ANALYSE DER GRANULOZYTENFUNKTION UND DES CD45R-

EXPRESSIONSMUSTERS SOWIE FREQUENZBESTIMMUNG EINER

DEFINIERTEN CD45-PUNKTMUTATION BEI PATIENTEN MIT

AUTOIMMUNTHYREOIDITIS VOM TYP HASHIMOTO

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt dem Rat der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Schiller-Universität Jena

von Sina Weißenborn

I

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Gutachter:

1. Prof. Dr. med. Dagmar Barz, Institut für Transfusionsmedizin, Jena

2. Prof. Dr. med. Ulrich-Alfons Müller, Klinik für Innere Medizin III, Jena

3. Prof. Dr. med. Gregor Bein, Institut für Transfusionsmedizin, Gießen

Tag der öffentlichen Verteidigung: 06.01.2009

II

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Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

. Signifikanzniveau

ADCC engl.

antibody-dependend

cellular cytotoxity

AG Antigen/-e

AIK Autoimmunerkrankung/-en

AIT Autoimmunthyreoiditis

AK Antikörper

APC engl.

antigen-presenting cell/-s

CD

engl. cluster of differentiation

CD45RA-C;O

Bezeichnung für die Epitope (A, B, C, O) der CD45-

Isoformen; CD45RA-C werden durch die Exone A-C

kodiert

CÆG

Basenaustausch in der DNA: Cytosin wurde durch

Guanin ersetzt

DNA engl.

desoxyribonucleinacid

dNTP Desoxy-Nukleosidtriphosphate

ESS

engl. exonic splicing silencer

FACS

engl. fluorescence-activated cell sorter

FITC Fluoreszein-Isothiozyanat

FL Fluoreszenz

FSC

engl. forward scatter; Vorwärtsstreulicht

FSU

Friedrich Schiller Universität

G1-3

Gate (=Analysefenster) Nummer 1-3

GFT Granulozytenfunktionstest

HCV

Hepatitis C Virus

HIV

engl. human immunodeficiency virus

HLA

engl. human leukocyte antigen

HT Hashimoto-Thyreoiditis

IFN Interferon

Ig Immunglobulin/-e

IL Interleukin/-e

I

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Abkürzungsverzeichnis

KIM

Klinik für Innere Medizin

LPAP

engl. lymphocyte phosphatase-associated

phosphoprotein

mAK monoklonale/-r

Antikörper

MHC

engl. major histocompatibility complex

MS Multiple

Sklerose

MspI Moraxella

Spezies

I

MW Molekulargewicht/-e

p

statistische Überschreitungswahrscheinlichkeit von .

PBS

engl. phosphate buffered saline

PCR

engl. polymerase chain reaction

PE Phycoerythrin

RFLP Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus

RNA engl.

ribonucleinacid

SKAP55 engl.

src-kinase-associated phosphoprotein of 55kD

SLE

Systemischer Lupus Erythematodes

SR

Serin (S), Arginin (R)

SSC

engl. side scatter; Seitwärtsstreulicht

Taq Thermus

aquaticus

Tg Thyroglobulin

TNF Tumornekrosefaktor

TPO Thyroidperoxidase

TSH

Thyroid stimulierendes Hormon

TZR T-Zellrezeptor

vs. versus

ZAP engl.

zeta-associated

protein

II

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Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis III

