Beziehungen zwischen somatischen Mutationen im Tumorgewebe und bekannter Keimbahnmutation der Gene BRCA1 und BRCA2 beim hereditären Mammakarzinom

Die vorgelegte Arbeit wurde im Zeitraum vom 1. April 2003 bis 25. März 2004 am Institut

für Humangenetik der Universität Leipzig angefertigt.

Abkürzungsverzeichnis

  6-FAM 6-Carboxyfluorescein  

  A Adenin  

  AcN Acetonitril  

  Apf Antiproliferationsfaktor  

  APS Ammoniumpersulfat  

  aqua dest. aqua destillata, destilliertes Wasser  

  AT Ataxia telangiectasia  

  ATe Annealingtemperatur  

  ATF1 cAMP-dependent transcription factor 1  

  ATM ataxia telangiectasia mutated  

  ATP Adenosintriphosphat  

  ATR ATM-Rad3-related protein kinase  

  BACH1 basic leucine zipper transcription factor 1  

  BAP1 BRCA1-associated protein 1  

  BARD1 BRCA1-associated RING domain protein 1  

  BASC BRCA1 associated genome surveillance complex  

  BBS Bromphenolblau  

  BCL2 B-cell lymphoma 2  

  BLM Bloom syndrome  

  bp Basenpaar, Größenangabe für DNA oder RNA  

  BRAF35 BRCA2-associated factor 35  

  BRAP2 BRCA1 associated protein 2  

  BRC BRC-Domäne, acht Motive mit einer großen Sequenzhomologie des  

  Genprodukts BRCA2, codiert im Gen BRCA2 Exon 11  

  BRCA1, BRCA2 breast cancer susceptibility genes  

  BRCT C-terminale Domäne von BRCA1  

  BRG1 chromatin-remodeling factor, Synonym: SMARCA4  

  C Cytosin  

  CAF p300/CBP-associated factor  

  cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat  

  CD44 CD44 Antigen  

  CDH1 cadherin  

CDK, CDK 2 cyclin-dependent kinases, Zyklin-abhängige Kinasen

c-erbB erythroblastic leukemia viral oncogene homolog

CHK2 checkpoint kinase 2

c-Myc myelocytomatosis viral oncogene homolog

CstF-50 cleavage stimulation factor 50

CtBP C-terminal binding protein

CtIP CtBP interacting protein, Synonym: RBBP8

d´ATP 2´-Desoxyadenosin-5´-triphosphat

d´CTP 2´-Desoxycytosin-5´-triphosphat

d´GTP 2´-Desoxyguanosin-5´-triphosphat

d´NTP 2´-Desoxynucleotid-5´-triphosphat

d´TTP 2´-Desoxythymidin-5´-triphosphat

DNA desoxyribonucleic acid

DSB Doppelstrangbruch

DSS1 gene, deleted in split-hand/ split-foot 1 region

E estrogen, Östrogen

E2F-1 adenoviral protein factor 1

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EGF epidermal growth factor

EGF-R epidermal growth factor receptor

ER estrogen receptor 1, Östrogen Rezeptor 1

ERa Era G-protein-like, sequenzspezifischer Transkriptionsfaktor

FGF fibroblast growth factor

FHIT fragile histidine triad gene

FOR forward, Vorwärtsprimer

G Guanin

Gadd45 growth arrest and DNA damage inducible protein

GSTP1 glutathione S-transferase 1

hBUBR1 budding uninhibited by benzimidazoles 1 (yeast homolog), Kinase

HDAC1, HDAC2 Histondeacetylasen

HGMD Human Gene Mutation Database

HIC human I-mfa domain-containing protein

HME Hereditäre Multiple Kartilaginäre Exostosen

Her2neu human epidermal growth factor receptor, Synonym: c-erbB2

HPLC-Wasser destilliertes und deionisiertes Wasser zur Verwendung bei der High

Performence Liquid Chromatography

HRR homologous recombination repair

IGF insulin-like growth factor

IL-6 Interleukin-6

Int (site of) int(egration), Bindungsstelle zur Integration ins Genom

IR ionizinig radiation, ionisierende Strahlung

IVS intervening sequence, zwischen zwei Exons lokalisierte DNA-Sequenz

kb Kilobasen, Größenangabe für 1000 bp DNA oder RNA

KDa Kilodalton, Massenangabe für Proteine

KPNA2 karyopherin alpha 2

LOH Loss of heterozygosity

MgCl 2 Magnesiumchlorid

MLH1 mut L homolog 1 (E. coli), DNA-Reparaturprotein

MRE11 meiotic recombination 11 homolog (S. cerevisiae), DNA-Reparaturprotein

mRNA messenger RNA

MSH2, MSH6 mut S homolog 2 bzw. 6 (E. coli), DNA-Reparaturproteine

MYC siehe c-Myc

NaAc Natriumacetat

NaOH Natriumhydroxid

NBS1 Nijmegen breakage syndrome 1

NHEJ non-homologous end joining

NLS nuclear localization sequence, Kernlokalisierungs-Domäne

NME1 nucleoside diphosphate kinase, Synonym: CGI-48

OD optische Dichte

p16, p21, p27 cyclin-dependent kinase inhibitors

p53 Tumorprotein 53

p300/CBP E1A binding protein p300 /CREB binding protein -Komplex

PAGE Polyacrylamid Gelelektrophorese

P/CAF siehe CAF

PCNA proliferating cell nuclear antigen

PCR Polymerase Chain Reaction, Polymerase-Ketten-Reaktion

Pg progesterone, Progesteron

PgR progesterone receptor, Progesteron Rezptor

pRB proline-rich protein family

PTEN p(hosphatase and tensin homolog deleted on chromosome) ten protein

Rad50, Rad51 eucaryotic recombination and DNA repair proteins

RARβ retinoic acid receptor beta protein

ras Familie von GTPasen

RB retinoblastoma protein

RbAp46, RbAp48 Histondeacetylasen

REV reverse, Rückwärtsprimer

RHA RNA helicase A, Synonym: DHX9

RNA Ribonucleicacid

RNA Pol II RNA Polymerase II

RPB2, RPB10a RNA Polymerase II Untereinheiten

SINES short interspersed sequences, kurze verteilte Sequenzen

STAT1 signal transducer and activator of transcription protein 1

SWI/SNF ATP dependent chromatin modelling complex

T Thymin

TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer

TE Tris-EDTA-Puffer

TEAA Triethylammonium Acetat

TEMED Tetramethylethylenediamin

TGF / TGF-ß transforming growth factor bzw. - ß

TP53 siehe p53

Tris Tris(hydroxymethyl-aminomethan)

