Aus dem
Zentrum für Physiologie
Institut für Herz- und Kreislaufphysiologie

Die Umsatzrate der AMP-Desaminase im Meerschweinchenherzen

Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin

Der Medizinischen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

vorgelegt von

Se-Chan Kim

2003

Inhalt

1 Einleitung ... 7
1.1 Allgemeines ... 7
1.2 Kardialer Adenosin- und Adenin-Nukleotid-Stoffwechsel ... 8
1.3 Enzyme im Adenosin- und Adenin-Nukleotid-Stoffwechsel ... 10
1.3.1 AMP-Desaminase (EC 3.5.4.6) ... 11
1.3.1.1 Enzymkinetik ... 12
1.3.1.2 Effektoren der AMP-Desaminase ... 12
1.3.1.3 Regulation der AMP-Desaminase-Aktivität ... 13
1.3.2 5´-Nukleotidase (EC 3.1.3.5) ... 15
1.3.3 Adenosin-Desaminase (EC 3.5.4.4) ... 15
1.3.4 Purin-Nukleosid-Phosphorylase (EC 2.4.2.1) ... 16
1.3.5 Xanthin-Oxidase (EC 1.3.2.3) ... 16
1.3.6 Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.8) ... 17
1.4 Inhibition der am Purin-Stoffwechsel beteiligten Enzyme ... 17
1.5 Fragestellung ... 18

2 Material und Methoden ... 19
2.1 Modelle ... 19
2.1.1 Isolierte Perfusion nach Langendorff ... 19
2.1.1.1 Präparation ... 19
2.1.1.2 Versuchsanlage ... 19
2.1.1.3 Generelle Versuchsdurchführung ... 21
2.1.2 Enzymaktivität im Gewebehomogenat ... 21
2.1.3 Isolierte Kardiomyozyten ... 22
2.2 Inhibitoren ... 23
2.2.1 Inhibition der Adenosin-Desaminase durch EHNA ... 23
2.2.2 Inhibition der Xanthin-Oxidase durch Allopurinol ... 23
2.2.3 Inhibition der AMP-Desaminase durch GP 3521 und GP 3449 ... 24
2.2.4 Inhibition der Adenosin-Desaminase und AMP-Desaminase durch Coformycin ... 24
2.2.5 Methotrexat ... 25
2.3 Protokolle und Fragestellungen ... 25
2.3.1 Abschätzung der Umsatzrate der AMP-Desaminase unter verschiedenen Bedingungen ... 25
2.3.1.1 EHNA und Allopurinol ... 25
2.3.1.2 GP 3521 ... 26
2.3.1.3 Effekte von GP 3521 unter hypoxischen Bedingungen ... 27
2.3.1.4 Purinfreisetzung unter GP 3449 und EHNA ... 28
2.3.1.5 Abschätzung der Umsatzrate der AMP-Desaminase unter Coformycin ... 29
2.3.2 Einfluss der Purin-de-novo-Synthese ... 30
2.3.3 Hemmbarkeit der AMP-Desaminase im myokardialen Gewebeextrakt ... 30
2.3.4 Myokardialer Nukleotid- und Nukleosidgehalt nach Ischämie ... 31
2.3.5 Zellpermeabilität von Kardiomyozyten ... 31
2.4 Analytische Methoden ... 32
2.4.1 Probenaufbereitung ... 32
2.4.1.1 Probenaufbereitung für die HPLC zur Bestimmung von Adenosin, Inosin, Hypoxanthin, Xanthin und Harnsäure ... 32
2.4.1.2 Gewebeextraktion ... 33
2.4.1.3 Probenaufbereitung der Kardiomyozyten ... 34
2.4.2 HPLC-Analyse ... 34
2.4.2.1 Bestimmung der Purine ... 34
2.4.2.2 Bestimmung der Nukleotide ... 35
2.4.2.3 Bestimmung von GP 3521 in isolierten Kardiomyozyten ... 36
2.5 Auswertung und Statistik ... 36

3 Ergebnisse ... 37
3.1 Inosin- und Hypoxanthin-Freisetzung in Normoxie und Hypoxie zur Bestimmung der Umsatzrate der AMP-Desaminase ... 38
3.2 Bedeutung der Purin-de-novo-Synthese ... 42
3.3 Direkte Inhibition der AMP-Desaminase zur Bestimmung der Umsatzrate ... 44
3.3.1 Effizienz der Inhibitoren ... 44
3.3.1.1 AMP-Desaminase-Kinetik unter Coformycin ... 44
3.3.1.2 Hemmung der isolierten AMP-Desaminase durch GP 3521 ... 45
3.3.2 Effekte von Coformycin und GP 3521 auf die Purinfreisetzung ... 47
3.3.2.1 Purinfreisetzung in Normoxie unter Coformycin ... 47
3.3.2.2 Purinfreisetzung unter GP 3521 ... 50
3.3.2.3 Purinfreisetzung in Hypoxie unter GP 3521 und EHNA ... 53
3.3.3 Wirkung von GP 3521 in globaler Ischämie ... 55
3.3.4 GP 3521 Permeabilität ... 56
3.3.5 Purinfreisetzung unter GP 3449 ... 57
3.3.6 Wirkung von GP 3449 bei globaler Ischämie ... 59

4 Diskussion ... 61
4.1 Bedeutung der myokardialen AMP-Desaminase ... 61
4.2 Direkte Inhibition der AMP-Desaminase zur Bestimmung der Umsatzrate ... 66
4.3 Abschließende Betrachtung ... 69

5 Literaturverzeichnis ... 71

6 Zusammenfassung ... 85

1 Einleitung
1.1 Allgemeines
1963 stellten Berne und Gerlach et al. unabhängig voneinander die Adenosin-Hypothese auf, die besagt, dass Adenosin die Koronardurchblutung der kardialen Stoffwechselsituation anpasst (3;26). Bei abfallender kardiomyozytärer Sauerstoffspannung - so die Hypothese - wird Adenosin freigesetzt und gelangt durch das Interstitium an die Adenosin-Rezeptoren der glatten Muskulatur der Koronargefäße, um dort eine Vasodilatation zu bewirken. Die dadurch gesteigerte Koronardurchblutung führt zu einer Wiederherstellung der normalen Sauerstoffspannung.

