Anwendung etablierter Methoden bei der Untersuchung saisonaler Unterschiede in der Transmission von 'Borrelia burgdorferi sensu lato' – Genospezies durch Kleinsäuger

Friedrich-Schiller-Universität Jena
Biologisch-Pharmazeutische Fakultät
Institut für Ernährungswissenschaften
Lehrbereich für Lebensmittelhygiene

Anwendung etablierter Methoden bei der Untersuchung
saisonaler Unterschiede in der Transmission von Borrelia
burgdorferi sensu lato – Genospezies durch Kleinsäuger

Diplomarbeit

zur Erlangung des Grades eines Diplom-Biologen

vorgelegt von

Jan Franke

Jena, im März 2005

Inhaltsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis ... I
Tabellenverzeichnis  ... III
Abkürzungsverzeichnis ... IV

1. EINLEITUNG UND ZIELSTELLUNG  ... 1

2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN  ... 2
2.1 Lyme-Borreliose  ... 2
2.1.1 Historie  ... 2
2.1.2 Klinik  ... 2
2.1.3 Prävention und Therapie ... 3
2.2 Borrelia burgdorferi sensu lato ... 4
2.2.1 Morphologie und Taxonomie ... 4
2.2.2 Genom ... 6
2.2.3 Übertragung und Pathogenese ... 6
2.2.4 Geographische Verbreitung ... 7
2.3 Der Vektor Ixodes ricinus ... 8
2.3.1 Morphologie und Taxonomie ... 8
2.3.2 Die Entwicklungsstadien und ihre Bedeutung für die Übertragung von Borrelia burgdorferi s.l.  ... 8
2.3.3 Habitate und Geographische Verbreitung  ... 10
2.3.4 Apodemus flavicollis, A. sylvaticus und Clethrionomys glareolus als Erregerreservoir ... 11

3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN  ... 13
3.1 Aufgabenstellung ... 13
3.2 Material und Methoden  ... 13
3.2.1 Untersuchungsgebiet  ... 13
3.2.2 Fangmethoden und Probenentnahme ... 14
3.2.3 DNA - Extraktion  ... 15
3.2.3.1 Qiagen DNeasy® Tissue Kit  ... 15
3.2.3.2 Promega Wizard® Genomic DNA Purification Kit  ... 16
3.2.3.3 Sigma GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit  ... 17
3.2.4 Polymerase-Kettenreaktion ... 18
3.2.5 Gelelektrophorese und Bildbearbeitung ... 19
3.2.6 Genospeziesdifferenzierung mittels RFLP  ... 20
3.2.7 Genospeziesdifferenzierung nach DEMAERSCHALCK et al.  ... 21
3.2.8 Immunfluoreszenstest  ... 23
3.2.9 Serologische Untersuchungen ... 24
3.2.10 Statistik ... 24

4. ERGEBNISSE ... 26
4.1 Fangergebnisse und Infestationsraten der Kleinsäuger  ... 26
4.2 PCR-RFLP ... 28
4.2.1 Validierung ... 28
4.2.2 Freilandfänge  ... 30
4.2.3 Gesogene Ixodes ricinus - Larven ... 33
4.2.4 Biopsien der Kleinsäuger  ... 37
4.3 Immunologie  ... 38
4.4 Statistische Analysen ... 40

5. DISKUSSION ... 44
5.1 Infestation der Kleinsäuger  ... 44
5.2 Validierung  ... 46
5.3 Infektionsraten der Freilandzecken ... 49
5.4 Infektionsraten gesogener Zecken und Kleinsäuger  ... 54
5.5 Serologische Untersuchungen  ... 57
5.6 Schlussfolgerungen ... 59