TRPS Trichorhinophalangeales Syndrom

TSG Tumorsuppressorgen

uPA uterine-specific proline-rich acidic protein

VEGF vascular endothelial growth factor

WAF1 siehe p21

WHO World Health Organisation

ZBRK1 zinc finger and BRCA1-interacting protein with a KRAB domain1,

Synonym: ZNF350

Inhaltsverzeichnis

  Seite  

1  Einführung in die Problematik  1

1.1.  Erblicher und sporadischer Brustkrebs  2

1.2.  Ablauf der Karzinogenese  3

1.3.  An der Auslösung von Brustkrebs beteiligte Gene  5

1.3.1.  BRCA1 breast cancer susceptibility gene 1  6

1.3.2.  BRCA2 breast cancer susceptibility gene 2  9

1.3.3.  Weitere Brustkrebs-beeinflussende Gene und BRCAX  12

1.4.  Charakteristika erblichen Brustkrebses  15

1.5.  Diagnose und Prävention bei familiärem Brustkrebs  16

1.6.  Zielstellung  18

19  Material und Methoden  2

2.1.  Auswahl der Patientinnen  19

2.2.  Angewandte Methoden  23

2.2.1.  Entparaffinieren und Separation der Tumorzellen  23

2.2.2.  Isolierung genomischer DNA  24

2.2.2.1.  Phenolreinigung  24

2.2.2.2.  Invisorb Kit  25

2.2.2.3.  Qiagen Kit  25

2.2.2.4.  Chelex Spurenisolierung  26

2.2.3.  Reinigung genomischer DNA  27

2.2.4.  Photometrische Konzentrationsbestimmung  27

2.2.5.  Polymerasekettenreaktion (PCR)  27

2.2.6.  Gelelektrophorese  34

2.2.7.  Sequenzierung  34

2.2.7.1.  Probenvorbereitung  35

2.2.7.1.1.  Reinigung der PCR Produkte  35

2.2.7.1.2.  Sequenzierreaktion  36

2.2.7.1.3.  Fällung  36

2.2.7.2.  Sequenzieren  37

2.2.7.2.1.  Reinigung der Platten  37

2.2.7.2.2.  Zusammensetzen der Gelkammer und Gießen des Gels  37

2.2.7.2.3.  Sequenzervorbereitung und Probenauftrag  38

2.2.8.  Untersuchung des Methylierungsstatus  39

2.2.8.1.  Deaminierung  39

2.2.8.2.  Reinigung  40

2.2.8.3.  Methylierungsspezifische PCR  40

48  Ergebnisse  3

3.1.  Tumormaterial der Patientinnen  48

3.2.  DNA-Isolierung PCR und Gelelektrophorese  48

3.3.  Reinigung genomischer DNA und photometrische  

  Konzentrationsbestimmung  50

3.4.  Mutationsprofil des Tumorgewebes  51

3.5.  Loss of heterozygosity als second hit  52

3.6.  Hypermethylierung als second hit  54

57  Diskussion  4

4.1.  Methodendiskussion  57

4.1.1.  Tumormaterial der Patientinnen  57

4.1.2.  Isolierung genomischer DNA  57

4.1.3.  Reinigung genomischer DNA  58

4.1.4.  Photometrische Konzentrationsbestimmung  58

4.1.5.  PCR  59

4.1.6.  Gelelektrophorese  59

4.1.7.  DNA-Sequenzierung  60

4.1.8.  Hypermethylierung  61

4.2.  Ergebnisdiskussion  62

4.2.1.  Mutationsprofil im Tumorgewebe  62

4.2.2.  Loss of heterozygosity beim Mammakarzinom  63

4.2.3.  Hypermethylierung  65

