Einfluß von Dexamethason auf die Vasodilatation von Resistenzarteriolen in quergestreifter Muskulatur - eine intravitalmikroskopische Studie am Rückenhautkammermodell in der C57Bl Maus

4

Inhaltsverzeichnis

  Einleitung  8

  Zusammenhang zwischen systemischer Glucocorticoidgabe  

  und Hypertension  8

  Struktur und Funktion kleiner Arterien  9

Intima   11

  Media  11

  Adventitia  11

  Die Rolle von NO  12

  NO: Biochemie und Physiologie  12

  Wirkung von NO auf die Gefäßweitenregulierung  15

  Die NO-Synthasen  16

  Die endotheliale NO-Synthese  17

  Problemstellung - Ziel der Untersuchung  18

  Material und Methode  19

Versuchstiere  und Versuchstierhaltung  19

  Untersuchungsmaterial und chirurgische Eingriffe  20

  Das Rückenhautkammermodell an der Maus  20

  Chirurgische Eingriffe  21

Vorbereitungen   21

Implantation  der Rückenhautkammer  22

  Geräte und Untersuchungstechnik  25

  Postoperative Kontrolle  25

5

Versuchsdurchführung 31

Versuchsdesign 33 Datenauswertung 35

Ergebnisse 36

Vasorelaxation bei Dexamethason-behandelten Mäusen 36

Vasorelaxation bei L-Arginin-behandelten Mäusen 36

Anteil der NO-vermittelten Vasodilatation

bei ACh-Stimulierung 39

Konzentrationsabhängige endotheliale Vasorelaxation 39

Diskussion 42

Die Validität des Rückenhautkammermodells an der Maus 42

Anforderungen eines Tiermodells zur Untersuchung der

Mikrozirkulation

Validität der Superfusion

6

Bedeutung der Intravitalmikroskopie zur Untersuchung der Funktion kleiner Gefäße 43

Einfluß hämodynamischer Parameter 44

Pathophysiologische Hypothesen zur Wirkung von Dexamethason auf die endothel-abhängige Vasorelaxation 45

Einfluß von L-Arginin auf die Verbesserung der durch Dexamethason gestörten endothel-abhängigen Vasorelaxation 48

Einfluß anderer vasodilatatorischer Mechanismen 49

Klinische Bedeutung 50

Zusammenfassung 51

Literaturverzeichnis 53 Danksagung 70 Lebenslauf 71

7

Abkürzungsverzeichnis

ACh Acetylcholin cGMP cyclic Guanosinmonophosphat EDHF Endothelium-derived hyperpolarzation factor EDRF Endothelium-derived relaxing factor GPT Glutamat-Pyruvat-Transaminase N G -Monomethyl-L-Arginin L-NMMA

N G -Nitro-L-Arginin-Methylester L-NAME mRNA messenger ribo-nucleic acid NADPH reduziertes Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid NO Nitric Oxide (Stickstoffmonoxyd) NOSI (nNOS, ncNOS) neuronale NO-Synthase NOS II (iNOS) induzierbare NO-Synthase NOS III (eNOS, ecNOS) endotheliale NO-Synthase

^- NO 2 Nitrit

^- NO 3 Nitrat ⁻ ONO 2 Peroxynitrit oxLDL low-density Lipoproteine PKG Proteinkinase G SNAP S-Nitroso-N-Acetyl-D,L-Penicillamin

8

Einleitung

Kardiovaskuläre Erkrankungen stehen in der Todesursachenstatistik der westlichen Welt nach wie vor an erster Stelle. In Europa und den USA sterben jährlich mehr Menschen an den Folgen dieser Erkrankungen als an infektiösen und neoplastischen Erkrankungen zusammen. Neben den Risikofaktoren Zigarettenrauch, männliches Geschlecht, Hyperlipoproteinämie, Diabetes mellitus und Adipositas spielt die arterielle Hypertension eine wichtige Rolle in der Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen (Fried et al., 1998; Lowe et al., 1998; Menotti et al., 2001).

Im klinischen Alltag wird häufig eine Blutdruckerhöhung bei systemischer Glucocorticoidgabe beobachtet. Glucocorticoide finden einen breiten Einsatz bei vielen verschieden Erkrankungen wie z.B.: rheumatische Erkrankungen, Kollagenosen, Nierenerkrankungen, Allergien, Lungenerkrankungen (insbesondere Asthma), Tumoren, gastrointestinalen Erkrankungen (M. Crohn und Colitis ulcerosa), endokrinen, neurologischen, dermatologischen, ophthalmologischen Erkrankungen und nicht zuletzt bei Transplantationen zur Bekämpfung der Abstoßungsreaktion (Hricik et al., 1994). Aus diesem Grund ist der Zusammenhang zwischen systemischer Glucocorticoidgabe und Hypertension Thema zahlreicher klinischer und experimenteller Untersuchungen (Saruta, 1996; Whitworth et al.; 1997; Garbe et al., 1997).