1

Zusammenfassung 1

2

Einleitung 3

2.1 Autoimmunthyreoiditis Typ Hashimoto 3

2.1.1 Epidemiologie 3

2.1.2 Klinik 4

2.1.3 Diagnostik 5

2.1.4 Prognose 5

2.1.5 Therapie 5

2.1.6 Ätiologie und Pathogenese 6

2.2 CD45-Molekül 8

2.2.1 Aufbau 9

2.2.2 Funktion 10

2.2.3 Regulation des CD45 11

2.2.4 Alternatives Spleißen und genetische Polymorphismen 12

2.2.5 Bindung der CD45R-AK 15

2.2.6 CD45 und Autoimmunerkrankungen 15

3

Fragestellung und Ziele 17

4

Material 18

4.1 Probanden 18

4.1.1 Patientenkollektiv 18

4.1.2 Kontrollkollektiv 18

4.2 Materialien 19

4.2.1 Antikörper 20

4.2.2 weitere Chemikalien 21

4.2.3 Verbrauchsmaterialien 22

4.2.4 Geräte 23

4.2.5 Software 23

III

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Inhaltsverzeichnis

5

Experimentelle Methoden 24

5.1 Herstellung von Lösungen 24

5.1.1 Herstellung von PBS 24

5.1.2 Herstellung der Lyselösung 24

5.2 Durchflusszytometrische Analytik 24

5.2.1 Grundlagen der Durchflusszytometrie 24

5.2.2 Einstellungen des Durchflusszytometers 26

5.2.3 Anfärbung der CD45-AG von Leukozyten mit CD45-mAK 27

5.2.4 Isotypkontrollen für die verwendeten CD45-AK 28

5.2.5 Bestimmung der Phagozytoseaktivität von Granulozyten 28

5.3 DNA-Analytik 30

5.3.1 Präparation der DNA aus Vollblut 30

5.3.2 Nachweis der CÆG Punktmutation an Position 77 des Exon A

des CD45-Gens 31

6

Statistische Methoden 37

6.1 Statistik ­ CD45R-Expressionsmuster 37

6.2 Statistik ­ Granulozytenfunktion 37

6.3 Statistik ­ Mutationshäufigkeit 38

7

Ergebnisse 39

7.1 Altersstruktur und Geschlechtsverhältnis in den Kollektiven 39

7.2 Durchflusszytometrische Darstellung der Leukozytenpopulationen 40

7.3 Ergebnisse der Isotypkontrollen 41

7.4 Grundlagen der CD45RO/RA-Expression auf Lymphozyten und

Granulozyten 43

7.4.1 Charakterisierung eines varianten CD45RA-Expressionsmusters

in der Lymphozytenpopulation 44

7.4.2 Charakterisierung eines varianten CD45RA-Expressionsmusters

in der Granulozytenpopulation 45

7.5 Verteilung des klassischen und varianten CD45RA-Expressions-

musters in den Kollektiven 48

IV

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Inhaltsverzeichnis

7.6 Molekulargenetische Resultate 48

7.6.1 Nachweis des PCR-Produktes für Exon A des CD45-Gens 48

7.6.2 Nachweis der gesuchten Punktmutation durch RFLP-Analyse 49

7.6.3 Gegenüberstellung der Allelfrequenzen 53

7.7 Vergleich der klassischen mit den varianten CD45RA-Expressions-

mustern 54

7.7.1 CD45RO- und CD45RA-Expression auf Lymphozyten 54

7.7.2 CD45RB- und CD45RC-Expression auf Lymphozyten 56

7.7.3 CD45RO- und CD45RA-Expression auf Granulozyten 56

7.7.4 CD45RB- und CD45RC-Expression auf Granulozyten 58

7.8 Vergleich des Patienten- und Kontrollkollektivs unter Ausschluss der

Träger des C77G-Polymorphismus 58

7.8.1 CD45RO- und CD45RA-Expression auf Lymphozyten 59

7.8.2 CD45RB- und CD45RC-Expression auf Lymphozyten 60

7.8.3 CD45RO- und CD45RA-Expression auf Granulozyten 60

7.8.4 CD45RB- und CD45RC-Expression auf Granulozyten 61

7.9 Darstellung der Phagozytoseaktivität der Granulozyten 62

8

Diskussion 67

8.1 Allelfrequenz 67

8.2 Diskussion der Ergebnisse zwischen Personen mit varianten und

normalen CD45RA-Expressionsmustern 70

8.2.1 CD45R-Expression auf Lymphozyten 70

8.2.2 CD45R-Expression auf Granulozyten 73

8.3 Diskussion der Ergebnisse zwischen Patienten- und Kontrollkollektiv

unter Ausschluss der Träger des C77G-Polymorphismus 76

8.3.1 CD45R-Expression auf Lymphozyten 76

8.3.2 CD45R-Expression auf Granulozyten 77

8.4 Granulozytenfunktionstest 78

9

Schlussfolgerungen 82

10

Literatur- und Quellenverzeichnis 83

11

Anhang 93

V

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1 Zusammenfassung

1 Zusammenfassung

Hintergrund: Lymphozyten exprimieren, je nach Aktivierungszustand,

verschiedene Isoformen des CD45-Moleküls. Dies ist durch alternatives

Spleißen der Exone A-C des CD45-Gens möglich. Inaktive T-Zellen prägen die

Isoformen ABC, AB, BC und B aus. Nach der Aktivierung sind nur noch die

Isoformen O und B auf der Zelloberfläche präsent. Durch eine CÆG

Transversion an Position 77 des Exon A exprimieren aktive T-Zellen zusätzlich

die Isoform AB. Die Transversion kann mit Autoimmunerkrankungen (AIK)