4.2.4.  Weitere Ereignisse die zum vollständigen Verlust der Expression  

  führen könn(t)en  66

4.2.5. Ansatzpunkte für weitergehende Untersuchungen 66

Anhang:

I. Zusammenfassung I

II.

III.

IV.

V.

VI.

1. Einführung in die Problematik

Krebserkrankungen stellen nach Erkenntnis der Weltgesundheitsorganisation (WHO) mit 12,5%, nach Herz-Kreislauferkrankungen (29,2%) und Infektionen 1 (26,2%), die dritthäufigste Todesursache weltweit dar 2 [WHO Jahresbericht, 2003(1)]. In der Bundesrepublik Deutschland und in anderen industrialisierten Staaten sind Krebserkrankungen die zweithäufigste Todesursache [Statistisches Bundesamt, 2003; WHO Jahresbericht, 2 003(2)]. Entsprechend verständlich ist das Interesse von Wissenschaft und Gesellschaft, die Ursachen der Krebsentstehung zu erkennen und Behandlungsmöglichkeiten zu entwickeln.

Voraussetzung für die Entwicklung eines Tumors sind genetische Veränderungen i n einzelnen oder mehreren Zellen, die bereits in der Keimbahn vorhanden sein können oder somatisch entstehen. Keimbahnmutationen manifestieren sich in allen Zellen des betroffenen Individuums vor und können an Nachkommen weitergegeben werden. Somatische Veränderungen entstehen dagegen spontan und bleiben i.d.R. auf wenige Zellen beschränkt. Für die Krebsentstehung sind immer mehrere Veränderungen notwendig. Von einem Tumor wird deshalb erst dann gesprochen, wenn durch eine progressive Abfolge von Veränderungen die Stadien der Immortalisierung 3 und Transformation 4 durchschritten wurden. Durch weitere genetische Veränderungen kann der Tumor „bösartiger“ werden und aggressiv Metastasen 5 bilden. In der Regel sind sechs bis sieben Mutationen für die Entstehung eines Tumors notwendig. Bei Vorliegen einer Keimbahnmutation kann dagegen schon eine weitere somatische Mutation für die Ausbildung eines Tumors ausreichend sein. Im Fall einer vorhandenen Keimbahnmutation wird deshalb von einer genetischen Prädisposition gesprochen [Lewin, 1998 (S. 911 - 14); Alberts et al, 1995 (S. 1489 - 1509)].

Im Rahmen der Diplomarbeit wurden Gewebeproben von Patientinnen und Patienten 6 , die an einem Mammakarzinom (Brustkrebs) erkrankt waren, untersucht. In der Arbeit wird in einer „Einführung“ auf bisherige Erkenntnisse der Brustkrebsentstehung eingegangen. In diesem Zusammenhang werden die Charakteristiken und die Entstehung von familiärem und

1 “Infectious and parasitic diseases and Respiratory infections”

2 Angaben für das Jahr 2002 3 Immortalisierung beschreibt den Zustand einer Zelle, unbegrenzt zu wachsen, ohne dass sich der Phänotyp (das äußere Erscheinungsbild) ändert.

