Bestimmung von androgenen und antiandrogenen Substanzen in wässrigen Umweltproben mit biologischen und chemischen Methoden

Diplomarbeit

zur Erlangung des Grades eines
Diplomingenieurs (Fachhochschule)
der Fachrichtung Chemie

vorgelegt der Prüfungskommission der Fachhochschule an der
Fachhochschule und Berufskollegs NTA, Isny im Allgäu

von

Stefan Spathelf

5. September 1999

Vorwort

[...]

Inhaltsverzeichnis

VORWORT
INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG

1 EINLEITUNG ... 1

2 THEORETISCHER TEIL ... 2
2.1 Substanzen mit hormonartiger Wirkung ... 2
2.1.1 Androgene Substanzen ... 2
2.1.2 Antiandrogene Substanzen ... 5
2.1.3 Östrogene und Gestagene ... 8
2.2 Weitere Substanzen, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden ... 9
2.2.1 Triphenylmethanderivate ... 9
2.2.2 α-Hexylzimtaldehyd ... 10
2.2.3 Tris(2-chlorethyl)-phosphat (TCEP) ... 10
2.2.4 Cortisol (Hydrocortison) ... 10
2.2.5 β-Sitosterol ... 11
2.3 Untersuchung auf (anti-)androgene Substanzen ... 11
2.3.1 Probenvorbereitung ... 12
2.3.2 Biologisches Screening ... 13
2.3.3 Chemische Spurenanalytik ... 18

3 EXPERIMENTELLER TEIL ... 21
3.1 Aufgabenstellung ... 21
3.2 Herstellung der verwendeten Lösungen ... 21
3.3 Biologische Analytik ... 23
3.3.1 Verschiedene allgemeine Methoden ... 23
3.3.2 Übertragung der Methode von Szelei et al. auf die hiesigen Laborbedingungen ... 24
3.3.3 Bestimmung der Abweichung innerhalb einer Zellkulturplatte ... 26
3.3.4 Übertragung auf 96-Well-Zellkulturplatten ... 27
3.3.5 Vergleich von Zellkulturplatten verschiedener Hersteller ... 28
3.3.6 Vergleich verschiedener Detektionsmethoden ... 28
3.3.7 Optimierung der Zellzahl und des Gehaltes an FBS im Kulturmedium ... 32
3.3.8 Vergleich zwischen Transferrin und Holo-Transferrin ... 35
3.3.9 Einfluss der Inkubationsdauer ... 36
3.3.10 Abweichung der Methode ... 37
3.3.11 Einfluss von Lösungsmitteln ... 38
3.3.12 Test verschiedener bekannter Antiandrogene ... 38
3.3.13 Konzentrations-Wirkungs-Kurve von Bicalutamid ... 40
3.3.14 Probenvorbereitung für wässrige Umweltproben ... 42
3.3.15 Zusammenfassung der Methode ... 42
3.3.16 Untersuchung von Einzelsubstanzen ... 45
3.3.17 Untersuchung von Umweltproben ... 52
3.4 Chemische Analytik ... 57
3.4.1 Entwicklung der GC/MS-Methode ... 57
3.4.2 Linearität ... 60
3.4.3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze ... 63
3.4.4 Probenvorbereitung für Umweltproben ... 63
3.4.5 Wiederfindung ... 63
3.4.6 Zusammenfassung der Methode ... 64
3.4.7 Untersuchung von Umweltproben ... 66

4 DISKUSSION ... 71

5 ANHANG ... 73
5.1 Massenspektren und Chromatogramme ... 73
5.1.1 5α-Androstane-3α,17β-diol ... 73
5.1.2 Androsteron ... 74
5.1.3 Etiocholan-3α-ol-17-on ... 75
5.1.4 Epiandrosteron ... 76
5.1.5 5α-Dihydrotestosteron ... 77
5.1.6 Testosteron ... 78
5.1.7 4-Androsten-3,17-dion ... 79
5.1.8 Methyltestosteron ... 80
5.1.9 β-Sitosterol ... 81
5.2 Verwendete Materialien ... 82
5.2.1 Geräte ... 82
5.2.2 Chemikalien ... 82
5.2.3 Verbrauchsmaterialien ... 85

