, da die Produkte NO2-/NO3- 1000-fach weniger biologisch wirksam sind (Moncada und Higgs, 1991). Endotheliales NO ist ein wichtiger physiologischer Vasodilatator und Inhibitor der Plättchenaggregation und ‑adhäsion (Grisham et al., 1998). Zudem kann es durch eine Herabregulierung des Leukozytenadhäsionsglykoproteinkomplexes CD11/CD18 eine Leukozytenadhäsion an das Endothel verringern (Kubes et al., 1991). Eine weitere Wirkung ist die Inhibition der Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen (Förstermann et al., 1994). Endothelial gebildetes NO repräsentiert somit ein wichtiges anti-atherogenes Prinzip (Li und Förstermann, 2000; Bolli, 2001). Eine vermehrte oder verminderte Synthese von endothelialem NO könnte somit wichtige Konsequenzen für die vaskuläre Homöostase haben. Neben Funktionen in der Homöostase des kardiovasculären und des Zentralnervensystems ist NO auch ein Modulator des Immunsystems. NO wurde als cytotoxischer Faktor muriner Makrophagern und anderer immunologischer Zellen beschrieben (Moncada und Higgs, 1991; Stuehr und Marletta, 1985; Hibbs et al., 1987).
Neben vegetativen, humoralen und physikalischen Faktoren (wie z.B. Parasympathikotonus, Prostaglandine, Scherkräfte und Temperatur) ist die Freisetzung von NO aus den Endothelzellen der präkapillären Arteriolen ein essentieller Parameter der Gefäßweitenregulierung und hat somit direkten Einfluss auf Blutdruckregulierung und Gewebsperfusion (Pohl, 1991). Es ist bekannt, daß Acetylcholin (ACh), Bradykinin und Adenosintriphosphat neben anderen Stimuli Blutgefäße über einen endothelabhängigen Mechanismus dilatieren. Furchgott und Mitarbeiter zeigten in ihren Versuchen, daß intakte Endothelzellen eine obligatorische Rolle für die Relaxation der glatten Gefäßmuskelzellen von Kaninchenaorten durch Acetylcholin spielen. Bei ihren Versuchen präparierten sie Aortenringe der descendierenden Aorta thoracica und legten sie in ein Krebs-Bicarbonat-Lösung. Sie fügten Acetylcholin in aufsteigender Konzentration hinzu und beobachteten dabei eine konzentrationsabhängige Vasorelaxation, die in höheren Konzentrationen in eine Vasokonstriktion überging. Sie entfernten anschließend die Endothelschicht der Aortenringe und wiederholten die Versuche nach einer gewissen Equilibrationszeit. Dabei konnten sie keine Dilatation der Aortenringe beobachten. Nachdem sie einen zweiten Aortenring mit noch intakter Endothelschicht zu dem Aortenring ohne Endothelschicht hinzufügten, stellte sich die zuerst beobachtete Vasorelaxation an beiden Aortenringen ein (Furchgott und Zawadzki, 1980; Furchgott, 1984). Diese Untersuchungen hatten gezeigt, daß für die Vasorelaxation ein Mediator verantwortlich sein muß, der 1. aus den Endothelzellen stammt und 2.diffusabel ist. Dieser Mediator wurde zunächst als EDRF, „Endothelium derived relaxing factor“ beschrieben und später als Stickstoffmonoxid identifiziert.