4 Durch die Transformation ist die Zelle nicht mehr in der Lage, normale Wachstumsbeschränkungen einzuhalten. Sie wird von Faktoren unabhängig, die sie normalerweise für das Zellwachstum benötigt. 5 Die Metastasierung beschreibt das Stadium, in der die Zelle die Möglichkeit erlangt, in normales Gewebe einzudringen. Sie kann das ursprüngliche Gewebe verlassen und im Körper „Kolonien“ bilden.

6 Es wurden 15 Frauen und 1 Mann untersucht. Die im Folgenden verwendeten weiblichen Bezeichnungen schließen alle Probanden ein und tragen der Bedeutung von Brustkrebs insbesondere für Frauen Rechnung.

1

sporadischem Brustkrebs und wichtige involvierte Gene und Auswirkungen auf betroffene Patientinnen erläutert. In den folgenden Kapiteln, „Material und Methoden“, „Ergebnisse“, „Diskussion“, werden Auswirkungen sporadischer Veränderungen auf die Brustkrebs- entwicklung an einer Patientinnengruppe (n=16) mit erblichen Gendefekten in den Genen BRCA1 und BRCA2 (breast cancer susceptibility genes 1 und 2) 7 nachvollzogen.

1.1. Erblicher und sporadischer Brustkrebs

Jährlich erkranken nach Angaben des Robert-Koch-Instituts 46.000 Frauen in der Bundesrepublik Deutschland an einem Mammakarzinom. 18.000 Frauen sterben jährlich an den Folgen dieser Erkrankung. Zwischen dem 35. und 55. Lebensjahr stellt Brustkrebs bei Frauen die häufigste Todesursache dar. Die Wahrscheinlichkeit einer Frau im Laufe ihres Lebens an Brustkrebs zu erkranken, liegt bei ca. 10%. [Deutsche Krebshilfe, 2002].

Die Ursachen des Mammakarzinoms sind multifaktoriell (Tabelle 1.1.1). Erst eine Vielzahl von genetischen und nichtgenetischen Veränderungen führen zum Ausbruch der Krebserkrankung. Nur ein Anteil von etwa 5 bis 20% aller Mammakarzinomerkrankungen kann mit angeborenen genetischen Prädispositionen in Verbindung gebracht werden [Kuschel et al, 2000; Wooster et al, 2003].

Tabelle 1.1.1: Brustkrebs beeinflussende Faktoren; [Wawrzyn et al, 1999].

7 Im Folgenden werden Gene kursiv hervorgehoben, bspw. BRCA1. Die Genprodukte werden als unformatierter

Fließtext dargestellt, bspw. BRCA1.

2

Neben Veränderungen in den Genen p53 ( Tumorprotein 53), ATM ( ataxia teleangiectatica mutated) und PTEN ( phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten) sind vor allem Mutationen in den Genen BRCA1 und BRCA2 für die Entwicklung eines Mammakarzinoms entscheidend. Geht ihre Funktion verloren, steigt das Risiko für Brust- und Eierstockkrebs erheblich. Fünf bis zehn Prozent der erblichen Pankreas- [Arnold et al, 2001] und Prostatakrebserkrankungen [Cerhan et al, 1999; Gayther et al, 2000] sind ebenfalls auf Keimbahnmutationen in den Genen BRCA1 und BRCA2 zurückzuführen (Tabelle 1.1.2).

Tabelle 1.1.2: Krebserkrankungsrisiko bei Mutationsträgern in den Genen BRCA1 und BRCA2; [Easton et al, 1997; Ford et al, 1998; Kuschel et al, 2000; Kiechle et al, 2003].

