Altersabhängige Veränderung von Immunsystem und Verhalten weiblicher Tupajas (Tupaia belangeri)

Für Ulrike

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1  Einleitung  1

1.1  Warum wurde diese Untersuchung an Tupaia belangeri durchgeführt  2

1.2  Physiologische Veränderungen im Alter  3

1.3  Verhalten im Alter  3

1.4  Altersabhängige Reaktionen auf Stress  4

1.5  Fragestellung  5

2  Tiere Material Methoden  6

2.1  Tiere  6

2.2  Haltungsbedingungen  7

2.3  Versuchsdurchführung  9

2.3.1  Versuchsteil 1: Veränderung im Alter unter Haltungsbedingungen  9

2.3.2  Versuchsteil 2: Altersabhängige Veränderung der Reaktion auf nicht  

  sozialen Streß  9

2.4  Verhaltensuntersuchungen  10

2.4.1  Verhaltensaufnahme in den Haltungsräumen  10

2.4.2  Verhaltensaufnahme in den Versuchsräumen  10

2.4.3  Aufgenommene Verhaltensweisen  11

2.4.4  Auswertung der Videoaufnahmen  12

2.5  Aufnahme physiologischer Daten  12

2.5.1  Körpermasse  12

2.5.2  Blutabnahme  12

2.5.3  Immunologische und hämatologische Untersuchungen  14

2.5.3.1  Zellzahlbestimmung  14

2.5.3.2  Zellpopulationen des Vollblutes ( Differentialblutbild)  14

2.5.3.3  Gewinnung Lymphozyten-Suspension  

  (Dichtegradientenzentrifugation)  16

2.5.3.4  Lymphozytentransformationstest (LTT) von isolierten Zellen  17

2.5.3.5  Lymphozytentransformationstest mit Vollblut  18

2.5.3.6  In vitro-Phagozytosekapazität (Chemilumineszenstest) aus Vollblut  20

2.5.3.7  Klassische Komplementbindungsreaktion (CH 50 -Test)  21

2.5.4  Endokrine Untersuchungen  25

2.6  Mathematik Statistik und Darstellungsweise  28

3  Ergebnisse  29

3.1  Ergebnisse unter Haltungsbedingungen (Versuch 1)  29

3.1.1  Altersabhängige Unterschiede im  Verhalten

  (Haltungsbedingungen)  29

3.1.2  Physiologische Veränderungen in Abhängigkeit vom Alter (unter  

  Haltungsbedingungen)  33

Inhaltsverzeichnis

3.1.2.1  Körpergewicht  33

3.1.2.2  Immunologische und hämatologische Parameter  33

3.1.2.3  Endokrine Parameter  36

3.2  Vergleich der Ausgangswerte von 8 Uhr und 12 Uhr  38

3.3  Altersabhängige Reaktionen auf nicht sozialen Stress (Versuch 2)  39

3.3.1  Altersabhängige Unterschiede im Verhalten  39

3.3.2  Altersabhängige Veränderung der Reaktion physiologischer Parameter  

  (Umsetzphase)  41

3.3.2.1  Körpermasse  41

3.3.2.2  Immunologische und hämatologische Parameter  42

3.3.2.3  Endokrine Parameter  43

4  Diskussion  46

4.1  Altersabhängige Veränderungen unter Haltungsbedingungen  46

4.1.1  Verhalten  46

4.1.2  Physiologie  48

4.2  Altersabhängig veränderte Reaktionen auf den Umsetzversuch  52

4.3  Schlussbetrachtung  54

5  Zusammenfassung  55

6  Anhang  56

6.1  Verwendete Abkürzungen  56

6.2  Geräte  57

6.3  Originaldaten  58

6.3.1  Versuch 1 (Haltungsbedingungen)  58

6.3.1.1  Verhaltensdaten  58

6.3.1.2  Physiologische Daten  59

6.3.2  Versuch 2 (Umsetzphase)  63

6.3.2.1  Verhaltensdaten  63

6.3.2.2  Immunologische und hämatologische Parameter  64

7  Literaturverzeichnis  70

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Einleitung

1 Einleitung

Aging is: „an increased liability to die, or an increasing loss of vigour, with increa-

sing chronological age, or with the passage of the life cycle“ (COMFORT, 1960)