assoziiert sein. Ein Einfluss der Punktmutation auf die Granulozytenfunktion ist

bisher nicht beschrieben. Granulozyten beugen durch ihre Phagozytose-

fähigkeit Infektionen vor, welche in der Ätiologie von AIK eine Rolle spielen. Sie

exprimieren im Ruhezustand die Isoform O des CD45-Moleküls. Nach

Zellaktivierung werden durch die Verschmelzung intrazellulärer Granula

Isoformen mit Exon A kodierenden Sequenzen an die Zelloberfläche

transloziert.

Fragestellungen: Besteht eine Assoziation des C77G-Polymorphismus zur

Hashimoto-Thyreoiditis (HT)? Wie verändert der C77G-Polymorphismus die

CD45R-Expression auf Lympho- und Granulozyten? Treten Unterschiede in der

CD45R-Expression bei HT-Patienten im Vergleich zu Kontrollpersonen auf? Übt

die CÆG Transversion Einfluss auf die Phagozytoseaktivität der Granulozyten

aus? Ist die Phagozytoseaktivität zwischen den Kollektiven unterschiedlich?

Methoden: Bei 73 HT-Patienten und 73 Kontrollprobanden wurde das CD45R-

Expressionsmuster der Leukozyten mit einem CD45RA-, -RB-, -RC- und -RO-

AK im Durchflusszytometer analysiert. Sämtliche Probanden der Studie wurden

auf die CÆG Transversion mit einer PCR-RFLP-Analyse getestet. Die

Phagozytoseaktivität wurde von 41 HT-Patienten und 42 Kontrollprobanden

mithilfe des kommerziell erhältlichen Testkits ,,Phagotest" ermittelt.

Ergebnisse: Ein variantes CD45RA-Expressionsmuster - dem CÆG

Polymorphismus typisch - wurde in beiden Kollektiven je einmal beobachtet. Die

molekulargenetischen Untersuchungen bestätigten die Transversion an Position

77 des Exon A bei beiden Trägern des veränderten CD45RA-Musters. Die G-

Allelfrequenz ergab einen Wert von 0,69%. Ein Unterschied zwischen den

Kollektiven war somit statistisch nicht vorhanden.

1

---

1 Zusammenfassung

Das CD45RA-Expressionsmuster zeigte bei den Personen mit der Transversion

im Vergleich zu den Individuen mit dem klassischen CD45RA-Muster folgende

statistisch signifikante Veränderungen: Erhöhte Lymphozytenzahl mit

CD45RO,/RA+- und CD45RC+-Markierung, sowie in beiden

Leukozytenpopulationen gesteigerte Zahl CD45RO+/RA+- und erniedrigte

Mengen CD45RO+/RA,-Zellen. In der Gegenüberstellung der HT- mit den

Kontrollprobanden unter Ausschluss der gefundenen Träger der Punktmutation

ergaben sich signifikante Differenzen bzgl. der gesteigerten CD45RA- und

CD45RC-Expression auf Lymphozyten sowie der reduzierten CD45RO+- und

CD45RO+/RA,-Lymphozytenzahl im Kontrollkollektiv. Weiterhin war eine

gesenkte CD45RB-Expression auf Granulozyten in dieser Gruppe vorhanden.