1.2. Ablauf der Karzinogenese

Molekularbiologisch sind die Aktivierung von Onkogenen und die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen an der Krebsentstehung beteiligt. Onkogene sind Gene, deren Genprodukte Zellen transformieren können, so dass diese wie Krebszellen wachsen. Sie greifen in Signaltransduktionswege, Transportprozesse oder die Wachstumsregulation ein. Produkte von Onkogenen sind Wachstumsfaktoren, Kinasen, membrangebundene G - Proteine, Transkriptions-faktoren und Regulatoren des Zellzyklus. Proto-Onkogene codieren für wachstumsfördernde Faktoren. Bei einer mutationsbedingten Änderung eines Proteins, einer Überexpression, einer Expression in „falschen“ Zelltypen und/oder dem Nichtabschalten der Expression können sie in ein Onkogen übergehen. Tumor- suppressorgene codieren Genprodukte, die eine Kontrolle auf den Zellzyklus und das Zellwachstum ausüben. Sie wirken bei der Zelladhäsion, der Signaltransduktion, der Kontrolle der Transkription, der DNA-Reparatur, kontrollieren den Zellzyklus oder induzieren Apoptose. Der Wegfall dieser Kontrolle führt zu einer vermehrten und

3

unregulierten Zellteilung und damit zur Tumorbildung. BRCA1 und BRCA2 sind Beispiele für Tumorsuppressorgene. Sie wirken bei der Kontrolle der Transkription, des Zellzyklus und der DNA-Reparatur.

Nach der „second hit-Hypothese“ von Knudson erfolgt die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen in zwei Schritten. Zunächst wird eines der beiden Allele inaktiviert. Ursache ist eine Keimbahn- oder eine sporadische Mutation. Im zweiten Schritt folgt der Funktionsverlust der zweiten Genkopie. Das kann durch einen kompletten oder teilweisen Verlust des Gens durch einen sog. Loss of heterozygosity (LOH), durch eine verminderte Promotorfunktion durch Hypermethylierung oder durch eine weitere somatische Mutation geschehen (Abb. 1).

Abb. 1: second hit-Modell von Knudson, 1971; eigene Darstellung.

Folge ist eine Inaktivierung des Gens. Aufgaben des Genprodukts im Organismus können nicht mehr wahrgenommen werden. Dadurch bedingt kommt es mit größerer Wahrscheinlichkeit zu weiteren Veränderungen, die die betroffenen Zellen einer Zellwachstums- und Zellzykluskontrolle entziehen und eine zunehmend pathologische Entwicklung bewirken (Abb. 2) [Beckmann et al, 1997].

4

Abb. 2: Modell der Mehrschritt-Karzinogenese nach Beckmann [Beckmann et al,

1997; Aba-Kircin, 2001].

1.3. An der Auslösung von Brustkrebs beteiligte Gene

Für die Auslösung von Brustkrebs ist der Funktionsverlust von Genen und i hren Genprodukten erforderlich, die in lebenswichtige Prozesse proliferierender Zellen des Brustdrüsengewebes involviert sind. Als entscheidend für die Entwicklung eines Mammakarzinoms haben sich die Gene BRCA1 und BRCA2 herausgestellt. In Abbildung

3 sind sie im Zentrum von Prozessen dargestellt, an denen sie beteiligt sind.

5

Abb. 3: Schematischer Überblick über Prozesse mit Beteiligung von BRCA1 und BRCA2; Dargestellt sind Beteiligungen an der Zellzykluskontrolle, an der DNA-Reparatur und am Wachstumsstopp [Hedenfalk et al, 2002].

1.3.1. BRCA1 – breast cancer susceptibility gene 1

BRCA1 und BRCA2 werden überdurchschnittlich in sich teilenden Zellen exprimiert. Das Genprodukt konnte in verschiedenen Geweben, wie der Brust, dem Ovar, dem Thymus und den Testes, nachgewiesen werden [Miki et al, 1994]. BRCA1 und BRCA2 werden in der frühen Embryogenese benötigt und werden während der Pubertät und Schwangerschaft im Brustdrüsengewebe verstärkt exprimiert [Rajan et al, 1997].

Das BRCA1-Gen ist auf dem langen Arm des Chromosoms 17 (17q21) lokalisiert und erstreckt sich über 81 kb genomischer DNA. Es untergliedert sich in 22 codierende Exons [Miki et al, 1994; Smith et al, 1996; Bertwistle et al, 1999]. Bemerkenswert ist das ungewöhnlich große Exon 11 mit mehr als 60% der codierenden Region und die große Dichte an ALU-Elementen 8 . ALU-Elemente machen 42% des gesamten Gens aus. Alle repetitiven Sequenzen zusammen bilden 47% des Gens [Smith et al, 1996; Welcsh et al, 2001]. BRCA1 besitzt keine TATA-Box,

8 ALU-Sequenzen gehören zur Familie der SINES (short interspersed sequences) der Retroposons. Sie bewegen sich über einen RNA-vermittelten Prozess, der den Einsatz einer reversen Transkriptase erfordert. Bei der Insertion entstehen Zielstellen-Duplikationen. ALU-Sequenzen sind etwa 300 Nucleotide lang und werden vom Restriktionsenzym AluI geschnitten. Im haploiden Genom kommen ALU-Sequenzen mit 500000 Kopien vor [Lewin, 1998 (S. 496 - 97); Alberts et al, 1995 (S. 464 - 65)].