Da NO sowohl Blutgefäße relaxiert, als auch die Thrombozytenaggregration und ‑adhäsion (Radomski und Moncada, 1991) sowie die Leukozytenaktivität hemmt (Kubes et al., 1991) und die Proliferation glatter Gefäßmuskelzellen (Garg und Hassid, 1989; Jeremy et al., 1999) und Typ I Kollagen hemmt (Chatziantoniou et al., 1998), wird NO als wichtiger protektiver Faktor im Herz-Kreislauf-Gefäßsystem angesehen (Conner und Grisham, 1995). Eine Verminderung der NO-Produktion wird bei der Pathogenese vaskulärer Dysfunktionen, die mit Hypertension, Diabetes mellitus und Hypercholesterinämie assoziiert sind, diskutiert (Li und Förstermann, 2000). Eine verminderte endotheliale NO-Pruduktion und eine vermehrte Inaktivierung durch Sauerstoffradikale wurde in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben und mit der essentiellen Hypertonie in Zusammenhang gebracht (Vallance et al., 1989, Linder et al., 1990, Panza et al., 1990, Huang et al., 1995, Taddei et al., 1999). In Untersuchungen wurde gezeigt, daß die Gabe der Aminosäure L-Arginin, aus der NO gebildet wird, bei Menschen den systolischen und diastolischen Blutdruck senkt und vor Hochdruck bei hierfür susceptiblen Ratten schützt (Conner und Grisham, 1995; Li et al., 1997; Susic et al., 2001; ). Selbst bei Menschen mit essentieller und sekundärer Hypertonie senkte die Gabe von L‑Arginin den erhöhten Blutdruck (Nakaki et al., 1990; Petros et al., 1991). Die Indikatoren für eine vermehrte NO-Produktion wie Nitrat/Nitrit-Ausscheidung im Urin, cGMP- und L-Citrullin-Konzentration im Plasma waren gleichzeitig erhöht (Hishikawa et al. 1993).
Zusammenfassend läßt sich also feststellen, daß für eine physiologische Blutdruckregulierung eine intakte Endothelzellschicht vorhanden sein muß, über die eine durch NO‑Synthese vermittelte, endothel-abhängige Gefäßweitenregulierung ermöglicht wird. Zudem kann durch L-Arginingabe – als Substrat der NO-Synthese - eine bestehende Hypertension durch vermehrte NO-Produktion gebessert werden.
Wirkung von NO auf die Gefäßweitenregulierung
Seit über 100 Jahren ist bekannt, daß organische Nitrate und Nitrite die Symptome der koronaren Herzkrankheit bessern. Die erste bekannte Verbindung deren Wirkung therapeutisch genutzt wurde war Amylnitrit; eine Flüssigkeit, die inhaliert und über die Lungen resorbiert wurde. Die Wirkung trat innerhalb von 30 Sekunden ein, hielt aber auch nur wenige Minuten an. Die Verwendung dieser Substanz ist heute obsolet. Alfred Nobel (1833-1896), der Mitte des 19. Jahrhunderts Glyceroltrinitrat als wirksamen Bestandteils des Dynamits entdeckte, litt selbst unter Angina pectoris und nahm zur Besserung der Beschwerden Glyceroltrinitrat. Glyceroltrinitrat ist auch unter der chemisch inkorrekten Bezeichnung Nitroglycerin bekannt geworden (Förstermann, 1996).
Diese Stoffe sind deshalb wirksam in der Behandlung der koronaren Herzkrankheit, weil sie durch die Freisetzung von NO die durch atherosklerosierte Plaques verengten Herzkranzgefäße rasch erweitern und somit zu einer besseren Perfusion und Sauerstoffversorgung des Myokards führen. Aus diesem Grund werden solche Stoffe, die NO freisetzen und somit zu einer Vasodilatation führen, als NO-Donatoren bezeichnet. Die Freisetzung von NO kann in der glatten Muskulatur der Gefäßwand durch enzymatische Metabolisierung geschehen, wie es bei den organischen Nitraten und Nitriten der Fall ist. Andere Substanzen, wie Molsidomin und Nitruprussid-Natrium, setzen auf einem nicht-enzymatischem Weg NO frei.
