Entwicklung eines Bestimmungsverfahrens
fur liposomal verkapseltes Daunorubicin
(DaunoXome)

Diplomarbeit
zur Erlangung des Grades eines Diplomchemikers
dem
Fachbereich Chemie der Philipps-Universitat Marburg

vorgelegt von
Daniel Eikel
aus
Arnsberg/Neheim
Marburg/Lahn 2000

Abgabedatum: 31.03.2000
Erstgutachter: Prof. Dr. H. Jungclas
Zweitgutachter: Prof. Dr. W. Ensinger

Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Krebsforschung als gesellschaftliche Herausforderung 1
1.2 Die konventionellen Therapiemoglichkeiten 3
1.3 Allgemeine Aspekte der Chemotherapie 5
1.4 Pharmakokinetik 7
1.5 Liposomal verkapseltes Daunorubicin (DaunoXome) 9
1.6 Zielsetzungen dieser Arbeit 10

2 Theoretische Hintergrunde 12
2.1 Anthrazykline 12
2.1.1 Chemische Eigenschaften der Anthrazykline 12
2.1.2 Stabilitat der Anthrazykline in wassrigen Medien 14
2.1.3 Anwendung der Anthrazykline in der Chemotherapie 15
2.1.4 Pharmakokinetik der Anthrazykline 17
2.1.5 Bisherige Analytik der Anthrazykline und alternative Bestimmungsverfahren 18
2.2 Liposomal verkapselte Zytostatika 20
2.2.1 Entwicklung der liposomal verkapselten Anthrazykline 20
2.2.2 DaunoXome 22
2.2.3 Anwendung und Vorteile von DaunoXome in der Chemotherapie 23
2.2.4 Pharmakokinetik von DaunoXome 24
2.3 Festphasenextraktion von Pharmaka aus biologischen Matrizes 27
2.3.1 Off-line Festphasenextraktion 27
2.3.2 On-line Festphasenextraktion durch LC-LC Kopplung 31
2.3.3 Extraktion mit restricted-access Material 33
2.4 Hochleistungs-Flussigkeitschromatographie 35
2.4.1 Beurteilungsparameter fur gute Chromatogramme in der HPLC 35
2.4.2 Probleme bei der Chromatographie basischer Analyten 37
2.4.3 Detektion mittels Fluoreszenz und Absorption 37

3 Entwicklung des Bestimmungsverfahrens 39
3.1 Detektion der Anthrazykline 39
3.2 Stabilitat der Anthrazykline in wassrigen Medien 45
3.3 Auswahl der chromatographischen Phase und Optimierung der Trennparameter 52
3.4 Optimierung der Probeninjektion 62
3.5 Entwicklung der off-line Extraktion 67
3.6 Validierung der off-line Festphasenextraktion - Kalibrierfunktion 83
3.7 Entwicklung der on-line Extraktion 90
3.8 Validierung der on-line Festphasenextraktion - Kalibrierfunktion 95
3.9 Vergleich der Extraktionsverfahren 100

4 Anwendung des Bestimmungsverfahrens auf Patientenproben 101
4.1 Bestimmung der Plasmakonzentration von DaunoXome 101
4.2 Pharmakokinetik von DaunoXome 105

5 Zusammenfassung der Ergebnisse und Ausblick 114

6 Literaturverzeichnis 116

7 Anhang 123
7.1 Verzeichnis wichtiger Abkurzungen und Symbole 123
7.2 Verwendete Gerate und Materialien 124
7.3 Verwendete Chemikalien 125
7.4 Danksagung 126