6. ZUSAMMENFASSUNG

Literaturverzeichnis 64

Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Elektronenmikroskopische Aufnahme von B. burgdorferi s.s ... 4
Abb. 2: Die Entwicklungsstadien von I. ricinus im ungesogenen und gesogenen Zustand.  ... 9
Abb. 3: Der dreiwirtige Lebenszyklus von I. ricinus ... 10
Abb. 4: Die Rötelmaus - Clethrionomys glareolus  ... 12
Abb. 5: Die Gelbhalsmaus - Apodemus flavicollis ... 12
Abb. 6: RFLP eines 0,8kb langen OspA – Fragments aus Referenzsträngen des B. burgdorferi s.l. – Komplexes nach MICHEL et al. (2004).  ... 21
Abb. 7: Individuenzahlen der im Jahre 2004 im Untersuchungsgebiet Bad Berka gefangenen Kleinsäuger ... 26
Abb. 8: Infestationsraten der gefangenen Kleinsäuger mit I. ricinus - Larven.  ... 28
Abb. 9: Validierung des „Sigma GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kits“ durch „seminested“ PCR verschiedener Verdünnungen einer B. afzelii - Kultur ... 29
Abb. 10: Saisonaler Verlauf der Prävalenz von B. burgdorferi s.l. für verschiedene Entwicklungsstadien freilandgefangener I. ricinus aus dem Jahr 2004 ... 31
Abb. 11: Saisonale Verteilung der Prävalenzen verschiedener B. burgdorferi s.l. - Genospezies in freilandgefangenen I. ricinus aus dem Jahre 2004 ... 33
Abb. 12: Transmission von Borrelien auf I. ricinus - Larven durch Kleinsäuger im Untersuchungsgebiet Bad Berka im Jahre 2004 ... 35
Abb. 13: Vergleich der Bandenstärke eines 0,8kp langen OspA - Fragments, das durch eine PCR nach MICHEL et al. (2004) amplifiziert wurde ... 36
Abb. 14: RFLP eines 0,8kb langen OspA – Fragments zur Genospeziesdifferenzierung von B. burgdorferi s.l. nach MICHEL et al. (2004)  ... 36
Abb. 15: Nachweis eines 544bp OspA - Fragmentes aus B. burgdorferi s.s. durch Einsatz genospezifischer Primer.  ... 37
Abb. 16: RFLP eines 0,8kb langen OspA – Fragments zur Genospeziesdifferenzierung von B. burgdorferi s.l. aus einer Biopsie nach MICHEL et al. (2004)  ... 37
Abb. 17: Saisonalität der Prävalenz von anti - Borrelien - IgG in den im Jahre 2004 im Untersuchungsgebiet Bad Berka gefangenen Kleinsäugerarten.  ... 39
Abb. 18: Saisonale Verteilung der anti - Borrelien - IgG -Titer im Jahre 2004 im Untersuchungsgebiet Bad Berka gefangenen Kleinsäuger ... 39
Abb. 19: Positive Korrelation zwischen den anti - Borrelien - IgG - Titern gefangener Kleinsäuger und deren Infestation mit I. ricinus - Larven.  ... 41
Abb. 20: Jahresvergleich der mittleren Prävalenz von B. burgdorferi s.l. in freilandgefangenen I. ricinus aus dem Untersuchungsgebiet Bad Berka ... 49

Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Zusammenfassung der wichtigsten klinischen Verlaufsformen der Lyme - Borreliose ... 3
Tab. 2: Primersequenzen für die „semi-nested“-PCR zur Amplifizierung eines 818bp Fragments aus dem OspA - Gen von B. burgdorferi s.l. nach MICHEL et al. (2004)  ... 18
Tab. 3: RFLP von OspA – Amplifikaten nach Verdau mit 5 spezifischen Restriktionsenzymen zur Genospeziesdifferenzierung von B. burgdorferi s.l. nach MICHEL et al. (2004)  ... 20
Tab. 4: Primersequenzen für die Genospeziesdifferenzierung von B. burgdorferi s.l. nach DAEMERSCHALK et al. (1995)  ... 22
Tab. 5: Resultate der „semi-nested“ PCR nach MICHEL et al. (2004) unterschiedlich verdünnter Kulturen von B. afzelii.  ... 30
Tab. 6: Ergebnisse der Genospeziesdifferenzierung von B. burgdorferi s.l. mittels RFLP nach MICHEL et al. (2004) aus verschiedenen Entwicklungsstadien freilandgefangener I. ricinus ... 32
Tab. 7: Prävalenz von B. burgdorferi s.l. in gesogenen I. ricinus aus dem Untersuchungsgebiet Bad Berka im Jahre 2004.  ... 34
Tab. 8: Übertragungswahrscheinlichkeit von B. burgdorferi s.l. auf I. ricinus - Larven durch Kleinsäuger im Untersuchungsgebiet Bad Berka im Jahre 2004.  ... 35
Tab. 9: Kreuztabelle für die Berechnung von [...] zur Untersuchung der Korrelation zwischen der B. burgdorferi s.l. - Genospezies aus freilandgefangenen Zecken und der Jahreszeit ... 42
Tab. 10: Kreuztabelle für die Berechnung von [...] zur Untersuchung der Korrelation zwischen der B. burgdorferi s.l. - Genospezies aus freilandgefangenen Zecken und deren Entwicklungsstadium ... 

Abkürzungsverzeichnis

[...]