6 LITERATURVERZEICHNIS ... 87

ZUSAMMENFASSUNG
Zur Untersuchung von Substanzen und wässrigen Umweltproben auf ihr androgenes und anti-androgenes Potenzial wurde eine biologische Methode unter Verwendung von MCF-7 AR-1 Brustkrebszellen etabliert. Sie ist weitgehend spezifisch und unterliegt nur geringen Einflüs-sen durch Östrogene, Gestagene und Cortisol. Mit diesem Verfahren wurden die wichtigsten Testosteronmetabolite und verschiedene Substanzen, die bereits in wässrigen Umweltproben gefunden wurden, untersucht. Die Testosteronmetabolite zeigten alle eine gewisse, unter-schiedlich ausgeprägte androgene Wirkung. Daneben konnte drei Triphenylmethanderivaten eine antiandrogene Wirkung nachgewiesen werden. Bei den anderen Einzelsubstanzen war keine eindeutige Wirkung feststellbar. Anschließend wurden verschiedene Wasserproben von Flüssen und Kläranlagen untersucht. Sämtliche Proben zeigten mehr oder weniger ausgeprägte androgene oder antiandrogene Effekte oder eine Kombination aus beiden. Eine Systematik war dabei nicht erkennbar.

Daraufhin wurde eine Methode zur chemischen Bestimmung von β-Sitosterol, Testosteron und dessen Metaboliten in obigen Proben entwickelt. Sie beruht auf einer Festphasenextraktion, anschließender Derivatisierung der Steroide zu den Trimethylsilylderivaten und Bestim-mung mittels GC/MS. Die Methode eignete sich allerdings nicht zur Untersuchung der stärker verschmutzten Proben. In den auswertbaren Wasserproben konnten die Substanzen Androsteron, 5α-Androstane-3α,17β-diol, 5α-Dihydrotestosteron und β-Sitosterol detektiert werden. Die Konzentrationen der Testosteronmetabolite lagen jeweils bei etwa 300 ng/l (≈ 1·10-9 mol/l). Die Nachweisgrenzen in den Umweltproben lagen zwischen 5,9 und 34,6 ng/l (20–119 pmol/l).

1 EINLEITUNG
In den letzten Jahren häufen sich Berichte über eine Zunahme von endokrinen Störungen bei Mensch und Tier, die unter anderem auf Substanzen natürlichen und synthetischen Ursprungs mit hormoneller Wirkung zurückgeführt werden. Es handelt sich dabei im Wesentlichen um Störungen der Geschlechtsdifferenzierung und Reproduktion bei verschiedenen Tieren. Außerdem wird angenommen, dass in diesen Substanzen eine Ursache für die in den letzten Jahrzehnten beobachtete deutliche Zunahme hormonabhängiger Krebserkrankungen in den Industrieländern liegt. Auch über eine durch diese Substanzen ausgelöste Abnahme der Spermienzahl beim Menschen wird spekuliert.

Die Forschung beschränkt sich derzeit weitgehend auf Substanzen mit östrogener Aktivität. So wurden in der Umwelt zahlreiche Substanzen gefunden, die ein östrogenes Potenzial aufweisen und aus unterschiedlichsten Quellen stammen. Dabei handelt es sich um von Mensch und Tier ausgeschiedene natürliche und synthetische Östrogene, Pflanzeninhaltsstoffe sowie Industriechemikalien.

Es ist zu erwarten, dass in der Umwelt nicht nur Östrogene, sondern auch andere endokrin wirksame Substanzen eine relevante Rolle spielen. So wurden in den letzten Jahren einige nichtsteroidale Umweltchemikalien mit antiandrogener Wirkung entdeckt.

Deshalb wird in der vorliegenden Diplomarbeit eine Methode zur In-vitro-Untersuchung von wässrigen Umweltproben auf ihr androgenes und antiandrogenes Potenzial etabliert. Als Basis für diesen Zellkulturtest dient die humane Brustkrebszelllinie MCF-7 AR-1. Mit Hilfe dieser Methode werden verschiedene Einzelsubstanzen und Umweltproben auf ihr androgenes und antiandrogenes Potenzial hin untersucht.

Zur Spezifizierung und Quantifizierung von natürlichen Androgenen und deren wichtigsten Metaboliten in wässrigen Umweltproben wird ein Verfahren mittels GC/MS nach vorheriger Silylierung entwickelt und angewandt. [1, 2]

[...]

[1] Umweltbundesamt: Substanzen mit endokriner Wirkung in Oberflächengewässern; For-schungsbericht 102 04 279; UBA-Texte 46/97; ISSN 0722-186X

[2] W. Schuller: Etablierung und praktische Anwendung eines Testsystems mit humanen Brustkrebszelllinien zum Nachweis estrogenartiger Wirkungen (E-Screen-Assay); Dis-sertation, Eberhard-Karls-Universität Tübingen, Fakultät für Biologie (1998)