Zusammenhang zwischen systemischer Glucocorticoidgabe und Hypertension

Arterielle Hypertension mit ihren Folgeerscheinungen wie vermehrte Arteriosklerose, Schlaganfall, Hirnblutung, hypertensive Kardiomyopathien und Myokardinfarkt ist eine wesentliche Nebenwirkung systemischer Glucocorticoidgabe. Erhöhter Blutdruck ist sowohl beim Menschen (Lund-Johansen, 1983; Raison et al., 1988) als auch bei spontan hypertensiven Ratten (Smith und Hutchins, 1979) mit einem erhöhten peripheren Widerstand verbunden. Der Zusammenhang zwischen Glucocorticoiden und Bluthochdruck ist jedoch immer noch sehr wenig untersucht (Wallerath et al., 1999). Sowohl die Natriumretention als auch eine Erhöhung des Sympathikotonus spielen nur eine untergeordnete Rolle bei der Entstehung des corticoidinduzierten Hypertonus. Viel wichtiger hingegen scheint eine Supprimierung des NO-Systems zu sein (Kelly et al., 1998 a). Eine unmittelbare Inhibition

9

der NO-Synthese mit dem L-Arginin-Analogon N ^ω -Nitro-L-Arginin-Methyl-Ester (L-NAME)

induziert eine zeit- und dosis-abhängige arterielle Hypertension (Zatz und Baylis, 1998). Zudem korreliert der Grad der NO-Synthese-Inhibition mit dem Ausmaß und dem Pathomechanismus des Bluthochdruckes. Untersuchungen mit Wistar Ratten haben ergeben, daß eine leichte Inhibition der NO-Synthese eine rein volumenabhängige Hypertension verursacht, während eine hochgradige, fast vollständige Blockierung der NO-Synthese eine renale und systemische Vasokonstriktion hervorruft, die unabhängig von der Salzzufuhr war (Alvarez et al., 2000). Bei in vitro-Versuchen an Aortenringen von Ratten wurde eine Inhibition der Induktion der NO-Synthase und ihre Konsequenzen durch Dexamethason beobachtet (Rees et al., 1990). In vivo- Untersuchungen bei Personen, die mit 80 mg Cortisol/d über den Zeitraum von 5 Tagen behandelt wurden, haben eine signifikante Erhöhung des arteriellen Blutdruckes und eine Verminderung der Plasma Nitrat/Nitrit-Konzentration ergeben (Kelly et al., 1998 b). Versuche mit männlichen Wistar-Kyoto Ratten, denen über einen Zeitraum von 15 Tagen 0,3 mg/kg KG/d Dexamethason per os verabreicht wurde, zeigten eine signifikante Reduktion der NOS III mRNA Expression in der Leber und der Aorta nach bereits 3 Tagen Behandlungsdauer auf 40 % (Leber) bzw. 60 % (Aorta) im Vergleich zu unbehandelten Kontrolltieren. Im Vergleich dazu lag die NOS III mRNA Expression in der Niere der mit Dexamethason behandelten Tiere nach neun Tagen immer noch bei 90 % gegenüber den Kontrolltieren. Sowohl die Konzentrationen von Natrium als auch von Kalium blieben konstant, während die Plasmakonzentrationen von Nitrat/Nitrit auf 40 % gegenüber den Werten der Kontrolltiere abfielen (Wallerath et al. 1999). Andere Versuche mit Deoxycorticosteronacetat behandelten hypertensiven Ratten zeigten sogar eine vermehrte Expression der endothelialen NO-Synthase in den Nieren dieser Tiere (Allcock et al., 1999).

Struktur und Funktion kleiner Arterien

Die Funktion präkapillärer Arteriolen besteht in der Verteilung des Blutes und zwar so, daß jede Kapillare mit Blut in adäquater Menge und dem richtigen Druck versorgt wird. Um diese Rolle erfüllen zu können, hat das kardiovaskuläre System die Möglichkeit, den Widerstand jedes einzelnen Gefäßes durch Veränderung seines Lumendurchmessers zu ändern. Der Lumendurchmesser wird dabei durch den Tonus der glattmuskulären Zellen der Gefäßwand bestimmt. Diejenigen Gefäße, die am meisten zu dem präkapillären Druckabfall beitragen

10

sind die präkapillären Arteriolen. Anatomisch sind sie dadurch charakterisiert, daß sie nicht mehr als eine komplette Schicht glattmuskulärer Zellen in ihrer Gefäßwand besitzen (Mulvany und Aalkjaer, 1990). Diese Gefäße haben einen Durchmesser von < 30-50 µm. Mehr als 50 % des Druckabfalls findet in Arteriolen statt, die einen Durchmesser kleiner als 100 µm besitzen (Mulvany und Aalkjaer, 1990). Als Endorgan des peripheren Widerstandes spielen die Resistenzarteriolen eine besondere Rolle. Abbildung 1-1 zeigt die Druckverhältnisse im peripheren Blutkreislauf.