1. Einleitung und Zielstellung

Die Lyme - Borreliose ist die häufigste durch Zecken übertragene Erkrankung in Europa, Ostasien und Nordamerika (YANAGIHARA und MASUZAWA 1997). Sie wird durch Infektion mit Bakterien des Borrelia burgdorferi s.l. - Komplexes hervorgerufen. Sowohl der Infektionszyklus der Erreger, als auch die Symptome dieser Multisystemerkrankung können sehr vielfältig sein. Als wichtiges Reservoir für Borrelien gelten Kleinsäuger, die in Europa mit B. afzelii assoziiert sind, sowie Vögel, die hauptsächlich B. garinii und B. valaisiana übertragen. Borrelia burgdorferi sensu stricto wird von beiden Reservoirgruppen übertragen (ANDERSON et al. 1986; HANINCOVA et al. 2003a; HUMAIR et al. 1993; KURTENBACH et al. 1998; RIZZOLI et al. 2004).

Die unterschiedlichen Serotypen sind für die stark differierende klinische Ausprägung dieser Erkrankung verantwortlich (VAN DAM et al. 1993). Aufgrund des Variantenreichtums der Oberflächenproteine bei den verschiedenen B. burgdorferi s.l. - Genospezies in Europa existiert bislang noch kein effektiver Impfstoff. Es wird jedoch intensiv an der Entwicklung von Vakzinen gearbeitet (HAYES und SCHRIEFER 2002; WAHLBERG 1999; WALLICH et al. 2002; WIENEKE et al. 2000). Eine genaue Kenntnis über die geographische Verbreitung der B. burgdorferi s.l. - Genotypen in Europa, sowie deren Bezug zu den Erregerreservoiren und zur Saisonalität, ist dafür von immenser Bedeutung.

Es gibt eine Vielzahl unterschiedlicher Methoden zum Nachweis von Borrelien (COURTNEY et al. 2003; MICHEL et al. 2004; PIESMAN et al. 2001; RATHINAVELU und DE SILVA 2001; RAUTER et al. 2002; VOSTAL und ZAKOVSKA 2003; WANG et al. 2003; WANG et al. 1999b). Aufgrund der oft geringen Erregerzahl in den Untersuchungsmaterialien und der Anwesenheit inhibitorischer Substanzen ist es jedoch oft schwierig, die Spirochäten in Zecken und Wirtsgewebe nachzuweisen.

Ziel dieser Arbeit ist es, unter der Anwendung ausgewählter etablierter Methoden, eventuelle Unterschiede in der Übertragung von B. burgdorferi s.l. - Genospezies durch Kleinsäuger vor allem in Bezug auf Saisonalität zu beschreiben und somit den Kenntnisstand über diese humanpathogenen Erreger sowie deren Nachweismethoden zu erweitern.

2. Theoretische Grundlagen

2.1 Lyme-Borreliose

2.1.1 Historie

Die ersten gehäuften Erkrankungen an einer bis dahin unbekannten Form juveniler rheumatoider Arthritis in Folge von Zeckenstichen traten im Jahre 1975 in den Orten Lyme, Old Lyme und East Haddam in Connecticut/USA auf (STEERE et al. 1977). Bereits 1883 wurde an Patienten eine chronische Hautveränderung beschrieben (BUCHWALD 1883), die dann 1902 von HERXHEIMER und HARTMANN Acrodermatitis chronica atrophicans benannt wurde. In den Jahren 1922 und 1941 wurde erstmals über neurologische Symptome nach einem Zeckenstich berichtet (BANNWARTH 1941; GARIN und BUJADOUX 1922). Den eigentlichen Erreger entdeckte BURGDORFER 1982 zufällig bei Untersuchungen über Rickettsien.

2.1.2 Klinik

Die Lyme - Borreliose ist eine Multisystemerkrankung, die eine Vielzahl unterschiedlicher Symptome aufweisen kann. Man kann den klinischen Verlauf in drei Stadien einteilen. Auf das Frühstadium der Erkrankung kann ein chronischer Verlauf oder ein spontanes Ausheilen folgen. In Tabelle 1 werden die häufigsten Verlaufsformen der Lyme - Borreliose in den verschiedenen Stadien erläutert. Neben den hier beschriebenen Manifestationen ist noch eine Vielzahl weiterer, selten auftretender Verlaufsformen bekannt. Die Klinik der Erkrankung kann sehr unterschiedlich ausgeprägt sein und muss nicht zwangsläufig in Stadien ablaufen (MIELKE und HAHN 2001; STANEK et al. 2002). Die Art der klinischen Manifestation der Lyme - Borreliose ist abhängig von der B. burgdorferi s.l. - Genospezies, mit welcher der Patient infiziert ist (BALMELLI und PIFFARETTI 1995; VAN DAM et al. 1993).

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