Sollte die derzeitige demographische Entwicklung eines generellen Geburtenrück- gangs und einer wachsenden Lebenserwartung im Alter keine Änderung erfahren, sagen Prognosen eine dramatische „Überalterung“ der westlichen Gesellschaft vor- aus: Ein fünftel der Bürger wird dann über 65 Jahre alt sein (FURGUSON 1995; MAC

GREGOR 1990). Diese Entwicklung wird insbesondere auf viele medizinische Fort-

schritte in der Vorbeugung und Behandlung von infektiösen Erkrankungen zurückge- führt.

Doch trotz der zentralen Bedeutung des Alterns für den Menschen sind die physio- logischen Mechanismen, die zum Altern der Lebewesen und letztlich zu ihrem Tod führen, weitgehend unbekannt. Zwar gibt es die verschiedensten Hypothesen über die dem Altern zu Grunde liegenden Prozesse, doch keine kann auch nur einigerma- ßen als belegt oder allgemein gültig gelten. Selbstverständlich müssen Altern und Seneszenz letztlich auf Prozesse zurückzuführen sein, die auf zellulärer und subzellu- lärer Ebene ablaufen. Entsprechend werden gerade derartige Prozesse in vivo und - insbesondere - in vitro sehr intensiv untersucht (z.B. an Zellkulturen von Fibroblasten). Doch muss man sich über die Grenzen dieses Forschungsansatzes ge- rade im Bereich der Altersforschung im Klaren sein: Unterschiedliche Zelltypen altern selbst in vitro sehr unterschiedlich, in vivo gibt es sogar Zellen, die kaum altern, ob- wohl sie sich nicht teilen können (Nervenzellen). Es ist auch keineswegs geklärt, ob nicht eher eine Verschlechterung zentralnervöser oder endokriner, immunologischer oder sonstiger Regulationsprozesse für das Altern verantwortlich ist, als definierte zelluläre Prozesse (Übersicht: ARKING 1991; S. 283-284).

So stirbt heute etwa die Hälfte aller Menschen westlicher Industrienationen an Herz- kreislauferkrankungen, an deren Entstehung neben genetischen Prädispositionen Umweltfaktoren einen entscheidenden Anteil haben. Es nehmen jedoch auch solche Erkrankungen zu, die für ältere Menschen typisch sind und an deren Entstehung oder Verlauf das Immunsystem beteiligt ist, wie die verschiedensten Krebsformen sowie Autoimmunkrankheiten (MC GLAUCHLEN & VOGEL 2003). In wieweit die Zunah- me dieser Erkrankungen jedoch altersbedingt ist oder auf Außeneinflüsse zurück-

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Einleitung

geht, die im Laufe des Lebens auf die Individuen einwirken, kann nicht entschieden werden, zumal sich gerade beim Menschen Ernährungs- und Lebensgewohnheiten ebenso wie verschiedene Umwelteinflüsse in den letzten Jahrzehnten stark verändert haben.

Um daher Aufschluss über altersabhängige Veränderungen zu erlangen, müssen Untersuchungen an Tieren durchgeführt werden, die unter standardisierten Bedin- gungen (konstantes Klima und Temperatur) gehalten werden. Dies ist jedoch aus finanziellen Gründen meist nur an relativ kurzlebigen Standardlabortieren wie Labor- ratten und Labormäusen möglich.

Im Rahmen meiner Diplomarbeit untersuchte ich daher altersabhängige Verände- rungen an weiblichen Tupajas (Tupaia belangeri), die von ihrer Geburt an unter kon- stanten Laborbedingungen gehalten worden waren.

1.1 Warum wurde diese Untersuchung an Tupaia belangeri durch-

Die in diesem Versuch eingesetzten Tupaia belangeri gehören zur Ordnung Scan- dentia (Spitzhörnchen), welche in 5 Gattungen mit insgesamt 19 Arten eingeteilt wird. Spitzhörnchen sind etwa eichhörnchengroße, tagaktive Säugetiere, die in Süd- ostasien weit verbreitet sind. Dort leben sie als Paare in festen Revieren, welche sie gegen Artgenossen des gleichen Geschlechts heftig verteidigen (KAWAMICHI & KAWA-

MICHI 1979). Sie ernähren sich von Insekten, Früchten, Samen und Knospen (MARTIN

1968).