Histologisch bestehen Resistenzarteriolen generell wie andere arteriellen Gefäße aus einer Intima, einer Media und einer Adventitia. Abbildung 1-2 (Seite 6) zeigt schematisch die Endstrombahn, Präkapilläre Resistenzarteriolen mit glatten Muskelzellen, Kapillaren und postkapillären Venolen. Im histologischen Schnitt ist ein Querschnitt einer Resistenzarteriole mit ihren Wandschichten zu sehen. Man beachte dabei die Schicht glattmuskulärer Zellen in der Media.

Abb. 1-1: Druckverhältnisse im peripheren Blutkreislauf

aus: Ganoung, W.F., 1971, Medizinische Physiologie, Springer Verlag

11

Intima

Die Intima besteht aus Endothelzellen. Sie besitzen eine squamöse Struktur, sind ca. 2 µm dick, 10-20 µm breit und 30-50 µm lang (Carlson et al., 1982) mit spitz zulaufenden Enden und in ihrer langen Achse parallel zur Blutflussrichtung ausgerichtet. Eine Besonderheit bei den Endothelzellen kleiner Arteriolen in Bezug auf die Fähigkeit zur Vasorelaxation und Vasokonstriktion ist ihr Kontakt zu glattmuskulären Zellen der Media (Rhodin, 1980).

Media

Die Media kleiner Arterien besteht zu 70-85 Vol. % aus glatten Muskelzellen (Lee et al., 1983 a). Die Anzahl der glattmuskulären Muskelzellschichten nimmt mit abnehmenden Durchmesser ab. Während in Arteriolen mit einem Durchmesser über 300 µm noch durchschnittlich sechs Muskelzellschichten vorhanden sind, besitzen Arteriolen mit einem Durchmesser von 30 - 50 µm nur noch eine einzelne glattmuskuläre Zellschicht. (Lee et al., 1983 b). Die Muskelzellen sind mechanisch hauptsächlich über Membrankontakt miteinander verbunden, mit einigen wenigen dazwischengelagerten Kollagenfibrillen. Diese Art der Architektur wurde als elektrisches Synzytium bezeichnet (Mulvany und Aalkjaer, 1990).

Adventita

Wie auch in größeren Arterien besteht die Adventitia hauptsächlich aus Bindegewebe (Elastin und Kollagen), Fibroblasten, Mastzellen, Makrophagen und gelegentlich Schwannschen Zellen, (Lee et al., 1983 a; Rhodin, 1980). Die Dicke der Adventitia im Verhältnis zur Gesamtdicke der Wand variiert. Sie ist in den kleinen Zerebralarterien sehr dünn und kann in anderen Regionen bis zur Hälfte der gesamten Wanddicke ausmachen (Rhodin, 1980).

12

Abbildung 1-2: Histologischer Schnitt von Resistenzarteriolen

Die Rolle von NO

NO: Biochemie und Physiologie

Stickstoffmonoxid (Nitric-Oxide = NO) ist ein farbloses Gas, welches ein unpaares Elektron besitzt, das über dem Stickstoff und dem Sauerstoffatom delokalisiert ist. Es wird aus der

13

Aminosäure L-Arginin durch drei Isoformen der NO-Synthase synthetisiert. Bei dieser Synthese entsteht als Nebenprodukt die Aminosäure L-Citrullin. Es gibt eine neuronale (NOS I), eine induzierbare (NOS II) und eine endotheliale (NOS III) NO-Synthase (Förstermann et al., 1994, Soubrier, 1999). NO ist ein freies Radikal und wurde als ein Biomolekül mit wichtigen physiologischen Funktionen identifiziert. Als freies Radikal reagiert es in biologischen Flüssigkeiten rasch (innerhalb von 20-40 Sekunden) mit Sauerstoff und Wasser

^- zueinem Nitrit/Nitratgemisch (NO 2 /NO 3 ), oder innerhalb von Sekundenbruchteilen durch Oxidation durch das Superoxid-Anion ^• O 2 ^{− −} zu Peroxynitrit (ONO 2 ), welches durch