1 Einleitung
1.1 Krebsforschung als gesellschaftliche Herausforderung
In der Statistik der Todesursachen ist Krebs seit 1900 in den Industrielandern von der siebten auf die zweite Stelle vorgeruckt. Uberflugelt wird er nur noch von den Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Zu den tumorinduzierenden Faktoren zahlen ultraviolette und ionisierende Strahlung, krebserregende Stoffe und krebserzeugende (onkogene) Viren. Formale Ursachen der Steigerung der Krebserkrankungen sind die zunehmend steigende Lebenserwartung und die deutlich verbesserte Diagnostik von Krebsleiden. Tatsachliche Steigerungen der Todesrate begrunden sich in zunehmender Exposition der Bevolkerung gegenuber tumorinduzierenden Faktoren. Hier seien besonders die Risiken des Rauchens hervorgehoben, da etwa 20 % aller Raucher im Verlauf ihres Lebens an Lungenkrebs erkranken. Auch die zunehmende Strahlenbelastung durch diagnostische Verfahren wie Rontgen, die Belastung durch Sonneneinstrahlung in Kombination mit mangelndem Hautschutz und die Belastung durch die Einwirkung karzinogener Chemikalien sind als Ursache von Krebsleiden zu sehen [1].
Bei Menschen im Erwerbstatigenalter von 16-60 Jahren liegt Krebs in der Statistik der Todesursachen sogar an erster Stelle und stellt damit nicht nur ein personliches Schicksal und Leid dar, sondern auch eine gesellschaftliche Herausforderung. Trotz dieser Tatsachen existiert in Deutschland noch immer kein Krebsregister, das alle auftretenden Krebserkrankungen anonymisiert verwaltet. Eine solche Datenbank konnte eindeutige Auskunfte uber Haufigkeit, regionale Verteilung, zeitliche Veranderungen, mogliche Ursachen und Therapierbarkeit von Tumorerkrankungen geben. Infolgedessen liegen keine gesicherten statistischen Daten uber die Krebssituation in Deutschland vor. Schatzungen gehen von jahrlich weit uber 350.000 Neuerkrankungen aus, von denen etwa 50 % die folgenden 5 Jahre nicht uberleben [2].
Jede einzelne der rund 30 Billionen Korperzellen kann durch eine Reihe physikalischer, chemischer oder biologischer Einflusse an jedem beliebigen Ort des Korpers in eine Tumorzelle umgewandelt werden. Jeder Tumor geht auf die Mutation einer einzelnen Zelle zuruck, die in eine Phase unkontrollierter Zellteilung eingetreten ist. Benigne oder gutartige Tumore gefahrden in der Regel nicht das Leben des Patienten, da sie sich vom umliegenden Gewebe abkapseln, lokal verbleiben und keinen zerstorenden Einflus auf benachbarte Zellen nehmen. Anders ist dies bei den malignen oder bosartigen Tumoren, die invasiv in das umliegende Gewebe hineinwachsen, Zellverbande zerstoren und durch Ausschuttung von Tumorzellen in die Blutbahn oder das Lymphsystem an anderen Orten im Korper Metastasen erzeugen.
Die Art eines malignen Tumors kann unterteilt werden, indem man den Ort der Entstehung als Kriterium heranzieht. Bosartige Tumore im Epithelgewebe wie Haut und Schleimhaut werden als Karzinome, im Bindegewebe wie Muskel, Fett und Knochen als Sarkome bezeichnet. Eine bosartige Erkrankung der weisen Blutkorperchen im blutbildenden System bezeichnet man als Leukamie [3].
Aufgrund der vielfaltigen Entstehungsmoglichkeiten von Tumoren besteht die wichtigste Maßnahme zur Abwehr einer Tumorerkrankung in der Minimierung von Risikofaktoren und einer fruhzeitigen Erkennung durch umfassende medizinische Diagnostik. Allein durch diese Maßnahmen, kombiniert mit den bestehenden Therapieverfahren, konnten etwa 2/3 aller Krebserkrankungen vermieden bzw. die Heilungschancen drastisch verbessert werden [1].