Spitzhörnchen sind besonders in den Focus von Altersforschern geraten, weil sie phylogenetisch (Karyogramm Vergleiche) näher mit dem Menschen verwandt sind als dies Mäuse und Ratten sind (MÜLLER et al. 1999; PRIMMER 2002). Zudem werden Tupajas für ein Tier ihrer Größe sehr alt. Neuere Untersuchungen legen sich auf ein maximales Lebensalter abhängig von der Art auf 10-14 Jahre fest (PRIMMER 2002). Die in der Studie verwendete Art (Tupaia belangeri) ist anderen Scandentia Arten aufgrund der stabilsten Sterberate in den ersten 3-4 Lebensjahren als Modelorga- nismus vorzuziehen. Zudem werden sie schon seit den sechziger Jahren intensiv un- tersucht (V. HOLST 1972, 1998), es liegen daher umfassende Kenntnisse über ihr Ver-

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Einleitung

halten (u.a. SPRANKEL 1961; MARTIN 1968; V. HOLST 1975, 1997) und die verschiedens- ten physiologischen Parameter vor. Zudem ist es möglich, Tupajas einzeln zu halten; dies gestattet es, ihr Verhalten ohne Störungen (z.B. durch Interaktionen mit Artge- nossen) aufzuzeichnen.

1.2 Physiologische Veränderungen im Alter

Das Immunsystem unterliegt im Alter vielfältigen Veränderungen (GLOBERSON &

EFFROS 2000). Dies ist vor allem für den Menschen von großer Bedeutung, da mit der

Alterung Erkrankungen zunehmen, an deren Entstehung und Verlauf das Immunsys- tem beteiligt ist (s. oben). Untersuchungen über derartige altersabhängige Verände- rungen wurden unter standardisierten Laborbedingungen u. a. an Mäusen durchge- führt (HIROKUWA & UTSAMA 2002). Die Autoren fanden eine signifikante Verschlechte- rung der Lymphozytenproliferationsfähigkeit mit zunehmendem Alter; ebenso wie zuvor bei Hunden auch STRASSER et al. (2000: Labrador Retriever). Entsprechende Befunde stammen auch von Pavianen (JAYASHANKAR 2003) und dem Menschen (KRAUSE et al. 1999; STRAUB 2001). Das spezifische Immunsystem nimmt also in seiner Aktivierbarkeit ab. Strasser et al. (2000) fanden zudem eine höhere Komplementak- tivität bei Hunden im Alter.

Auch endokrine Parameter dürften altersabhängigen Veränderungen unterliegen, allerdings sind die Befunde widersprüchlich: Während manche Autoren z.B. bei La- borraten erhöhte Serumkonzentrationen von Corticosteron im Alter fanden, konnten andere Untersuchungen diese Befunde nicht bestätigen (Übersicht MASARO 1995). Diese Widersprüche könnten auf Unterschieden in Geschlecht oder Stamm der un- tersuchten Tiere beruhen (De KLOET 1992) oder auf unterschiedliche Zeitpunkte der Blutentnahmen. Im Vergleich hierzu sind Befunde bei Primaten einheitlich: Mensch, Rhesusaffen und Makaken zeigen keine erhöhten Cortisol-Werte im Alter.