^- intramolekulareUmlagerung zu NO 3 umgewandelt wird. Diese beiden Wege bedeuten

^- gleichzeitigdie Inaktivierung des NO-Moleküles, da die Produkte NO 2 /NO 3 1000-fach

weniger biologisch wirksam sind (Moncada und Higgs, 1991). Endotheliales NO ist ein wichtiger physiologischer Vasodilatator und Inhibitor der Plättchenaggregation und -adhäsion (Grisham et al., 1998). Zudem kann es durch eine Herabregulierung des Leukozytenadhäsionsglykoproteinkomplexes CD11/CD18 eine Leukozytenadhäsion an das Endothel verringern (Kubes et al., 1991). Eine weitere Wirkung ist die Inhibition der Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen (Förstermann et al., 1994). Endothelial gebildetes NO repräsentiert somit ein wichtiges anti-atherogenes Prinzip (Li und Förstermann, 2000; Bolli, 2001). Eine vermehrte oder verminderte Synthese von endothelialem NO könnte somit wichtige Konsequenzen für die vaskuläre Homöostase haben. Neben Funktionen in der Homöostase des kardiovasculären und des Zentralnervensystems ist NO auch ein Modulator des Immunsystems. NO wurde als cytotoxischer Faktor muriner Makrophagern und anderer immunologischer Zellen beschrieben (Moncada und Higgs, 1991; Stuehr und Marletta, 1985; Hibbs et al., 1987).

Neben vegetativen, humoralen und physikalischen Faktoren (wie z.B. Parasympathikotonus, Prostaglandine, Scherkräfte und Temperatur) ist die Freisetzung von NO aus den Endothelzellen der präkapillären Arteriolen ein essentieller Parameter der Gefäßweitenregulierung und hat somit direkten Einfluss auf Blutdruckregulierung und Gewebsperfusion (Pohl, 1991). Es ist bekannt, daß Acetylcholin (ACh), Bradykinin und Adenosintriphosphat neben anderen Stimuli Blutgefäße über einen endothelabhängigen Mechanismus dilatieren. Furchgott und Mitarbeiter zeigten in ihren Versuchen, daß intakte Endothelzellen eine obligatorische Rolle für die Relaxation der glatten Gefäßmuskelzellen von Kaninchenaorten durch Acetylcholin spielen. Bei ihren Versuchen präparierten sie Aortenringe der descendierenden Aorta thoracica und legten sie in ein Krebs-Bicarbonat- Lösung. Sie fügten Acetylcholin in aufsteigender Konzentration hinzu und beobachteten dabei

14

eine konzentrationsabhängige Vasorelaxation, die in höheren Konzentrationen in eine Vasokonstriktion überging. Sie entfernten anschließend die Endothelschicht der Aortenringe und wiederholten die Versuche nach einer gewissen Equilibrationszeit. Dabei konnten sie keine Dilatation der Aortenringe beobachten. Nachdem sie einen zweiten Aortenring mit noch intakter Endothelschicht zu dem Aortenring ohne Endothelschicht hinzufügten, stellte sich die zuerst beobachtete Vasorelaxation an beiden Aortenringen ein (Furchgott und Zawadzki, 1980; Furchgott, 1984). Diese Untersuchungen hatten gezeigt, daß für die Vasorelaxation ein Mediator verantwortlich sein muß, der 1. aus den Endothelzellen stammt und 2.diffusabel ist. Dieser Mediator wurde zunächst als EDRF, „Endothelium derived relaxing factor“ beschrieben und später als Stickstoffmonoxid identifiziert.