NO, welches in den Endothelzellen sowohl arterieller als auch venöser Gefäße durch die endotheliale NO-Synthase (eNOS) gebildet wird, diffundiert in die glatten Muskelzellen der Gefäßwand und bindet dort an eine Häm-Gruppe der löslichen Guanylatcyclase. Diese bildet aus GPT den second messenger cGMP. Dieser second messenger aktiviert wiederum die cGMP-abhängige Proteinkinase G (PKG), die über Phosphorylierung spezifischer Proteine letztendlich zu einer Erniedrigung der intrazellulären Ca2+-Konzentration führt und so eine Relaxation der Muskelzelle bewirkt (Rapaport und Murad, 1983; Waldman und Murad, 1988). Die eNOS, die durch Acetylcholin stimulierbar ist, steht somit am Anfang der Kaskade, die über einen Endothel-abhängigen Mechanismus (nämlich die Bildung von NO aus L‑Arginin) zu einer Relaxation der glatten Muskulatur und somit zu einer Dilatation des Gefäßes führt.
Die beiden nicht-enzymatischen NO-Donatoren Molsidomin und Nitruprussid‑Natrium setzen NO frei ohne dazu eine NO-Synthase oder L-Arginin zu benötigen. Dabei diffundiert freies NO zu der glattmuskulären Zelle der Gefäßwand und wirkt dort wie oben beschrieben auf die lösliche Guanylat‑Cyclase. Bei dieser Endothel-unabhängigen Vasorelaxation wird also der erste Schritt, nämlich die Bildung von NO in der Endothelzelle durch die eNOS, umgangen.
Abbildung 1-3 zeigt das Prinzip endothel-abhängiger und endothel-unabhängiger Vasorelaxation, wobei als Beispiel für einen NOS-unabhängigen NO-Donor
S-Nitroso- N -Acetyl-D,L-Penicillamin (SNAP) angegeben ist.
Abbildung 1-3: Endothel-abhängige und endothel-unabhängige Vasorelaxation
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Die NO-Synthasen
NO wird im Körper durch das Enzym NO-Synthase (NOS) gebildet, von dem drei Isoformen existieren. NOS I wurde als erstes im Kleinhirn von Ratten und Schweinen entdeckt; später wurden Splicevarianten auch in vielen verschiedenen anderen Zellen und Geweben festgestellt (Mayer et al., 1990; Schmidt et al., 1991; Bredt und Snyder, 1990). NOS II wurde in Mäusemakrophagen identifiziert, kann aber auch in verschieden anderen Zellen induziert werden. NOS III wird hauptsächlich in Endothelzellen expremiert (Förstermann et al., 1998). NOS I und NOS III sind konstitutive Enzyme und da sie hauptsächlich in Neuronen (NOS I) bzw. in Endothelzellen (NOS III) gefunden werden, sind sie auch unter den Bezeichnungen ncNOS oder nNOS für NOS I und ecNOS oder eNOS für NOS III bekannt. NOS II ist ein in vielen verschieden Zellen induzierbares Enzym und wird deshalb auch als iNOS bezeichnet.
Die für die Gefäßweitenregulierung relevante Isoform der NO-Synthase ist die NOS III (eNOS), die in Endothelzellen von sowohl venösen als auch arteriellen Gefäßen zu finden ist (Pollock et al., 1993). Die Expression der NOS III wird durch verschieden Faktoren beeinflusst, die zu einer vermehrten bzw. verminderten Bildung dieses Enzyms führen. Zu diesen Faktoren zählen Wandscherkräfte, Sauerstoffspannung und Hypoxie, Zytokine und bakterielle Lipopolysaccharide, Östrogene (und andere Sexualhormone), Wachstumsfaktoren, oxidierte low-density Lipoproteine (oxLDL) u.a. (Förstermann et al., 1998). Xiao et al. zeigten, daß Wandscherkräfte zu einer vermehrten Expression der NOS III mRNA führten, die unter anderem durch Dexamethason nicht inhibierbar ist (Xiao et al., 1997). Ohne auf die Vielzahl von in vitro - und in vivo -Versuchen im Detail einzugehen läßt sich zusammenfassend sagen, daß die Expression der NOS III vielen Einflüssen unterliegt, die in ihrer Gesamtheit ein multifaktorielles Geschehen darstellen, welches zur Zeit unvollständig untersucht und verstanden ist. Die molekularen Mechanismen, die letztendlich der Kontrolle der NO-Produktion dienen, spielen sich auf vielen verschieden Ebenen ab: auf zellulärer Ebene kann die Transkriptionsrate der Gene, die Stabilität des Transkriptionsproduktes, sowie die Translation modifiziert werden. Die NO-Synthese unterliegt zudem extrazellulären Faktoren, wie zum Beispiel der Oxygenierung des Gewebes, dem Substratangebot oder direkten und indirekten toxischen Einflüssen.
