Die Wechselwirkung zwischen Proteinen und Polyphenolen

DIPLOMARBEIT

von

Sonja Lechner

zur Erlangung des akademischen Grades einer
Magistra
an der Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Karl-Franzens-Universität Graz

2003

Institut für Lebensmittelchemie und -technologie an der
Technischen Universität Graz

Inhaltsverzeichnis

1. EINLEITUNG ... 8
1.1 POLYPHENOLE ... 9
1.1.1 BIOVERFÜGBARKEIT UND STOFFWECHSEL ... 10
1.1.2 ERNÄHRUNGSPHYSIOLOGIE ... 11
1.2 PROTEINE ... 11
1.2.1 PROTEINFÄLLUNG ... 12
1.2.2 PROTEINDENATURIERUNG ... 12
1.2.3 LYSOZYM ... 13

2. ZIEL DER DIPLOMARBEIT ... 14

3 MATERIAL UND METHODE ... 15
3.1 MATERIALIEN ... 15
3.2METHODEN ... 17
3.2.1 CHROMATOGRAPHIE ... 17
3.2.2 HPLC (HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY) ... 17
3.2.3MASSENSPEKTROMETER (MS) ... 22

4 VERSUCHSBESCHREIBUNG ... 23
4.1 ANSATZ I ... 23
4.1.1 REAKTION VON QUERCETIN MIT LYSOZYM UND BSA BEI 37°C UND 60°C ... 23
4.1.2 AUFBEREITUNG DER PROBEN ... 23
4.1.3 ERGEBNIS ... 24
4.2 ANSATZ II ... 26
4.2.1 REAKTION VON QUERCETIN MIT LYSOZYM UND BSA BEI 60°C UND 80°C ... 26
4.2.2 AUFBEREITUNG DER PROBEN ... 26
4.2.3 ERGEBNIS ... 27
4.3 ANSATZ III ... 29
4.3.1 REAKTION VON QU. MIT LYSOZYM UND HÄMOGLOBIN BEI 60°C UND 80°C. ... 29
4.3.2 AUFBEREITUNG DER PROBEN ... 29
4.3.3 ERGEBNIS ... 30
4.4 GEGENPROBE (1) DER ANSÄTZE I-III ... 32
4.4.1 LYSOZYM UND QUERCETIN BEI 60°C UND 80°C ... 32
4.4.2 AUFBEREITUNG DER PROBEN (60°C UND 80°C) ... 32
4.4.3 ERGEBNIS ... 32
4.5 GEGENPROBE (2) DER ANSÄTZE I-III ... 33
4.5.1 GELELEKTROPHORESE (SDS-GELE) ... 33
4.5.2 AUFBEREITUNG DER PROBEN ... 35
4.5.3 ERGEBNIS ... 39
4.6 GEGENPROBE (3) DER ANSÄTZE I-III ... 40
4.6.1 VORVERSUCHE (AUSSCHLUSSPRINZIP) ... 40
4.6.2 REINIGUNG DER SÄULE ... 40
4.6.3 AUFBEREITUNG DER PROBEN ... 44
4.6.4 ERGEBNIS ... 45
4.7 ÜBERPRÜFUNG DER METHODE VON HARSHADRAI M. RAWEL ET.AL. (2000) ... 49
4.7.1 MOTIVATION FÜR DIESE ÜBERPRÜFUNG ... 49
4.7.2 AUFBEREITUNG DER PROBEN ... 49
4.7.3 ERGEBNIS ... 50

5 ERGEBNISSE UND DISKUSSION ... 52
5.1 FRAGESTELLUNGEN ... 52
5.2 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE ... 62

6. LITERATUR ... 63

7. ANHANG ... 65
7.1 ABKÜRZUNGEN ... 65
7.2 NORMIERTE WERTE (MULTIPLIKATIONSFAKTOR 3,45) ... 66
7.3 METHODEN ... 67

Zusammenfassung
Würde Quercetin bei höheren Temperaturen an ein Protein binden, so würde es für den Stoffwechsel nicht mehr zur Verfügung stehen und damit die positive Wirkung z.B auf Herz-Kreislauf verlieren.

Die hier durchgeführten Experimente hatten zum Ziel, Informationen über die Stabilität von Quercetin zu erhalten. Ein möglicher Abbau kann durch kovalente Bindungen des Quercetins an das Protein erfolgen. Als Modell wurde die Reaktion von Quercetin mit Lysozym untersucht.