1.3 Verhalten im Alter

Das Alter hat natürlich auch einen entscheidenden Einfluss auf das Verhalten von Individuen. Eine Untersuchung an Primaten zeigte eine Abnahme des Sexualverhal- ten und des aggressiven Verhalten gegenüber gleichaltrigen Artgenossen (AUJARD &

PERRET 1998). Untersuchungen an weiblichen Ratten zeigten eine Abnahme der

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Einleitung

Fellpflege (SCIMONELLI et al. 1998). Weiterhin fanden diese und andere Autoren (CHEN 2000; MEAD 1994; GATTERMAN 2003; EMBORG 1998) eine Abnahme der Loko- motion mit dem Alter bei Mäusen, Gerbils, Goldhamstern und Rhesus Affen. Ver- gleichbare Veränderungen belegen SIWAK et al. (2002) bei Hunden: Junge Beagle waren wesentlich aktiver, spielten mehr und erkundeten eine neue Umgebung stär- ker als ihre älteren Artgenossen. Bei älteren Tieren ging die Abnahme der Lokomoti- on mit längeren Ruhephasen einher.

1.4 Altersabhängige Reaktionen auf Stress

Stress hat genau wie das Altern Einfluss auf das Immunsystem. Werden Tiere ir- gendeiner Belastung ausgesetzt, zeigen sie verschiedene Stresssymptome. Der dabei wirkende Stress kann z. B. durch Artgenossen ausgelöst werden. Hierbei spielen vor allem Konfrontationen eine wichtige Rolle, bei denen Dominanzbeziehungen zwi- schen gleichgeschlechtlichen Artgenossen geklärt werden (V. HOLST 1972). Der Stress führt zu Verhaltensänderungen der unterlegenen Tiere; dies äußert sich beispielswei- se in einer Reduktion ihrer Mobilität (v. HOLST 1972). Veränderungen zeigen sich auch auf physiologischer Ebene. Bei Stress kommt es zu einer Abnahme der Körper- masse (ZELENA 1999), einem Absinken der Lymphozytenzahl und deren Aktivierbar- keit (V. HOLST 1997; KAISER 1996; STEFANSKI 2001). Eine Abnahme der Aktivität fand man auch bei den Natürlichen Killerzellen (STEFANSKI 1998) und beim Komplement- system (COE 1988). Stress ist zudem mit einem Anstieg der Nebennierenrindenhor- mone verbunden (AYENSU et al. 1994; COLLINS 1997; OTTEN et al. 2002).

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Einleitung

1.5 Fragestellung

In dieser Arbeit sollten weibliche Tupaia belangeri hinsichtlich möglicher altersab- hängiger Veränderungen in ihrem Verhalten und einigen physiologischen Parame- tern untersucht werden.

Es wurden folgende Fragestellungen bearbeitet:

1. Zeigen Tupajas mit zunehmendem Alter Veränderungen in ihrem Verhalten?

2. Finden sich bei Tupajas Zusammenhänge zwischen Alter und Immunparame-

tern?

3. Verändern sich endokrine Parameter im Alter?

4. Reagieren Tupajas altersabhängig unterschiedlich in ihrem Verhalten und ei-

nigen physiologischen Parametern auf eine leichte, nicht soziale Belastung?

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Tiere, Material & Methoden

2 Tiere, Material & Methoden

2.1 Tiere

Als Versuchstiere wurden insgesamt 36 weibliche Tupajas (Tupaia belangeri) ver- wendet, die ausschließlich der institutseigenen Zucht des Lehrstuhls für Tierphysiolo- gie in Bayreuth entstammten. Die Tiere waren zu Beginn der Untersuchung zwischen

3 Monaten und 7 Jahren alt. Ein Teil der Tiere war sozial unerfahren. Tabelle 1 gibt

das Alter der Versuchstiere wieder.

Tabelle 1: Aufstellung aller Tiere und deren Alter mit Geburtsdatum.

7

Tiere, Material & Methoden

Fortsetzung Tabelle 1: Aufstellung aller Tiere und deren Alter mit Geburtsda-

2.2 Haltungsbedingungen

Vor und während des Versuchs lebten die Tiere in Einzelkäfigen (69×49×49cm; Ei- genbau) mit Front-, Decken-, und Bodengittern aus rostfreien Drahtgitter und Sei- tenwänden aus Holz.

Die Haltungskäfige waren mit einem Kletterast, einem Futterkasten, einer Wasserfla- sche und einem verschließ und abnehmbaren Schlafkasten ausgestattet der auch dem Transport der Tiere diente. Unter den Käfigen befanden sich Kotwannen, die monatlich gewechselt wurden.

