Automatisierung der morphometrischen

Analyse des Neokortex von

Tau-transgenen Mäusen

Miriam Kreyenborg

Cognitive Science, Universität Osnabrück

Bachelorarbeit

12. Juni 2008

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Danksagungen

Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr. R. Brandt für die freundliche Überlassung des Themas, die Begutach-

tung meiner Arbeit und für die stetige Hilfsbereitschaft. Ohne seine freundliche Unterstützung wäre ein

Fertigstellen dieser Arbeit nur schwer möglich gewesen.

Der Arbeitsgruppe Neurobiologie möchte ich für die freundliche Aufnahme, die Anregungen und die

schöne Zeit während meiner Bachelorarbeit danken. Die nette Atmosphäre hat das Arbeiten um einiges

erleichtert und angenehmer gemacht.

Mein besonderer Dank gilt Frau Dr. Monika Hundelt für die gute Betreuung und großartige Hilfe,

ohne die meine Bachelorarbeit nicht möglich gewesen wäre. Vielen Dank für die schönen Stunden, den

regen Austausch und die bereichernden Diskussionen. Die Ratschläge haben mir sehr geholfen und die

Zusammenarbeit hat viel Spaß gemacht. Danke auch für die Übernahme der Zweitbegutachtung meiner

Arbeit.

Ich danke auch herzlich Karolin Selle und Frederik Sündermann. Danke, dass ihr für meine Fragen

immer ein offenes Ohr hattet. Danke auch für eure Korrekturlesung. Karo, Lena und ich danken dir auch

vielmals für das Babysitting.

Danke auch an Andrea Albrecht und Melissa Linkert für die Mitarbeit am Programm.

Schließlich danke ich meinen Freunden und meiner Familie für die Unterstützung während meiner

Bachelorarbeit. Besonderer Dank gilt hierbei meinem Freund David Liebl, der mich immer wieder mo-

tiviert und aufgebaut hat und schließlich meiner Freundin Meike Aulbach. Vielen Dank Meike, dass du

mich immer beraten hast und ich mit Problemen zu dir kommen durfte. Für deine Hilfe, deinen Rat und

deinen Beistand, vielen vielen Dank.

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Zusammenfassung

Die Alzheimer-Krankheit ist eine degenerative Hirnerkrankung mit progredienter Hirnatrophie (bis zu

zehn Prozent) unter Bildung bestimmter pathologischer Veränderungen im Gehirn. Tau bildet im Gehirn

von Alzheimer-Patienten fibrilläre Aggregate (,,neurofibrillary tangles", NFTs) in Neuronen und krank-

heitstypische Tauformen (,,paired helical filaments", PHFs) im Gehirn. Dies führt zu einer Fehlfunktion

der Mikrotubuli, was wahrscheinlich zum Zelltod der Neurone in Tauopathien wie bei Alzheimer führt.

Um mehr über die Hintergründe zu erfahren, die den Gewebsverlust verursachen, wurde der Neokortex

(NC) von tau-transgenen Mäusen, so wie der von nicht-transgenen Kontrolltieren morphometrisch ana-

lysiert. Dabei wurden Mäuse verwendet, die transgen für Wildtyp-Tau oder für eine pseudohyperphos-

phorylierte Variante von Tau (PHP-Tau) waren. Hierbei wurden sowohl die Dichte als auch die Größe

der Neurone im NC bestimmt.

Für die Analyse wurden Hirnschnitte in 50 µm Dicke angefertigt, in denen die Nervenzellkörper

durch NeuN Immunfärbung deutlich sichtbar sind. Nach Erstellen von Bildern des gewünschten Ana-

lysebereiches mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop wurde die Bildserie mit der Software

ImageJ bearbeitet. Da die Bestimmung der Neuronenanzahl sowie der Neuronendichte von jedem ein-

zelnen Bild erfolgen muss, war diese Art der Analyse sehr zeitaufwendig. Ziel der Arbeit war es, die

morphometrische Analyse zu automatisieren und eine neue Analysemethode zu etablieren. Dies wurde

erreicht, in dem zwei Plugins geschrieben wurden, die es ermöglichen einen Arbeitsschritt auch an ei-

ner Bildserie anwenden zu können. Die Automatisierung gewährleistet so eine schnelle und fehlerfreie

Analyse, da Bearbeitungsfehler auf ein Minimum reduziert werden. Dadurch wird eine effiziente und

standardisierte Bearbeitung des gesamten Datensatzes möglich.

