Bestimmung der Lösungsstruktur
von H-FABP aus Rinderherz mit
mehrdimensionaler
NMR-Spektroskopie und
Molekulardynamiksimulation

Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften

vorgelegt beim
Fachbereich Biochemie, Pharmazie und Lebensmittelchemie
der Johann Wolfgang Goethe-Universität
in Frankfurt am Main

von
Thorsten Egbert Rolf Brandau
aus Hanau

Frankfurt am Main, 2000

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1
    1.1. Die Familie der Lipidbindungsproteine ... 1
    1.2. Die Struktur desH- FABPs aus Rinderherz ... 4
2. Theorie und Methoden ... 9
    2.1. Kern- Overhauser-Effekt ... 9
    2.2. Diederwinkel ... 14
3. Proteinstruktur in Lösung ... 17
    3.1. Distanzgeometrierechnungen ... 17
    3.2. REDAC Strategie ... 19
    3.3. DYANA ... 22
    3.4. Energieminimierung ... 29
    3.5. Molekulardynamik ... 30
        3.5.1. LINCS- Algorithmus ... 35
        3.5.2. Periodische Randbedingungen ... 36
        3.5.3. DasKraftfeld ... 37
4. Ergebnisse und Diskussion ... 40
    4.1. Distanzgeometrierechnungen ... 42
    4.2. Molekulardynamikrechnung ... 53
    4.3. Schlußfolgerungen ... 59
5. Zusammenfassung ... 61
6. Literatur ... 62

A. Anhang ... 77
    A.1. Chemische Verschiebungen ... 78
    A.2. Stereospezifsche Zuordnungen ... 83
    A.3. Diederwinkel ... 84
    A.4. NOE- Abstandsliste ... 86
    A.5. Parameterset für dieMolekulardynamik ... 115

1. Einleitung
1.1. Die Familie der Lipidbindungsproteine
Es gibt eine Reihe von Proteinklassen, die Wechselwirkungen mit Lipiden eingehen, so zum Beispiel Membranproteine, Apolipoproteine im Serum, phospholipidbindende Proteine [1,2], Acetyl-CoA-bindende Proteine [3,4] oder die vor ungefähr 30 Jahren identifizierten intrazellulären cytoplasmatischen Lipidbindungsproteine (LBPs), zu denen imBesonderen die Fettsäurebindungsproteine (FABPs) [5] zählen. Letztere wurden oft bei der Analyse von Protein-Lipid-Wechselwirkungen untersucht und gehören zu den am besten studierten Klassen von Polypeptiden. Bei diesen Studien wurden die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften der verwandten FABPs mit Techniken wie Röntgenkristallographie, Mikrokalorimetrie, NMR-, ESR-, Fluoreszenz- und Infrarotspektroskopie untersucht [6-19] und aufgeklärt.

Die nahe Verwandtschaft der FABPs untereinander wird vor allem in ihrer hochkonservierten Struktur deutlich, welche aus einem ß-Fa ß (,,ß-Barrel", ,,ß-Clam") besteht, sowie ihrer unimolekularen Affinität zu Monocarbonsäureliganden (mit Ausnahme des L-FABPs, welches bimolekulare Affinität aufweist). Ihren lipidbindenden Charakter zeigen die FABPs in mannigfaltigen Funktionen in praktisch allen tierischen Geweben. So sind zum Beispiel cytosolische Fettsäurebindungsproteine an der Regulation von Zellwachstum und -differenzierung beteiligt und die humanen M-, I-, H- und B-FABPs inhibieren die in vitro mRNA Translation konzentrationsabhängig (A-, L- und E-FABPs zeigen diesen Effekt nicht) [20].