Die endotheliale NO-Synthese
NO wird in der Endothelzelle durch die NOS III aus der Aminosäure L-Arginin synthetisiert (Palmer et al., 1988). NOS III ist dabei Ca2+-, Calmodulin- und NADPH-abhängig. Das andere stabile Endprodukt dieser Reaktion ist die Aminosäure L-Citrullin. Der erste Schritt in der NO-Synthese ist die NADPH-abhängige Hydroxilierung der Guanidinogruppe, wodurch enzymgebundenes NG ‑Hydroxy-L-Arginin entsteht. Für diesen Schritt ist zudem Tetrahydrobiopterin als Kofaktor beschrieben (Tayeh und Marletta, 1989). Der zweite Schritt, die Konversion zu L-Citrullin, ist ebenfalls NADPH-abhängig, und ähnlich der Cytochrom P 450 Aromatase Reaktion. NOS III benötigt weiterhin zwei Oxidantien, nämlich [FeO]3+ für die Konversion von L-Arginin zu NG -Hydroxy-L-Arginin und [FeOO]+ für die Konversion von NG -Hydroxy-L-Arginin zu L-Citrullin. Der Ureido-Sauerstoff und das Sauerstoffmolekül des NO kommen aus dem in der Reaktion benötigtem O2, das Stickstoffmolekül des NO stammt von NG -Hydroxy-L-Arginin (Conner und Grisham, 1995).
Das methylierte L-Arginin-Analogon NG -Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA) ist ein potenter Inhibitor der NO-Synthese und spielte eine wichtige Rolle in der Untersuchung der physiologischen Relevanz von NO (Moncada, 1992). In vitro ist es ein potenter Vasokonstriktor. Diese Vasokonstriktion ist endothelabhängig und resultiert aus der Inhibition der endogenen, durch Acetylcholin induzierten NO-Synthese (Moncada und Higgs, 1991; Moncada und Higgs, 1993).
Problemstellung - Ziel der Untersuchung
Grundlage dieser Arbeit ist die Veröffentlichung von Wallerath und Mitarbeiter, die in ihren Untersuchungen an Ratten den Einfluß von Dexamthason auf die NOS III mRNA in vitro und ex vivo untersuchten. Dabei stellten sie eine quantitativ unterschiedliche Supprimierung der mRNA sowie des Proteins in verschieden Organen fest (Wallerath et al., 1999). In der vorliegenden Studie sollte nun der Einfluß von Dexamethason auf die Gefäßweitenregulierung unter in vivo Bedingungen an einem intakten Tierorganismus untersucht werden. Dabei diente das Rückenhautkammermodell der Maus als Modell (Lehr et al., 1993), mit dem es möglich war, die Zusammenhänge zwischen Dexamethasongabe und Suppremierung der NOS III-Synthese in vivo an wachen, nicht anästhesierten Tieren zu untersuchen. Dies hatte den großen Vorteil, daß keine störenden Einflüsse von Anästhetika auf den Gefäßtonus und die Gefäßweitenregulierung vorhanden waren (Gerkens, 1987; Maruyama et al., 1995; Kirstetter et al., 1997; De Witt et al., 1999; Ishida et al., 1999; Horibe et al., 2000). Durch die lange postoperative Erholungsdauer von sieben Tagen und die strengen Ausschlußkriterien waren zudem Einflüsse durch das operative Trauma und Entzündung ausgeschlossen. Das Rückenhautkammergewebe mit den dies versorgenden Gefäßen wurde dabei nicht-pulsatil superfundiert. Das Superfusat wurde laut Protokoll mithilfe einer exakt adjustierbaren Multikanal-Rollerpumpe (Reglo Analog MS-4/6, Ismatek, Schweiz) mit Acetylcholin (ACh), S-Nitroso- N -Acetyl-D,L-Penicillamin (SNAP) und NG -Nitro-L-Arginin-Methylester (L‑NAME) in bestimmten Konzentrationen versetzt. Die Gefäße wurden vor und nach Zugabe der einzelnen Substanzen auf Video aufgenommen und per Computer ausgewertet (Brunner et al., 2000).