Alle Versuchstiere waren in Käfigen der oben beschriebenen Bauart, in insgesamt 8 verschiedenen Räumen unter identischen Haltungsbedingungen untergebracht. In den Haltungsräumen herrschte ein künstlicher Tag-Nacht-Rhythmus von 12:12 Stunden (Hellphase: von 10.00-22.00 Uhr). Die Raumtemperatur betrug 25±1°C bei einer relativen Luftfeuchte von 40-60%. Den Tieren stand Wasser und standardisier-

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Tiere, Material & Methoden

tes Futter (altromin® 6023, Haltungsdiät Affen, Altromin GmbH) ad libitum zur Ver- fügung.

Für die Versuche unter Einfluss von nicht sozialem Stress („Umsetzversuche“) wurden die Tiere aus den Haltungsräumen in Versuchsräume mit speziellen Beobachtungskä- figen umgesetzt. Diese entsprachen in ihrem Aufbau zwei spiegelverkehrt aneinan- dergesetzten Haltungsraumkäfigen; Trinkflaschen, Schlaf und Futterkästen waren an der Rückfront abnehmbar angebracht, Bodendraht und Kotwanne waren durchge- hend. Die Käfighälften waren durch eine Holzwand getrennt. Ein Sichtkontakt zwi- schen den 2 Tieren in einem Beobachtungskäfig war nicht möglich.

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Tiere, Material & Methoden

2.3 Versuchsdurchführung

Diese Untersuchung besteht aus zwei Versuchsteilen.

2.3.1 Versuchsteil 1: Veränderung im Alter unter Haltungsbedin-

Von allen 36 Tieren wurden individuelle Werte der untersuchten physiologischen Parameter bestimmt. Diese Werte werden im Folgenden als 8h Ausgangswert (AGW 8h ) bezeichnet.

Mindestens vierzehn Tage nach der Blutabnahme wurde von jedem Versuchstier eine gesamte Aktivitätsphase (12h, 10.00-22.00 Uhr) im Heimatkäfig mit einer Vi- deokamera aufgezeichnet.

2.3.2 Versuchsteil 2: Altersabhängige Veränderung der Reaktion

auf nicht sozialen Streß

Im zweiten Versuchsteil wurden die Tiere einer akuten nicht sozialen Stresssituation ausgesetzt. Hierfür wurden die Tiere zu Beginn der Hellphase für zwei Stunden (10.00-12.00 Uhr) in eine ihnen unbekannte Umgebung umgesetzt (Versuchsräume). Das Verhalten der Tiere wurde über die gesamte Dauer der Umsetzphase als Video- aufnahme festgehalten.

Im Anschluss an die Umsetzphase (12h) wurde von allen Tieren eine Blutprobe ent- nommen, um individuelle Werte der untersuchten physiologischen Parameter zu bestimmen.

Mindestens vierzehn Tage vor dem zweiten Versuchteil wurden von jedem Tier die physiologischen Parameter um 12 Uhr bestimmt (AGW 12 ).

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Tiere, Material & Methoden

2.4 Verhaltensuntersuchungen

Von den Versuchstieren wurden in ihren Heimatkäfigen und während der Zeit in den Versuchsräume (Umsetzphase) das Verhalten mit Hilfe einer Videokamera aufge- zeichnet.

2.4.1 Verhaltensaufnahme in den Haltungsräumen

Das Verhalten der Tiere in ihrem Haltungskäfig wurde mit Hilfe einer über dem Käfig angebrachten Miniatur-Kamera aufgezeichnet mit der alle Bereiche des Käfigs ein- gesehen werden konnten.

Die Kamera wurde bereits 24 Stunden vor der Aufzeichnung am Käfig montiert, da Vorversuche gezeigt hatten, dass nach dieser Zeit der Gewöhnung ein unbeeinfluss- tes Verhalten der Tiere zu beobachten ist.

2.4.2 Verhaltensaufnahme in den Versuchsräumen

Die Versuchsräume waren durch eine Trennwand mit einer verspiegelten Einweg- scheibe in einen eigentlichen Versuchsraum, in dem sich der Beobachtungskäfig be- fand, und einen Beobachtungsraum getrennt. Im Beobachtungsraum wurde eine Videokamera mit Stativ eingesetzt, um das Verhalten der Tiere auf Videoband aufzu- zeichnen.