Da es Untersuchungen gibt, die die Veränderung im Gehirn in Zusammenhang mit der Region fest-

stellten, wurden die verschiedenen Faktoren nur innerhalb der gleichen Region untersucht. Die Unter-

suchung der ausgezählten Polygone ergab altersunabhängig keine geschlechtsspezifische Auswirkung

auf die Neuronengröße, oder -dichte in den verschiedenen Regionen. Eindeutigen Unterschiede konnten

jedoch in der Neuronendichte der Regionen (Region 3 hat eine höhere Dichte als Region 1 und 2) bei

C57 und Wildtyp-Tau Mäusen festgestellt werden. PHP-Tau Mäuse folgen diesem Trend nicht, PHP-Tau

scheint aber einen anderen Effekt auf den Kortex zu haben. Eine alterspezifische Untersuchung ergab ei-

ne mit zunehmendem Alter steigende Neuronendichte bei gleichzeitiger Abnahme der durchschnittlichen

Neuronengröße.

Um weitere Aussagen treffen zu können, ist eine weitere Analyse mit einem größeren Datensatz mit

mehr Individuen nötig.

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Abstract

Alzheimer′s Disease (AD) ist a common type of dementia and characterized by progressive loss of neu-

rons and synapses in the cerebral cortex and certain subcortical regions. This results in gross atrophy (up

to ten percent) of the affected regions. Tau proteins are microtubule-associated proteins (MAPs) which

become characteristically altered both functionally and structurally in tauopathies such as AD. The alte-

rations of tau cause neuronal degeneration. In order to study the cause of the brain decay the neocortex

of non-transgenic and transgenic mice was analyzed morphometrically. For the analysis, mice were used

that were transgenic for wildtype tau (wt-tau) or a pseudohyperphosphorylated tau variant (PHP-tau).

The morphometric analysis included both the density of the neurons and the average size of the neurons.

For analysis 50 µm thin brain sections were used. Neuronal cell bodies were stained through NeuN.

After creating pictures on a confocal laser-scanning microscope the files were processed with ImageJ.

Since density and average size have to be obtained from every single picture this analysis took a lot of

time. The thesis′ purpose was to automatize the morphometrical analysis and to establish a new method

for that. This was achieved by programming two plugins which enable to not only apply every work step

to one image but also to a series of files. The automation provides for quick and error free analysis, since

defects in workmanships are reduced to a minimum. This allows efficient and standardized processing.

Investigations show that different brain regions are differentially effected during AD. Therfore regions

were only compared among one another. The investigation of the enumerated polygons did not show any

gender impact in density or average size of the neurons. Definite effects could be seen among the neuron

density in the different regions (region 3 has a higher density than region 1 and 2) for C57 and wt-tau

mice. PHP-tau mice did not follow this lead. This could be an indication of a different effect oh PHP-tau

on the cortex. An age specific investigation showed increasing density together with decreasing average

size.

To further specify the results a larger data set with more individuals would be necessary.

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Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

8

1.1. Alzheimerkrankheit .

10

1.2. Tau .

12

1.2.1. PHP-Tau .

14

1.3. Transgene Mäuse .

16

1.4. Hintergrund der Arbeit .

16

1.5. Ziel der Arbeit .

18

2. Material und Methoden, Datenaufbereitung

20

2.1. Material .

20

2.1.1. Chemikalien .

20

2.1.2. Puffer und Stammlösungen .

21

2.1.3. (Transgene) Mäuse .