Ziel der Untersuchung war es, den Einfluß von Dexamethason auf die endothel‑abhängige Vasodilatation der für die Bluddruckregulation relevanten präkapillären Arteriolen in vivo zu untersuchen. Klassischerweise wurde als Stimulus für die endothel-abhängige Vasodilatation ACh verwandt (Furchgott, 1980). Als Refernzwert galt die endothel-unabhängige Vasodilatation durch SNAP. Um das Ausmaß der endothelabhängigen NO-Synthese durch ACh zu bestimmen, wurde L-NAME in einer Konzentration von 30 µmol superfundiert und somit die NO‑Synthese blockiert (weitere Details siehe Kapitel „Material und Methode“).
Material und Methode
Versuchstiere und Versuchstierhaltung
In die Versuchsreihe (genehmigt durch die Bezirksregierung Rheinhessen-Pfalz am 15.09.1997; Aktenzeichen: 177-07/971-6) wurden 6-10 Wochen alte C57/Bl 6J Mäuse mit einem Gewicht von 28-32 g aufgenommen. Während jüngere und leichtere Tiere aufgrund ihrer zu geringen Körpergröße für eine Rückenhautkammerimplantation nicht in Betracht kamen, zeigte sich bei älteren und schwereren Mäusen eine bindegewebige Veränderung des Rückenhautgewebes, die sowohl die Präperation als auch die spätere Superfusion negativ beinflussten. Die Mäuse wurden bei einer Umgebungstemperatur von 22° C und einer Luftfeuchtigkeit von ca. 60 % in Gruppen von n = 5-10 pro Käfig im Tierstall in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Rhythmus gehalten. Nach der Rückenhautkammerimplantation erfolgte die Haltung in Einzelkäfigen. Sie erhielten Standardlaborfutter (Altromin, Lage) und Wasser ad libitum. Je nach Versuchsgruppe wurde eine bestimmte Menge an Dexamethason (Fortecortin Mono 100, Merck, Darmstadt) bzw. L-Arginin (Sigma) dem Trinkwasser zugefügt, wobei die Trinkwasserflaschen mit Aluminiumfolie umwickelt vor direktem Lichteinfall geschützt wurden (Tab.1).
Aus zuvor durchgeführten Beobachtungen (Pilotversuchen) ergab sich eine durchschnittliche Trinkmenge von 5 ml pro Tag für eine 30 g schwere Maus. Davon abgeleitet wurden die Trinklösungen für die einzelnen Versuchsgruppen angesetzt (Wallerath et al.1999). Die L-Arginindosis wurde nach Briones modifiziert (Briones et al.1999).
Tabelle 1: Fütterungsplan der einzelnen Versuchsgruppen
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Untersuchungsmaterial und chirurgische Eingriffe
Das Rückenhautkammermodell an der Maus
Die Endothel-abhängige Vasodilatation in vitro wurde bislang stets an isolierten Blutgefäßen demonstriert, die entweder in einem Bad mit artifizieller physiologischer Lösung lagen oder mit einer solchen Lösung superfundiert wurden (Furchgott, 1984; Spokas und Folco, 1984). Der Effekt von ACh auf die Vasorelaxation wurde auch in vivo gezeigt, allerdings an großen Konduktanzgefäßen wie z.B. der Femoralarterie. Zudem waren die Tiere bei diesen früheren Untersuchungen stets anästhesiert (Angus et al., 1983; Pohl et al., 1986).