11 Tiere, Material & Methoden

2.4.3 Aufgenommene Verhaltensweisen

Bei der Auswertung mittels point-sampling wurden die unterstrichenen Verhaltens-

weisen aufgenomen, die übrigen Verhaltensweisen wurden nur bei der detaillierten

continous-sampling Methode berücksichtigt.

„Ruhen“ : Das Tier liegt mit geschlossenen Augen auf dem

„Trinken“: Jede Aufnahme von Wasser aus den Trinkflaschen

„Putzen“: Das Tier reinigt sich mit Hilfe seiner Zähne, Pfoten

„Lokomotion“: Das Tier verändert seine Position um mindestens

oder Ast

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Tiere, Material & Methoden

2.4.4 Auswertung der Videoaufnahmen

Sowohl das Verhalten der Tiere in den Haltungsräumen (12 Stunden), als auch die Phase des „Umsetzens“ (2 Stunden) wurden auf Videoband aufgezeichnet und aus- gewertet.

Die Bestimmung von Verhaltensanteilen geschah mit einer Kombination aus „point- sampling“ für langandauernde- und „continuous-sampling für kurze Verhaltenswei- sen gewählt. Aufgrund von Erfahrungswerten wurde bei der „point-sampling“ Me- thode im Intervall von einer Minute während der gesamten Lichtphase vermerkt, welche Verhaltensweise die Tiere zu genau diesen Zeitpunkten zeigten. Die Anzahl der kurzen Verhaltensweisen (Turnen, Markieren) wurde über die gesam- te Lichtphase gezählt.

2.5 Aufnahme physiologischer Daten

Die einzelnen Testverfahren und ihre Bedeutung werden im Folgenden beschrieben. Alle verwendeten Geräte werden im Anhang aufgeführt.

2.5.1 Körpermasse

Die Tiere wurden mit Hilfe einer elektronischen Waage auf ±1g gewogen.

2.5.2 Blutabnahme

Materialien

- Skalpellklingen (doppelseitig)

- Heparinlösung ( 620 IU in 0,9% NaCl-Lösung; Sigma)

- 5ml –Spritzen (Becton-Dickinson) mit 0,5 ml Heparinlösung

- Reaktionsgefäß (1,5ml; Eppendorf)

- K 2 -EDTA-Lösung (500mg/0,9%NaCl ml; Sigma)

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Tiere, Material & Methoden

Durchführung

Die Blutabnahmen für den 1. Versuchsteil erfolgten jeweils um 8 Uhr, d.h. zwei Stunden vor Beginn der Aktivitätsphase. Die Blutabnahmen für den 2. Versuchsteil erfolgten um 12 Uhr, also jeweils direkt nach der „Umsetzphase“, bzw als Aus- gangswert 14 Tage vor Versuchsbeginn.

Die Tiere wurden in ihrem Schlafkasten eingesperrt und in ein Labor gebracht. Dort wurde der Schwanz mit Vaseline eingerieben und mit Hilfe einer doppelseitigen Skalpellklinge der Schwanzvenenplexus punktiert. Das austretende Blut wurde wie folgt verteilt:

Ca. 300µl in ein mit 10µl K 2 -EDTA-Lösung befülltes Reaktionsgefäß, zur Bestim- mung der Leukozytenzahl, ca. 200µl in ein leeres Reaktionsgefäß zur Bestimmung der Kortikosteroide und Ös- trogen-Konzentration, ca. 50µl in ein Reaktionsgefäß ohne Antikoagulans zur Bestimmung der Komple- mentaktivität, ca 500µl in eine mit 500µl Heparin-Lösung befüllte 5ml Spritze zur Bestimmung im- munologischer Parameter.

Die Entnahme der Proben für die Hormon-Bestimmungen war stets innerhalb von drei Minuten nach Betreten des Haltungs- bzw. Versuchsraumes abgeschlossen (sie- he: 2.6.4)