Im Granulozytenfunktionstest (GFT) wurde nach Feststellung der Punktmutation

bei einem der untersuchten Kontrollprobanden eine Gegenüberstellung dieser

Person mit den restlichen Kontroll- und HT-Personen durchgeführt. Es zeigte

sich eine erhöhte Phagozytoseaktivität an den ersten beiden Messpunkten

(′10min Eisbad′ und ′1min im 37°C warmen Wasser′) bei dem Individuum mit

dem varianten CD45-Expressionsmuster im Vergleich mit den beiden anderen

Personengruppen. An den genannten Messpunkten zeigte die

Gegenüberstellung der Zellen von HT-Patienten mit denen der gesunden

Spender eine signifikante Reduktion der Granulozytenaktivität im

Patientenkollektiv. Im weiteren Untersuchungsverlauf nährten sich die

Aktivitäten der Granulozyten in den Kollektiven an.

Schlussfolgerungen: Eine Assoziation zwischen dem C77G-Polymorphismus

und der HT besteht nicht. Die gefundenen Differenzen in der CD45RO- und

CD45RA-Expression lassen sich zum einen durch die C77G-Transversion

erklären, zum anderen könnte die ständig ablaufende Immunreaktion bei den

HT-Patienten verantwortlich sein. Die festgestellten Quantitätsunterschiede der,

durch die Exone A-C kodierten Sequenzen in den Kollektiven könnten bei

entsprechender Bestätigung in weiteren Studien ein Diagnosekriterium

darstellen. Zudem gibt die veränderte Phagozytoseaktivität zwischen den

untersuchten Gruppen einen Hinweis auf einen Einfluss der CD45-Isoformen

auf diese Granulozytenfunktion. Bestätigt sich dieser Verdacht in weiteren

Untersuchungen wären auch Modulationen der CD45-Isoformen und der damit

verbunden Zellfunktion durch AK denkbar.

2

---

2 Einleitung

2 Einleitung

2.1 Autoimmunthyreoiditis Typ Hashimoto

Die Schilddrüse ist ein Organ mit einem vielfältigen Einfluss auf sämtliche

Körperfunktionen und erstreckt sich vom Kohlenhydrat-, Fett-, und

Proteinstoffwechsel über die Thermoregulation und das Herz-Kreislaufsystem

auf den Magen-Darmtrakt sowie das Muskel- und Nervensystem. Durch diese

multiplen Funktionen wird die gesamte körperliche, geistige und seelische

Entwicklung und Verfassung des Menschen grundlegend beeinflusst.

Fehlfunktionen können mit einem Überschuss an Schilddrüsenhormonen

(Hyperthyreose) oder einem Hormonmangel (Hypothyreose) einhergehen. Die

Ursachen können in drei Ebenen liegen. Sie können sich im Hypothalamus

(tertiär), in der Hypophyse (sekundär) oder der Schilddrüse direkt (primär)

befinden. Primäre Ursachen liegen u.a. bei den, im Folgenden beschriebenen,

Erkrankungen, Morbus Basedow und Hashimoto-Thyreoiditis (HT), vor.

Die meisten Hyperthyreosen werden durch die AIK Morbus Basedow

verursacht. Dabei führen schilddrüsenstimulierende AK zur erhöhten

Hormonausschüttung. In wenigen Fällen ist eine Schilddrüsenautonomie für das

unausgewogene Hormonverhältnis verantwortlich.

Auch für Hypothyreosen sind mehrere Ursachen bekannt. Neben iatrogenen

Veränderungen z.B. durch Strumektomie oder Radiotherapie können auch AIK

zum Hormonmangel führen. Die hier untersuchte AIK - chronisch lymphozytäre

Hashimoto-Thyreoiditis ­ geht mit einer Entzündung der Schilddrüse einher. Sie

wurde erstmals 1912 von dem japanischen Pathologen und Chirurgen Hakaru

Hashimoto beschrieben (Sawin 2002) und stellt die häufigste AIT dar (Schott

und Scherbaum 2006). Diese Erkrankung soll nun näher erläutert werden.

2.1.1 Epidemiologie

Eine Untersuchung in der nordamerikanischen Bevölkerung ergab, dass 10%

der untersuchten Personen erhöhte Schilddrüsen-AK aufweisen, von denen 5%

eine Hypothyreose (0,3% eine manifeste Hypothyreose) zeigen (Hollowell et al.

2002). Neuere Studien postulieren eine 10%-ige Häufigkeit von klinischen und

subklinischen Hypothyreosen. Diese Zahl kann auch für Westeuropa

übernommen werden (Parle et al. 1991, Valeix et al. 2004). Dabei sind Frauen

3

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