Das in dieser Arbeit untersuchte Herz/Skelettmuskel-Fettsäurebindungsprotein (Heart skeletal muscle f atty acid-binding protein, H- FABP, Abbildung 1) wurde aus unterschiedlichen Geweben wie Herz-[ 22, 23] und Skelettmuskulatur [23, 24], Niere, Gehirn, Hoden, Ovarien, Bauchspeicheldrüse, Thymus und Nebennierengewebe [24-28] isoliert. Im Gegensatz zu einigen LBPs, die nur in einem oder einer kleinen Anzahl von Geweben exprimiert werden, findet man H-FABP in den meisten Geweben (siehe Tabelle 1).

H-FABP ist darüberhinaus sowohl ein nukleäres als auch ein cytosolisches Protein [50]. Wie Untersuchungen zeigen, ist das ursprünglich als Wachstumsinhibitionsprotein aus Säugetierzellen bezeichnete MDGI (,,mammary-derived growth inhibitor") eine Mischung aus H-FABP und A-FABP [47, 51]. Es wird in Milchdrüsen von säugenden Rindern exprimiert [45, 46]. Es konnte gezeigt werden,

Tabelle 1: FABPs und ihr Vorkommen in verschiedenen Geweben (aus [6])

daß H-FABP bei Inkubation von Karzinom-Zellen eine Beendigung des Wachstums, begleitet von einer Abnahme der Thymidinaufnahme [47] und der mRNA- Synthese bestimmter Transkriptionsfaktoren wie c-fos, c-myc und c-ras [52], bewirkt.

Immunohistochemische Vergleichsstudien von fötalem, postnatalem und adultem H-FABP aus Gehirn lassen eine wichtige Rolle dieser Proteine in den Entwicklungsstadien des Organismus′ vermuten [48]. Die Expressionsraten in den pre-und postnatalen Abschnitten von Rattenovarien korrelieren mit den Steroidhormonspiegeln [53]. Analysen der H-FABP Verteilung ergaben, daß nur Zellen, die extensive ß-Oxidation betreiben (z.B. Herzmuskel, rote Streckmuskulatur), Steroidsynthese durchführen (z.B. Nebennierenrinde) und/oder an der Resorption beteiligt sind (z.B. Speicheldrüse), H- ABP exprimieren [54]. Man kann H-FABP als kritische Komponente im Fettsäuretransport der Cardiomyocyten, insbesondere beim Weg vom Sarkolemma in das Innere der Mitochondrien, identifizieren. H-FABP kann Acylcarnitine binden und scheint Acylcarnitinbewegungen vom Cytosol zur äußeren Mitochondrienmembran für die dort stattfindende ß-Oxidation zu modulieren [55,56].

Darüberhinaus besitzt H-FABP die Fähigkeit freie Radikale abzufangen, insbesondere O- ₂ -, Hydroxyl-und Hypochloritradikale [57]. Das kann insbesondere im ischämischen Zustand von Bedeutung sein [58]. H-FABP behält 86% beziehungsweise 73% seiner Fettsäurebindungskapazität nach einer Inkubation mit O-₂ - beziehungsweise Hydroxylradikalen [59].

In der medizinischen Diagnostik kann FABP als frühzeitiger Indikator eines akuten Herzinfarktes dienen. Die Plasmakonzentrationen von FABP steigen innerhalb von drei Stunden nach einem Infarkt deutlich an und sinken in der Regel innerhalb von 12 Stunden wieder auf ihr Ausgangsniveau. Die Indikationswirkung von FABP übertrifft die des Myoglobins [60].

H-FABP wird im Rinderherz in zwei Isoformen gefunden, die sich nur in einer Aminosäure (Asp⁹⁸/Asn⁹⁸) und ihrem pI (4,9 bzw. 5,1) unterscheiden. Die verschiedenen Isoformen von H-FABP werden durch verschiedene mRNAs kodiert [61]. Das menschliche H-FABP-Gen wurde auf dem Chromosom 1p32-1p33 lokalisiert [62]. Die hier verwendete rekombinante Form entspricht der pI=5,1 Isoform aus Rinderherz, besitzt jedoch am aminoterminalen Ende einen zusätzlichen Methioninrest.