In dem hier beschriebenen Modell werden im Gegensatz dazu Resistenzarteriolen mit einem äußeren Durchmesser von 20-70 µm untersucht. Der große Vorteil dieses Modells besteht darin, daß die Tiere bei den Versuchen nicht anästhesiert waren, das Gefäß an seiner physiologischen Stelle verblieb und es durch den Kreislauf der Maus perfundiert wurde. Durch die Zeitraum von 7 Tagen zwischen der Implantation der Rückenhautkammer und den Versuchen war eine ausreichend lange Zeit gegeben, in der sich das Gewebe von dem Operationstrauma erholen konnte. Mäuse mit Rückenhautkammern, die makroskopisch wie mikroskopisch Entzündungszeichen boten, wurden umgehend aus dem Versuch ausgeschlossen. Makroskopisch durften weder Eiter, Ödem, Einblutungen oder petechiale Blutungen zu sehen sein (Sewell, 1966; Zweifach, 1973). Auch durften weder traumainduzierte Neovaskularisation, noch geschlängelte oder dilatierte Gefäße auftreten. Mikroskopisch führten Stase oder exzessive Steigerung des Blutflusses, Ödembildung, zunehmende Vasodilatation, erhöhte Vasomotion und Adhäsion von Leukozyten an den Gefäßwänden zu einem Versuchsaussschluß (Zweifach, 1973). Ferner durften die Tiere keine Gewichtsabnahme, aggressives Verhalten noch apathische Stimmungsveränderungen zeigen. Ausschließlich Tiere, die den Ansprüchen einer intakten Mikrozirkulation gerecht wurden und keine der aufgeführten Ausschlusskriterien boten wurden in eine Versuchsreihe aufgenommen. Von insgesamt n = 74 präparierten Tieren wurden nach strenger Anwendung der beschriebenen Kriterien insgesamt n = 49 Tiere in die Versuche der hier vorliegenden Arbeit aufgenommen.
Chirurgische Eingriffe
Vorbereitungen
Das für die Kammerimplantation benötigte Instrumentarium sowie die einzelnen Teile der Kammer wurden zuvor heißluftsterilisiert. Die Implantation der Kammer erfolgte weitestgehend unter aseptischen Kautelen. Die Implantation der Titankammern erfolgte in Analogie zu dem veröffentlichten Protokoll (Lehr et al., 1993). Einer der Rahmen wurde mit drei Schrauben und dazugehörigen Distanzmuttern versehen. In den optischen Ausschnitt des anderen Rahmens kam ein Deckglas von 0,1 mm Dicke und 11,8 mm Durchmesser (Schmidt Laborhandel, Bechofen) in einem vertieften Rand zu liegen, welches mit einem entsprechenden Sprengring fixiert wurde. Die Tiere wurden mit einer intraperitonealen Injektion von 0,1 ml 0,9 % NaCl‑Lösung, welche 3,75 mg Ketaminhydrochlorid (Ketavet, Pharmacia&Upjohn, Erlangen) und 0,5 mg Xylazinhydrochlorid (Rompun 2 %, Bayervital, Leverkusen) enthielt anästhesiert (Lehr et al., 1993). Dann wurde die Rückenhaut durch Elektrorasur (Laube, Cordless pro, USA) und anschließende chemische Depilation (Pilca Med, Olivia, Hamburg) enthaart. Nach ca. 5-minütiger Einwirkzeit wurde die Enthaarungscreme mit weichen, feuchten Tüchern sanft aber gründlich entfernt.
Abbildung 3-1 zeigt eine zur Kammerimplantation vorbereitete Maus.
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