Die Ergebnisse zeigen, dass eine Stabilität sowohl von Quercetin als auch von Lysozym nach thermischer Behandlung bei 60°C gegeben ist. Nach thermischer Behandlung bei 80°C kommt er zu einer Reaktion von Quercetin und Lysozym wobei bei entstehen. Bei der Reaktion von Quercetin mit Lysozym entstanden ebenfalls Produkte.

Die Analysen haben ergeben das bei 80°C Reaktionen stattfinden. Als nächster Schritt wäre die quantitative Analyse und die Wiederholung der Versuche wichtig. Im Anschluß wäre zu prüfen, ob bei 80°C Quercetin abgebaut wird oder ob es zu Bindungen zwischen den Reaktionspartnern kommt. In weiterer Folge wäre die Identifizierung der entstandenen Produkte zu klären.

Abstract
Since several years it is assumed, that quercetin in food has an positiv impact on human health.

The aim of the experiments was to find out detailet information about the quercetin stability after thermal treatment on an qualitative level. Lowered quercetin concentration could be caused through covalent quercetin-protein binding. Exemplary, quercetin-lysozym reactions have been invastigated.

It can be concluded, that quercetin as well as lysozym shows stadle concentrations after thermal treatment at 60°C. At 80°C, the experimental results shows a decreased concentration of quercetin and lysozym as well. The results shows clearly a chemical reaction between both substances because a new substance has been detected.

Future work have to be focused on a more quantitative level of experiments to verify the results mentioned above. In this way, quercetin-lysozym reactions have to be separated from possible denaturation effects and exact determination of new reaction products should be done.

1. Einleitung
Primäre Pflanzenstoffe (z.B Kohlenhydrate) als auch Sekundäre Pflanzenstoffe (z.B Polyphenole) sind für die Ernährung des Menschen von großer Bedeutung. Die Sekundären Pflanzenstoffe spielten lange Zeit neben den Vitaminen und Mineralstoffen eine untergeordnete Rolle. Erst jetzt erkennt man die Wichtigkeit der sekundären Pflanzenstoffe indem man ihnen gesundheitsfördernde Eigenschaften und Schutzfunktionen zuschreibt. Zum Beispiel hemmen Polyphenole das Wachstum von Bakterien und Viren und schützen den Körper vor freien Radikalen.

Weit über 250 epidemiologische Studien belegen, dass ein hoher Gemüse- und Obstverbrauch sich auf viele Zivilisationskrankheiten positiv auswirkt. Dabei wurden die Essgewohnheiten von 265.118 Japanern überprüft. Die Studien ergaben eine Verringerung der Lebenserwartung von Rauchern um ca. 5 Jahre. Bei Studienteilnehmern die rauchten, regelmäßig Alkohol tranken und sich fleischreich und gemüsearm ernährten, lag die Lebenserwartung ca. 10 Jahre unter dem Durchschnitt. Die Krebs- oder Herzerkrankungen waren in dieser Gruppe deutlich erhöht.

Ein möglicher Gründe für die vorbeugende Wirkung von Obst und Gemüse ist vermutlich die Tatsache, das sekundäre Pflanzenstoffe freie Radikale fangen und diese unschädlich machen.

[http://www.atlantis-pharm.com/antioxi%20definition.htm; 08.Oktober 2003]

Freie Radikale sind instabile hochreaktive Atome oder Verbindungen, die mit
organischen Molekülen der Zelle reagieren und sie so funktionsuntüchtig machen.
Das Charakteristikum aller freien Radikale ist, dass sie ein ungepaartes Elektron
besitzen oder ihnen eines fehlt. Sie versuchen überzählige Elektronen los zu werden
oder eines einzufangen, den nur eine gerade Anzahl von Elektronen bewirkt einen
stabilen Zustand. Ein einsames Elektron ohne Partner bedeutet eine hohe
Reaktionsbereitschaft und ein aggressives Verhalten gegenüber anderen Molekülen.
Trifft ein freies Radikal auf eine organische Verbindung (z.B ungesättigte Fettsäuren)
wird es versuchen ein Elektron aufzunehmen oder abzugeben. Der unvollständige,
ungerade Elektronenzustand des freien Radikals wird auf ungesättigte Fettsäuren
übertragen. Die ungesättigte Fettsäure wird selbst zum Radikal. Die Aufgabe, z.B als Baustein der Zellmembran für einen stabilen Schutz nach außen zu wirken, geht verloren. Die ungesättigte Fettsäure versucht wieder ein Elektron aufzunehmen um wieder einen stabilen Zustand zu erreichen. So kommt eine Kettenreaktion zustande.

[...]