Es konnte in mehreren Studien der koronardilatatorische Effekt von Adenosin gezeigt werden (31;57;62). Heute wissen wir, dass eine Vasodilatation über A2-Rezeptoren der glatten Muskelzellen vermittelt wird. Es gibt allerdings auch Hinweise, dass der vasodilatatorische Effekt von Adenosin auch über A2-Rezeptoren des Endothels vermittelt wird (57). Stepp und Mitarbeiter untersuchten die Dosis-Wirkungs-Beziehung von interstitiellem Adenosin zur Koronardurchblutung und stellten fest, dass bereits eine Erhöhung der interstitiellen Adenosin-Konzentration um 62 % zu einer halbmaximalen Erhöhung der Koronardurchblutung führte. Dabei wurde kein Hinweis für eine sekundäre Aktivierung eines möglichen Vasodilatators durch endotheliale Adenosin-Rezeptoren gefunden (75). Allerdings scheint Adenosin unter physiologischen Bedingungen keine Rolle bei der koronaren Flussregulation zu spielen. So führte ein um das 4-fache gesteigerter Sauerstoffverbrauch bei Hunden unter körperlicher Belastung zwar zu einem Anstieg der interstitiellen Adenosin- Konzentration, aber nicht in den Maßen, dass eine koronarvasodilatatorische Wirkung herbeigeführt werden könnte (84). Bei belastungsinduzierter O2-Mangelversorgung fällt der ATP-Gehalt kaum ab und die Adenosin-Konzentration steigt stark an, während es bei Okklusion und ATP-Katabolismus rasch zu einem ATP-Abfall und erheblichen Zunahmen von Adenosin kommt. Die Adenosin-Freisetzung scheint also nicht vom myokardialen Sauerstoffumsatz abhängig zu sein (49). Auch bei Inhibition der NO-Synthese kommt es nicht zu einer kompensatorischen koronaren Vasodilatation durch Adenosin. Die unter physiologischen Bedingungen gebildeten NO-Mengen haben nur eine moderate koronarvasodilatatorische Wirkung (83).

Adenosin zeigt eine antiadrenerge Wirkung am oxygenierten Herzen (21). Dieser Effekt wird über inhibitorische A1-Rezeptor-Subtypen vermittelt. Dadurch wird der 8 Phosphorylierungsstatus regulatorischer Proteine beeinflusst (58). Neuere Studien zeigen eine verstärkende Wirkung von A2a-Rezeptoren auf die von A1-Rezeptoren-vermittelten antiadrenergen Effekte (59). Adenosin spielt weiterhin bei der Präkonditionierung des Myokards eine Rolle. Präkonditionierung im Sinne der ischamischen Präkonditionierung bedeutet, dass eine reversible Schädigung des Myokards durch kurze ischamische Phasen zu einer Ausbildung einer Kardioprotektion bei einer späteren irreversiblen Schädigung, also einem Myokardinfarkt fuhrt. Bei Kaninchen wird bei gleichzeitiger Infusion eines Adenosin- Antagonisten und eines a-1-Antagonisten der präkonditionierende Effekt aufgehoben (13).

1.2 Kardialer Adenosin- und Adenin-Nukleotid-Stoffwechsel
Unter physiologischen Bedingungen stehen mitochondriale ATP-Bildung und der zytosolische ATP-Verbrauch im Gleichgewicht. Substrate werden unter Sauerstoffverbrauch oxidiert, um die notwendige Energie für die Synthese von ATP aus ADP und Pi bereitzustellen. Bei der hydrolytischen Spaltung von ATP zu ADP und anorganischem Phosphat wird dann wiederum Energie frei, die fast alle energieabhängigen zellularen Prozesse treibt. Unter physiologischen Bedingungen werden die Konzentrationen von ATP (6-8 mM), Pi (1-2 mM), ADP (40 uM), AMP (200 nM) und Adenosin (ca. 50 nM) in etwa konstant gehalten. Übersteigt der Verbrauch das Angebot, oder kommt es bei einer plötzlichen Ischamie zu einem rapiden katabolen Abbau der energiereichen Phosphate, dann nimmt die ATP-Konzentration ab, und es kommt zu einem raschen und dramatischen Anstieg von ADP, AMP, Adenosin und weiteren Metaboliten des Purin-Stoffwechsels (15).

In Kardiomyozyten wurden für den weiteren Abbau zu den Purinen und deren Katabolite zwei Wege beschrieben: Zum einen der Abbau von AMP uber die AMP-spezifische 5´L-Nukleotidase (EC 3.1.3.5, cN-I) zu Adenosin (Adenosin-Weg) und zum anderen der Abbauweg uber die AMP-Desaminase (EC 3.5.4.6) zu IMP und nachfolgend über die IMPspezifische 5´L-Nukleotidase (cN-II) zu Inosin (IMP-Weg) (Abb. 1.1).

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