22

2.1.4. Konfokales Laserscanning-Mikroskop .

23

2.1.5. Software .

25

2.2. Methoden .

26

2.2.1. Präparation der Mausgehirne .

26

2.2.2. Koronarschnitte .

27

2.2.3. Immunfärbung von Schnitten .

28

2.2.4. Konfokale Laserscanning-Mikroskopie .

29

2.3. Datenaufbereitung .

31

2.3.1. Bildanalyse .

31

2.3.2. Umwandlung in TIFF mit EZ-Limo .

32

2.3.3. Bearbeitung mit ImageJ .

33

2.3.4. Statistische Auswertung mit R .

37

3. Ergebnisse

38

3.1. ImageJ - Plugins (NeuN1 & NeuN2) .

38

3.1.1. Manuelle Bildbearbeitung .

38

3.1.2. Grundlage für das Plugin .

39

3.1.3. Probleme .

39

3.2. Entwicklung von NeuN1 und NeuN2 .

45

3.2.1. Handhabung Plugin .

48

3.2.2. Fazit .

52

6

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3.3. Statistische Auswertung mit R - Ergebnis .

52

3.3.1. Extraktion der Daten .

52

3.3.2. Ergebnisdateien .

53

3.3.3. Höhere Neuronendichte in Region 3 als in Region 1 und 2 in Linie C57 und 4WT1 55

3.3.4. Neuronendichte und durchschnittliche Größe der Neurone sind vom Geschlecht

unabhängig .

60

3.3.5. Mit steigendem Alter steigt die Neuronendichte und sinkt die Größe der Neurone

64

4. Diskussion

68

5. Zusammenfassung und Ausblick

71

Anhang

73

A. Abkürzungsverzeichnis

73

B. Tabellenverzeichnis

75

C. Abbildungsverzeichnis

75

D. Tabellarische Zusammenstellung der den Graphen zu Grunde liegenden Daten

81

E. Anleitung

92

F. Literatur

103

7

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1. Einleitung

Das menschliche Gehirn ist einzigartig und ohne Zweifel das komplizierteste Organ, das die Evolution je

hervorgebracht hat. Unser Gehirn verleiht uns unser eigentliches Menschsein. Ähnlich wie ein Computer

fungiert unser Gehirn als persönliche Schaltzentrale all unserer lebenswichtigen Funktionen, ist aber im

Gegensatz zu diesem weitaus komplexer im Aufbau und in der Möglichkeit seiner Funktionen. Unser

Gehirn ist das Zentrum unserer Intelligenz, unseres Bewusstseins, steuert fast unbemerkt alle körperli-

chen Prozesse, die uns das Leben ermöglichen. Unsere Persönlichkeit, unser Handeln ­ sei es willkürlich

oder unbewusst ­ alles was uns zum Menschen macht und uns als Mensch ausmacht wird vom Gehirn

gesteuert.

Die Koordination unserer körperlichen und geistigen Fähigkeiten erfolgt im Gehirn über Nervenzel-

len (Neurone). Man schätzt, dass allein das menschliche Gehirn aus ca. 1011 Neuronen besteht. Diese

unvorstellbar große Zahl ist vergleichbar mit der Anzahl der Sterne in unserer Milchstraße. Das Neuron

hat denselben Grundbauplan wie andere Zellen, unterscheidet sich jedoch durch drei Besonderheiten:

1. in seiner Form fallen die langen Fortsätze auf;

2. die Zellmembran ist spezialisiert Signale zu erzeugen und zu leiten;

3. an seinen Endigungen produziert es spezifische Substanzen (Transmitter) und gibt diese ab (che-

mische Synapse). In manchen Fällen findet eine direkte elektrische Weiterleitung statt (elektrische

Synapse).

Ein Neuron (Abb. 1) besitzt einen Zellkörper (oder Soma). Im Soma liegen Zellkern, zahlreiche Mito-

chondrien und Nissl-Schollen1. Hier werden Enzyme und Membranbausteine hergestellt. Die Dendriten,

röhrenförmige, meist reich verästelte Fortsätze am Soma, können die ankommenden Signale aufnehmen.

Ein Neuron besitzt meist nur ein einziges Axon, welches dünner und viel länger als die Dendriten ist.