6

sondern stattdessen eine 36 bp große positiv regulierende Region, die die Promotoraktivität steuert [Thakur et al, 1999]. Das mRNA Transkript des BRCA1-Gens umfasst 7,8 kb und codiert für ein 1863 Aminosäuren großes Genprodukt mit einem Molekulargewicht von 220 kDa [Miki et al, 1994; Chen et al, 1996]. Das BRCA1-Protein zeigt keine Homologie zu anderen bekannten Proteinen, dennoch konnten einige konservierte Regionen identifiziert werden. BRCA1 besitzt N-terminal ein spezialisiertes Zinkfinger-RING-Motiv, das die Protein- DNA- und Protein-Protein-Interaktionen beeinflussen kann. A ußerdem ist BRCA1 durch eine Kernlokalisierungs-Domäne (NLS, nuclear localization sequence), die sich im Bereich des Exons 11 befindet, eine Transaktivierungs-Domäne und zwei BRCT-Domänen (BRCA1 C - terminal domain) gekennzeichnet (Abb. 4).

Abb. 4: Schematische Darstellung des BRCA1-Proteins; mit den strukturellen Besonderheiten RING-Domäne, NLS (nuclear localization sequence), Transaktivierungsdomäne und zwei BRCT- Domänen (BRCA1 C -Terminal domain). Weiterhin Interaktionen anderer Proteine mit dem BRCA1-Protein [Hedenfalk et al, 2002; Somasundaram, 2003].

Die funktionellen Domänen spielen eine wichtige Rolle bei der transkriptionsgekoppelten Regulation. Direkt oder indirekt interagiert BRCA1 an ihnen mit Tumorsuppressoren, Onkogenen, Reparaturproteinen, Regulatoren des Zellzyklus und Aktivatoren und Inhibitoren der Transkription. N -terminal können BARD1 ( BRCA1-associated RING domain protein 1), BAP-1 ( BRCA1-associated protein 1) und E2F-1 (amyloid beta (A4) precursor protein- binding, family A, member 2 binding protein) binden. An die NLS binden RAD50, RAD51 (eucaryotic recombination and DNA repair protein 50 bzw. 51), p53, RB ( retinoblastoma protein) und c -Myc (v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog). Der C -Terminus interagiert u.a. mit RNA Polymerase II, p300/CBP (E1A binding protein p300 /CREB binding protein -Komplex), BRCA2, RNA-Helikase und CtIP ( retinoblastoma binding protein 8) [Hedenfalk et al, 2002; Somasundaram, 2003].

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BRCA1 mRNA und Protein wird in hohen Konzentrationen in sich teilenden Geweben exprimiert und ist in die Zellzykluskontrolle eingebunden. Die höchsten Expressionsraten von BRCA1 werden in der späten G1-Phase und der S-Phase, während der DNA-Replikation, im Zellzyklus erreicht. Höhere Konzentrationen konnten auch während der Mitose und in meiotischen Keimzellen nachgewiesen werden. [Chen et al, 1996]. Die Rolle von BRCA1 im Zellzyklus ist mittlerweile gut dokumentiert. Nachdem es zunächst dephosphoryliert vorliegt, wird BRCA1 in der späten G1-Phase und in der S-Phase des Zellzyklus durch CDK2-Zykline (CDK, cyclin- dependent kinase) phosphoryliert. In der M-Phase liegt es wieder dephosphoryliert vor [Ruffner et al, 1997 und 1999; Maclachlan et al, 2000; Somasundaram, 2003].