Da NO sowohl Blutgefäße relaxiert, als auch die Thrombozytenaggregration und -adhäsion (Radomski und Moncada, 1991) sowie die Leukozytenaktivität hemmt (Kubes et al., 1991) und die Proliferation glatter Gefäßmuskelzellen (Garg und Hassid, 1989; Jeremy et al., 1999) und Typ I Kollagen hemmt (Chatziantoniou et al., 1998), wird NO als wichtiger protektiver Faktor im Herz-Kreislauf-Gefäßsystem angesehen (Conner und Grisham, 1995). Eine Verminderung der NO-Produktion wird bei der Pathogenese vaskulärer Dysfunktionen, die mit Hypertension, Diabetes mellitus und Hypercholesterinämie assoziiert sind, diskutiert (Li und Förstermann, 2000). Eine verminderte endotheliale NO-Pruduktion und eine vermehrte Inaktivierung durch Sauerstoffradikale wurde in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben und mit der essentiellen Hypertonie in Zusammenhang gebracht (Vallance et al., 1989, Linder et al., 1990, Panza et al., 1990, Huang et al., 1995, Taddei et al., 1999). In Untersuchungen wurde gezeigt, daß die Gabe der Aminosäure L-Arginin, aus der NO gebildet wird, bei Menschen den systolischen und diastolischen Blutdruck senkt und vor Hochdruck bei hierfür susceptiblen Ratten schützt (Conner und Grisham, 1995; Li et al., 1997; Susic et al., 2001; ). Selbst bei Menschen mit essentieller und sekundärer Hypertonie senkte die Gabe von L-Arginin den erhöhten Blutdruck (Nakaki et al., 1990; Petros et al., 1991). Die Indikatoren für eine vermehrte NO-Produktion wie Nitrat/Nitrit-Ausscheidung im Urin, cGMP- und L-Citrullin-Konzentration im Plasma waren gleichzeitig erhöht (Hishikawa et al. 1993). Zusammenfassend läßt sich also feststellen, daß für eine physiologische Blutdruckregulierung eine intakte Endothelzellschicht vorhanden sein muß, über die eine durch NO-Synthese vermittelte, endothel-abhängige Gefäßweitenregulierung ermöglicht wird. Zudem kann durch L-Arginingabe - als Substrat der NO-Synthese - eine bestehende Hypertension durch vermehrte NO-Produktion gebessert werden.

15

Wirkung von NO auf die Gefäßweitenregulierung

Seit über 100 Jahren ist bekannt, daß organische Nitrate und Nitrite die Symptome der koronaren Herzkrankheit bessern. Die erste bekannte Verbindung deren Wirkung therapeutisch genutzt wurde war Amylnitrit; eine Flüssigkeit, die inhaliert und über die Lungen resorbiert wurde. Die Wirkung trat innerhalb von 30 Sekunden ein, hielt aber auch nur wenige Minuten an. Die Verwendung dieser Substanz ist heute obsolet. Alfred Nobel (1833-1896), der Mitte des 19. Jahrhunderts Glyceroltrinitrat als wirksamen Bestandteils des Dynamits entdeckte, litt selbst unter Angina pectoris und nahm zur Besserung der Beschwerden Glyceroltrinitrat. Glyceroltrinitrat ist auch unter der chemisch inkorrekten Bezeichnung Nitroglycerin bekannt geworden (Förstermann, 1996).

Diese Stoffe sind deshalb wirksam in der Behandlung der koronaren Herzkrankheit, weil sie durch die Freisetzung von NO die durch atherosklerosierte Plaques verengten Herzkranzgefäße rasch erweitern und somit zu einer besseren Perfusion und Sauerstoffversorgung des Myokards führen. Aus diesem Grund werden solche Stoffe, die NO freisetzen und somit zu einer Vasodilatation führen, als NO-Donatoren bezeichnet. Die Freisetzung von NO kann in der glatten Muskulatur der Gefäßwand durch enzymatische Metabolisierung geschehen, wie es bei den organischen Nitraten und Nitriten der Fall ist. Andere Substanzen, wie Molsidomin und Nitruprussid-Natrium, setzen auf einem nichtenzymatischem Weg NO frei.

NO, welches in den Endothelzellen sowohl arterieller als auch venöser Gefäße durch die endotheliale NO-Synthase (eNOS) gebildet wird, diffundiert in die glatten Muskelzellen der Gefäßwand und bindet dort an eine Häm-Gruppe der löslichen Guanylatcyclase. Diese bildet aus GPT den second messenger cGMP. Dieser second messenger aktiviert wiederum die cGMP-abhängige Proteinkinase G (PKG), die über Phosphorylierung spezifischer Proteine letztendlich zu einer Erniedrigung der intrazellulären Ca ²⁺ -Konzentration führt und so eine Relaxation der Muskelzelle bewirkt (Rapaport und Murad, 1983; Waldman und Murad, 1988). Die eNOS, die durch Acetylcholin stimulierbar ist, steht somit am Anfang der Kaskade, die über einen Endothel-abhängigen Mechanismus (nämlich die Bildung von NO aus L-Arginin) zu einer Relaxation der glatten Muskulatur und somit zu einer Dilatation des Gefäßes führt.

Die beiden nicht-enzymatischen NO-Donatoren Molsidomin und Nitruprussid-Natrium setzen NO frei ohne dazu eine NO-Synthase oder L-Arginin zu benötigen. Dabei diffundiert freies NO zu der glattmuskulären Zelle der Gefäßwand und wirkt dort wie oben beschrieben auf die