Das Axon verästelt sich erst wo es mit anderen Zellen in Kontakt tritt. Das kann einen Meter oder sogar

weiter vom Soma entfernt sein. Die Verzweigungen sind am Ende verdickt (Endknöpfchen) und bilden

mit der Membran der folgenden Zelle die Synapsen. In diesem Bereich erfolgt die Erregungsübertragung

(Aktionspotential) vom Axon der einen Nervenzelle zu den Dendriten der nachfolgenden Nervenzellen

mithilfe chemischer Überträgersubstanzen, den Neurotransmittern. In einigen Fällen gibt es jedoch eine

direkte elektrische Weiterleitung. In elektrischen Synapsen wird das Aktionspotential direkt und ohne

Umwege auf die nachfolgende Zelle durch Verbindungskanäle (Gap junctions) weitergeleitet. Die Struk-

tur der Neurone wird dabei vom Zytoskelett aufrechterhalten. Im Inneren jedes Neurons liegt ein Gerüst

vor, das aus drei Komponenten besteht. Diese sind die Mikrotubuli, die Neurofilamente und die Mikro-

filamente. Die Gesamtheit dieser filamentösen Proteine bilden dann das Zytoskelett, das die Struktur der

1das sind Stapel des Endoplasmatischen Reticulums mit zahlreichen Ribosomen

8

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Neurone von innen aufrechterhält. Nach Abschluss der Embryonalentwicklung teilen sich die Nerven-

zellen nicht mehr. Zwar findet im Hippocampus auch im adulten Gehirn noch eine Neurogenese2 statt,

aber für die meisten Hirnareale muss der bei der Geburt vorhandene Vorrat (beim Menschen ca. 100 Mrd.

Neurone) ein Leben lang reichen.

Im Gehirn kommt außer dem Neuron noch ein anderer Zell-

typ vor ­ die Gliazelle. Während die Nervenzellen für Reiz-

aufnahme, Erregungsleitung und Reizverarbeitung zuständig

sind, sind die Gliazellen als eine Art ,,Nervenbindegewebe"

(Neuroglia) zu verstehen. Sie sind gleichsam Ernährungs- und

Stützgewebe für die Nervenzellen und dienen zusätzlich der

Abwehr von Krankheiten sowie der Isolierung von Nervenfa-

sern. Somit sind sie, wenn auch nur indirekt, an der Erregungs-

leitung beteiligt. Gliazellen behalten, anders als Neurone, die

sich nach der Geburt nicht mehr teilen können, zeitlebens die

Fähigkeit zur Zellteilung. Gehen Nervenzellen zugrunde, z.B.

durch Krankheit, Sauerstoffmangel oder Verletzungen, wer-

den sie durch eine Glianarbe ersetzt.

Entsprechend der überragenden Bedeutung des Gehirns

können Schädigungen im Nervensystem verheerend sein. Da

sich Nervenzellen nicht regenerieren können, kommt es bei

Abbildung 1: Schematische Darstel-

Verletzungen oder Nervenzelltod zu Strukturveränderungen im lung einer Wirbeltier Nervenzelle.

Gehirn, was zu einer Veränderung in der Bewusstseins- und

Persönlichkeitsstruktur, verschlechterter Koordination und Demenz3 führen kann.

Die bekannteste und am weitesten verbreitete Form der Demenzerkrankung ist die Alzheimer-Krankheit.

Weltweit sind schätzungsweise 15 Millionen Menschen betroffen und die Zahl der Alzheimer-Kranken

steigt mit höherer Lebenserwartung [2]. Da die genauen Ursachen der Alzheimer-Demenz bis heute nicht

genau bekannt sind, rücken Studien über die genauen Vorgänge immer mehr ins Zentrum der Forschung.

Somit wird es vielleicht möglich sein die Krankheit eines Tages zu heilen.

2Unter Neurogenese versteht man die Bildung von Nervenzellen aus bestimmten Stamm- oder Vorläuferzellen.