BRCA1 spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Genom-Integrität. Im Zusammenhang von Reparaturmechanismen interagiert BRCA1 neben Gadd45 ( growth arrest and DNA- damage-inducible, alpha) und p53 mit den Proteinen Rad51, BRCA2, Rad50- MRE11-NBS1 (MRE11, meiotic recombination 11 homolog A ; NBS1, Nijmegen breakage syndrome 1) und mit dem großen Proteinkomplex BASC (BRCA1-associated genome surveillance complex). p53 nimmt bei der Zellzykluskontrolle eine wichtige Funktion ein und entfaltet dabei Wirkung u.a. auf p21 (cyclin-dependent kinase inhibitor, Stopp des Zellzyklus) und Gadd45 (Reparaturprotein für durch Strahlung entstandene Schäden) oder kann Apoptose initiieren. BASC ist ein Multienzymkomplex, der sich aus zahlreichen an der DNA-Reparatur beteiligten Proteinen zusammensetzt. Dazu zählen beispielsweise MSH2, MSH6 (mut S homolog 2 bzw. 6) und MLH1 (mut L homolog 1) [Somasundaram, 2003]. BRCA1 ist zudem in transkriptionsgekoppelte Reparaturen eingebunden, die durch ionisierende Strahlung u nd oxidative Substanzen entstandene Schäden ausgleichen [Scully et al, 2000; Abbott et al, 1999]. Die für transkriptionsgekoppelte Reparaturen benötigte RNA Polymerase II bindet dabei an die BRCT-Domäne des BRCA1-Proteins. Schließlich lagern sich weitere für den Reparaturprozess benötigte Komponenten an [Hedenfalk et al, 2002]. Weiterhin ist BRCA1 an Mechanismen zur rekombinationsvermittelten Reparatur von Doppelstrangbrüchen beteiligt. Dabei wirkt es sowohl an der non-homologous end joining repair (NHEJ, Reparatur durch nicht homologen Bruchstückaustausch), als auch an der homologous recombinational repair (HRR, Reparatur durch homologe Rekombination) mit. Als Antwort auf ionisierende Strahlung wird NBS1 durch ATM phosphoryliert und der Komplex RAD50-MRE11-NBS1 gebildet, welcher für NHEJ und HRR gleichermaßen notwendig ist. Bei der homologous recombinational repair bindet BRCA1 direkt an die DNA und hemmt die Nuklease-Aktivität

8

des RAD50-MRE11-NBS1-Komplexes [Paull et al, 2001]. Damit verbindet BRCA1 vermutlich die Wirkung der Prozessierung der Bruchstückenden durch den RAD50-MRE11- NBS1-Komplexes mit der Wirkung von RAD51, das den Strangaustausch bei der homologen Rekombination durchführt [Moynahan et al, 1999 ; Scully et al, 2000; Hedenfalk et al, 2002].

Im BRCA1-Gen sind mehr als 500 Mutationen, Polymorphismen und Varianten beschrieben [HGMD (Human Gene Mutation Database)]. Dabei konnte eine Korrelation von vorhandener BRCA1-Mutation in der Keimbahn und Brustkrebserkrankung nachgewiesen werden. Hinweise auf Mutationen des BRCA1-Gens beim sporadischen Mammakarzinom sind derweil spärlich. Wenn überhaupt, wird eine wesentlich geringere Bedeutung als beim erblichen Mammakarzinom angenommen [Khoo et al, 1999; Li et al, 2002; Yang et al, 2002 (1); Rosen et al, 2003; Wooster et al, 2003]. Bei sporadischem Brust- und Eierstockkrebs scheint die Suppression der Transkription des BRCA1-Promotors bspw. durch Hypermethylierung bedeutsamer zu sein [McCoy et al, 2003].

Häufige Mutationen im BRCA1-Gen sind Substitutionen u nd kleine Deletionen. Auch größere Keimbahnmutationen, die durch homologe Rekombination der ALU-Sequenzen entstehen können, treten auf [ Vehmanen, 2001]. Die Mehrheit der Mutationen sind frameshift- oder nonsense-Mutationen, die einen vorzeitigen Abbruch der Translation bewirken. Der Verlust beider Allele des BRCA1-Gens in der Keimbahn wirkt im Mäuseversuch letal [Ludwig et al, 1997]. Populationsabhängig sind die einzelnen Mutationen mit stark divergierenden Häufigkeiten vertreten. In der deutschen Bevölkerung sind die Mutationen 5382insC und 300T→G des BRCA1-Gens besonders weit verbreitet [ German Consortium for Hereditary Breast and Ovarian Cancer, 2002].