1.2 Die konventionellen Therapiemöglichkeiten
Die Behandlung der Tumorerkrankungen hat in den letzten Jahren beständig Fortschritte gemacht, so daß die Heilungsraten weiter angehoben wurden, die Überlebenszeit selbst bei unheilbar Kranken verlängert, und die Lebensqualität der Patienten deutlich verbessert werden konnte. Wissenschaftliche Erfolge bedeuten für den einzelnen Patienten neue wirksame Behandlungsmethoden, eine verbesserte Verträglichkeit bestehender Behandlungsschemata und einen effektiven Schutz vor unerwünschten Begleiteffekten durch gezielte Gegenmaßnahmen. Wenn trotz aller Anstrengungen eine Heilung nicht mehr möglich ist, gewinnt das Ziel der Erhaltung von Lebensqualität die höchste Priorität. Die konventionellen Therapien beruhen im wesentlichen auf drei Säulen zur Bekämpfung eines Tumors. Geschwülste, die auf ihren Entstehungsort begrenzt sind und keine Fernmetastasen gesetzt haben, können mit guten Heilungschancen durch einen operativen Eingriff entfernt werden. Mit der Weiterentwicklung der Laser-Technik und der Nutzung endoskopischer Verfahren konnten hier in den letzten Jahren deutliche Fortschritte erzielt werden. Auch bei einer schon fortgeschrittenen Erkrankung, verbunden mit einer großen Tumormasse, ist die operative Entfernung und Reduktion des Tumors mittels chirurgischer Eingriffe der erste Therapieschritt.
Zur Behandlung lokaler Tumore steht alternativ auch die Strahlentherapie zur Verfügung. Das Wirkprinzip bei der Applikation von Photonen- oder Teilchenstrahlen beruht auf einem direkten Energieübertrag der Strahlung auf die Tumorzellen. Diese werden auf molekularer Ebene geschädigt und sterben ab. Die Wirkung läßt sich nicht exakt auf die Tumorzellen begrenzen, es werden immer auch Zellen in unmittelbarer Umgebung und den Einschußrichtungen der Strahlung geschädigt. Durch neue Entwicklungen in der Technik der Strahlenanwendung können diese Nebenwirkungen aber deutlich vermindert werden. Die Vorteile der Strahlentherapie liegen darin, daß die gesunden Körperzellen nach und nach den Platz des Tumors einnehmen können, ohne daß weitere Funktionsbeeinträchtigungen zu erwarten sind, wie dies bei einem großräumigen chirurgischen Eingriff der Fall ist. Als drittes mächtiges Werkzeug steht dem Arzt die antineoplastische Chemotherapie durch Applikation von Zytostatika zur Verfügung. Die Wirkung der Zytostatika beruht auf chemischen Reaktionen, die auf molekularer Ebene zu einer Störung der Zellteilung führen, so daß eine Hemmung des Zellwachstums und idealerweise der Zelltod der Tumorzelle ausgelöst wird. Körpereigene Abwehrstoffe und Abwehrzellen greifen die so geschädigten Tumorverbände an, lösen sie auf und bauen die Zellfragmente ab. Auf diese Weise schrumpft der Tumor und gesundes Gewebe gewinnt wieder die Oberhand.
Die Zytostatika greifen aber auch gesunde Körperzellen an, da eine Differenzierung zwischen gesunden Zellen und Tumorzellen schwierig ist. Der Angriffspunkt der Zytostatika liegt meist in der abnormalen Wachstumsgeschwindigkeit des Tumorgewebes und dem damit verbundenen hohen Stoffwechsel der entarteten Zelle gegenüber normalen Körperzellen. Der Angriff erfolgt aber auch auf die Zellen des blutbildenden Systems im Knochenmark, der Schleimhäute und Haare, so daß als Nebenwirkungen Haarausfall, Durchfall, Entzündungen der Schleimhäute und eine vorübergehende Hemmung der Blutbildung auftreten. Diese Nebenwirkungen klingen in der Regel nach Ende der Therapie ebenso schnell wieder ab und können durch Gabe unterstützender Medikamente heute drastisch reduziert werden. Dieser Unterscheidungsaspekt führt zu der scheinbar widersinnigen Beobachtung, daß agressive, schnell wachsende Tumore besser therapiert werden können als langsam wachsende und unter diesem Aspekt weniger gefährliche Tumore. Bei der Entscheidung für eine Chemotherapie muß auch beachtet werden, daß durch die Gabe von Zytostatika wegen deren mutagenen Eigenschaften auch immer Neutumore induziert werden können, die jedoch in der Regel erst mit einer zeitlichen Verzögerung von 5-15 Jahren auftreten [1].
Durch die Verteilung der Zytostatika in allen Kompartimenten des Körpers können sie auch entlegenste Stellen erreichen und Tumorzellen bekämpfen, die einem operativen Eingriff oder einer Strahlenbehandlung nicht zugänglich sind. Es werden auch Metastasen und Tumore geheilt, die noch nicht diagnostisch lokalisiert werden konnten. Diese Möglichkeiten machen die Chemotherapie zu dem wichtigsten Hilfsmittel bei der Therapie von Krebsleiden. Stand der Technik in der Krebstherapie ist fast immer eine Kombination von wenigstens zwei der drei Methoden, um die Vorteile jeder Methode ausnutzen zu können. Im Bereich der Chemotherapie wird zudem häufig mit Kombinationstherapien verschiedener Zytostatika gearbeitet, um einen optimalen Heilungsverlauf zu gewährleisten.