Neuere Untersuchungen zeigen, dass die Neurogenese nicht nur während der Embryonalentwicklung, sondern

auch noch im adulten Gehirn stattfindet. Neugebildete Körnerzellen scheinen im Hippocampus eine Funktion in

der Bildung oder Konsolidierung des Lanzgzeitgedächtnisses zu haben. Im wesentlichen ist über die Funktion

der neugebildeten Zellen beim Menschen jedoch wenig bekannt, da die bisherigen Aussagen auf Tiermodellen

beruhen [1].

3Unter einer Demenz versteht man eine fortschreitende Erkrankung des Gehirns, die die bereits erworbenen ko-

gnitiven Funktionen und geistige Leistungsfähigkeit bei einem erwachsenen bzw. alten Menschen vermindert.

9

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1.1. Alzheimerkrankheit

Der deutsche Psychiater und Neuropathologe Dr. Alois Alzheimer (1864-1915) beschrieb diese Krank-

heit als erster an der Patientin Auguste D. und stellte sie 1907 auf einem wissenschaftlichen Kongress in

Tübingen vor [3].

Es handelt sich hierbei um eine degenerative Hirnerkran-

kung mit progredienter4 Hirnatrophie5 unter Bildung bestimm-

ter pathologischer Veränderungen im Gehirn [5]. Der Verlauf

der Krankheit ist durch die fortschreitende Abnahme der all-

gemeinen geistigen Fähigkeiten und des Gedächtnisses ge-

kennzeichnet. Weltweit leiden ca. 5% der Bevölkerung über

65 Jahre an einer Demenz. Davon sind mehr als 60% aller

Demenzen vom Alzheimer-Typ [6]. Allein in Deutschland

leiden ca. 1,2 Millionen Menschen an Alzheimer und jedes

Jahr sind mehr als 200.000 Menschen von dieser Diagno-

se betroffen. Wegen der höheren Lebenserwartung überwiegt

wahrscheinlich das weibliche Geschlecht [2].

Die Diagnose einer Alzheimer-Demenz (AD) ist im We-

sentlichen eine Ausschlussdiagnose, das heißt, nach Über-

prüfung einer Reihe von Kriterien, kann die Diagnose einer

klinisch wahrscheinlichen AD gestellt werden. Eine sichere

Abbildung 2: Alois Alzheimer (1864-

Bestätigung der klinischen Verdachtsdiagnose ist nur durch

1915)[4]

neuropathologische Post-Mortem-Untersuchungen möglich [7].

Ein dementielles Syndrom liegt dann vor, wenn gravierende Gedächtnisstörungen und intellektuelle Ein-

bußen zu einer erheblichen Beeinträchtigung der sozialen Kompetenz geführt haben, wenn ein progre-

dienter Verlauf zu beschreiben ist und wenn Defizite in mindestens zwei verschiedenen Bereichen von

Gedächtnis, Merkfähigkeit und anderen Bereichen der Kognition zu quantifizieren sind [5]. Da die Sym-

ptome solch einer Demenz aber eine Vielzahl von Ursachen haben können, ist die diagnostische Ab-

klärung dieser Störungen mitunter sehr schwierig und zeitaufwendig. Daher ist eine umfassende neuro-

psychologische Untersuchung notwendig um die Demenz-Symptome nachzuweisen.

Charakteristische Symptome der Alzheimer-Krankheit sind Störungen der Sprache, des Denkvermö-

gens und des Gedächtnisses. Während sich der Verlust der Merkfähigkeit anfangs nur in der Unfähigkeit,

neue Ereignisse zu behalten, äußert, wird im Verlauf der Krankheit auch das Altgedächtnis erfasst. Die

daraus entstehende Desorientierung führt dazu, dass die Neuorientierung an bisher unbekannten Orten,

zum Beispiel im Urlaub, nicht mehr möglich ist. Später findet sich der Patient auch im häuslichen Umfeld

4Das Fortschreiten oder die zunehmende Verschlimmerung des Krankheitsverlaufs.

5Ein über das gesunde Altersmaß hinausgehender Gewebsschwund wird als Atrophie bezeichnet.