1.3.2. BRCA2 – breast cancer susceptibility gene 2

BRCA2 liegt auf Chromosom 13 (13q12.3) und codiert mit 27 Exons für ein Protein aus 3418 Aminosäuren (Molekulargewicht 384 kDa) [Wooster et al, 1995; Bertwistle et al, 1999; Hunt, 2001 (1) and (2)]. Die Gensequenz von BRCA2 beinhaltete wie BRCA1 ebenfalls 47% repetitive DNA. ALU-Elemente haben daran einen Anteil von 20% [Welcsh et al, 2001]. Wie BRCA1 ist das BRCA2-Protein durch eine Kernlokalisierungs-Domäne gekennzeichnet, die sich bei BRCA2 C-terminal befindet. Weitere Sequenzmerkmale sind BRCs (acht Motive mit einer großen Sequenzhomologie, codiert im Bereich des Exons 11) und eine N -terminale

9

Transaktivierungsdomäne. NLS, BRCs und N -terminale Transaktivierungsdomäne stellen wichtige Anknüpfungspunkte interagierender Proteine dar (Abb. 5).

Abb. 5: Schematische Darstellung des BRCA2-Proteins; mit den strukturellen Besonderheiten

NLS (nuclear localization sequence), Transaktivierungsdomäne und BRC-Domänen (acht Motive

mit einer großen Sequenzhomologie, codiert im Bereich des Exons 11) und Interaktionen anderer Proteine mit dem BRCA2-Protein [Hedenfalk et al, 2002].

Die Funktion von BRCA2 ist im Vergleich zu BRCA1 wenig untersucht. Es gilt jedoch als sicher, dass es ebenfalls tumorsuppressive Wirkungen zeigt. Es interagiert mit Rad51 [Wong et al, 1997; Kowalczykowski, 2002; Pellegrini et al, 2002], p53 [Marmorstein et al, 1998] und BRAF35 ( BRCA2-Associated Factor 35) [Marmorstein et al, 2001], die an DNA-Reparaturmechanismen beteiligt sind. Als regulatorische Komponente ist BRCA2 an der homologous recombinational repair beteiligt. Bei der HRR wird mit Hilfe der Sequenz des homologen DNA-Stranges ein Doppelstrangbruch (DSB) repariert. Nicht oder falsch reparierte DSB wirken letal oder mutagen. Im Gegensatz zu BRCA1, dem die Beteiligung an der transkriptionsgekoppelten Reparatur, der HRR und der NHEJ nachgewiesen werden konnte, bleibt die BRCA2-Aktivität auf die HRR beschränkt [Xia et al, 2001]. Zusammen mit Rad51 ist BRCA2 an einem Multienzymkomplex beteiligt, dem auch BRCA1 und BARD angehören. BRCA2 hemmt die ATP-Hydrolyse-Aktivität von Rad51 und seine Fähigkeit DNA zu binden. Entscheidend scheinen bei der Interaktion die BRC-Motive zu sein. Sechs der acht BRC-Motive zeigen Affinität zu Rad51 [Arnold et al, 2001; Xia et al, 2001; Pellegrini et al, 2002]. Mutationen im BRCA2-Gen führen zu einer Empfindlichkeit g egenüber genotoxischen Substanzen und zu Chromosomen-Instabilität [Xia et al, 2001; Donoho et al, 2003]. Abbildung 6 fasst Interaktionen in der HRR, an denen BRCA1 und BRCA2 beteiligt sind, und Auswirkungen von Mutationen zusammen (Abb. 6).

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Abb. 6: Die Rolle von BRCA1 und BRCA2 in der HRR (homologous recombinational repair): (a) Das Modell setzt einen Protein-Komplex aus den Komponenten BRCA1, BRCA2, BARD1 und Rad51 voraus. Einleitender Schritt bei der Komplexbildung ist die Phosphorylierung (P = Phosphatgruppe) von BRCA1 durch die Kinase ATM. In Reaktion auf einen festgestellten Doppelstrangbruch (durch p53) bindet der Proteinkomplex an die DNA (Erkennung über PCNA (proliferating cell nuclear antigen)) und repariert sie. (b) Ein Verlust der Funktion von B RCA1 oder BRCA2 verhindert eine Reparatur. Ist das Zellzyklus- kontrollierende Genprodukt p53 von einem Funktionsverlust betroffen, können Wachstums- stopp (p21) und Reparaturmechanismen nicht eingeleitet werden [Arnold et al, 2001].

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