10

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nicht mehr zurecht [7]. Dadurch wird die Alltagskompetenz zunehmend beeinträchtigt. Da der Verlauf

der Krankheit einen Abbau aller höheren Hirnfunktionen nach sich zieht, kommt es zum Verlust der

Abstraktionsfähigkeit, zur Störung der Koordination (Apraxie)6 und Sprache (Aphasie)7. Im weiteren

Verlauf wird der Patient immer orientierungsloser und ist schließlich sogar nicht mehr in der Lage Ver-

wandte zu erkennen (Agnosie)8. Die fortschreitende Verschlimmerung der Symptome führt schließlich

zu einer reduzierten Kommunikation, die sich auf stereotype verbale Äußerungen beschränkt. Die Pati-

enten werden schließlich pflegebedürftig und sterben nach einer Krankheitsdauer von ca. fünf bis acht

Jahren an den Folgen der Bettlägrigkeit [6].

Die genauen Ursachen der Krankheit sind bisher nicht bekannt, jedoch konnte eine Vererbung mit

autosomal dominantem Erbgang in 5-10% der Fälle nachgewiesen werden (FAD)9. Sicher ist jedoch,

dass die klumpen- und fadenförmigen Gebilde, die Alzheimer bei der Untersuchung des Gehirns der Pa-

tientin Auguste D. vorfand, mit zu den Verursachern der AD zählen. Bei diesen auffälligen molekularen

Veränderungen des Hirngewebes handelt es sich um extrazelluläre amyloide Plaques und intrazelluläre

neurofibrilläre Knäuel (NFTs)10. Ferner konnte Alois Alzheimer Neurodegeneration im Neokortex und

Hippocampus feststellen. Der Vergleich eines an Alzheimer erkrankten Gehirns mit einem gesunden Ge-

hirn zeigt, dass die Patienten bis zu 10% ihrer Hirnmasse verlieren (siehe Abb.7 auf S.17). Betroffene

Regionen sind vor allen Dingen die Schläfenlappen, die für die Gedächtnisleitung von großer Bedeutung

sind. Die Neurodegeneration am Hippocampus ist für die Einbußen an Konzentration und Merkfähigkeit

verantwortlich. Eine weitere Ursache zeigt sich mikroskopisch auch in der Abnahme der Synapsendichte,

was mit hoher Wahrscheinlichkeit mit den kognitiven Einbußen der Krankheit korreliert. Diese neurona-

len Anomalien kommen bei allen Alzheimer-Patienten, gegenüber der gesunden Altersgruppe, in stark

erhöhter Häufigkeit vor [5].

Die extrazellulären Plaques bestehen aus Ablagerungen von Amyloidprotein und werden von einem

Proteinfragment namens A gebildet, welches als Abbauprodukt bei der Prozessierung des -Amyloid-

Vorläuferproteins (APP) entsteht und im extrazellulären Raum Plaques bildet (Abb. 3).

6Die Unfähigkeit erlernte willkürliche Handlungen bei intakter motorischer Funktion auszuführen wird als Apra-

xie bezeichnet. Es liegt dabei keine Lähmung vor [8].

7Eine Aphasie bezeichnet eine Sprachstörung nach abgeschlossenem Spracherwerb, bei der der Patient nicht

in der Lage ist Informationen in Form von Sprache oder Schrift zu verstehen oder bzw. zu begreifen. Man

unterscheidet die motorische und sensorische Aphasie [8].

8Eine Agnosie bezeichnet die Unfähigkeit Dinge zu erkennen, obwohl die erforderliche Sinnesfunktion intakt ist

[8].

9Bei der familiär gehäuften AD (FAD, familiar alzheimer disease) ist der Gendeffekt auf die Mutation des Pre-

senilin 1-Gens auf Chromosom 14, des Presenilin 2-Gens auf Chromosom 1 oder Mutation des APP-Gens

auf Chromosom 21 zurückzuführen. Des weiteren besteht eine Verbindung zwischen der Erkrankung und dem

e4-Allel von Apolipoprotein E (ApoE) [5].

10neurofibrillary tangles

11

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