Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
Landwirtschaftlichen Fakultät

Antibakterielle Wirkung von ausgewählten Naturstoffen auf das Wachstum von Listeria monocytogenes

Diplomarbeit
zur Erlangung des Grades: Diplom-Oecotrophologin (Dipl. – Oecotroph.)

vorgelegt von: Yvonne Kirsch
vorgelegt am: 11. August 2006

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ... I
Abbildungsverzeichnis ... IV
Tabellenverzeichnis ... VIII
Abkürzungsverzeichnis ... IX

1 Einleitung ... 1

1.1 Listeria Monocytogenes ... 2
1.1.1 Historischer Hintergrund ... 2
1.1.2 Eigenschaften und Vorkommen ... 3
1.1.3 L. monocytogenes in Lebensmitteln, mit besonderem Augenmerk auf Räucherlachs ... 3

1.2 Naturstoffe ... 5
1.2.1 Oleuropein ... 6
1.2.2 Vanillin und Vanillinsäure ... 6

1.3 Methylparaben ... 8

1.4 Ziel der Arbeit ... 9

2 Material ... 10

2.1 Mikroorganismen, verwendetes Primenpaar und Sonstiges ... 10
2.1.1 Mikroorganismen ... 10
2.1.2 Verwendetes Primerpaar ... 10
2.1.3 Sonstiges ... 11

2.2 Nährmedien ... 11
2.2.1 Für in vitro Versuche verwendete Nährmedien ... 12
2.2.2 Für in vivo Versuche verwendete Nährmedien ... 14

2.3 Naturstoffe ... 22
2.3.1 Oleuropeinhaltiger Olivenblätterextrakt ... 22
2.3.2 Vanillin ... 22
2.3.3 Vanillinsäure ... 23

2.4 Methylparaben ... 23

2.5 Das eingesetzte Lebensmittel ... 23

2.6 PUffer und Lösungen ... 24

2.7 Geräte, Chemikalien und sonstige Materialien ... 24
2.7.1 Geräte ... 24
2.7.2 Chemikalien ... 25
2.7.3 Sonstige Materialien ... 26

3 Methoden ... 28

3.1 In vitro Versuche: kulturell-mikrobiologische Methoden ... 28
3.1.1 Stammhaltung von L. monocytogenes ... 28
3.1.2 Allgemeine Anzucht von L. monocytogenes ... 28
3.1.3 Spezielle Anzucht von L. monocytogenes : die Wirkung der ausgesuchten Naturstoffe in unterschiedlichen pH- und Temperaturbereichen als in vitro Versuch ... 29
3.1.3.1 Oleuropeinhaltiger Olivenblätterextrakt ... 29
3.1.3.2 Vanillin ... 30
3.1.3.3 Vanillinsäure ... 31
3.1.4 Spezielle Anzucht von L. monocytogenes : die Wirkung von Methylparaben als in vitro Versuch ... 32
3.1.5 Messung des bakteriellen Wachstums ... 32

3.2 In vivo Versuche kulturell-mikrobiologisch Methoden ... 32
3.2.1 Probenentnahme ... 32
3.2.2 Kulturell-mikrobiologische Methoden zur Untersuchung des Keimstatus des Räucherlachses in Anlehnung an die LFGB § 64 Untersuchungsvorschriften ... 33
3.2.3 Versuchsaufbau zur Untersuchung der Wirkung von Vanillinsäure und Methylparaben, einzeln und in kombinierter Weise, auf das Wachstum von L. monocytogenes im Räucherlachs bei 7 und 30 °C als in vivo Modell ... 36
3.3 Molekularbiologische Methoden ... 38

3.3.1 DNA-Isolierung von L. monocytogenes aus Kultur und Räucherlachs ... 38
3.3.1.1 DNA-Isolierung von L. monocytogenes aus Kultur ... 38
3.3.1.2 DNA-Isolierung von L. monocytogenes aus Räucherlachs ... 39
3.3.2 Photometrische Reinheits- und Konzentrationsbestimmung isolierter DNA ... 40
3.3.3 Nachweis und Quantifizierung von L. monocytogenes-DNA mittels PCR ... 40
3.3.3.1 Quantitative Analyse mittels Real-Time PCR ... 41
3.3.3.1 Qualitative PCR-Analyse mit anschließender Agarose-Gelelektrophorese ... 44

4 Ergebnisse ... 47

4.1 In vitro Versuche: Wachstumskurve von L. Monocytogenes unter dem Einfluss verschiedener Zusatzstoffe  ... 47
4.1.1 Einfluss von oleuropeinhaltigem Olivenblätterextrakt auf das Wachstum von L. monocytogenes im Vollmedium ... 47
4.1.2 Einfluss von Vanillin auf das Wachstum von L. monocytogenes ... 48
4.1.2.1 Einfluss von Vanillin auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes
im Minimalmedium ... 49
4.1.2.2 Einfluss von Vanillin auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes im Vollmedium ... 52
4.1.3 Einfluss von Vanillinsäure auf das Wachstum von L. monocytogenes ... 56
4.1.3.1 Einfluss von Vanillinsäure auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes im Minimalmedium ... 56
4.1.3.2 Einfluss von Vanillinsäure auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes im Vollmedium ... 60
4.1.4 Einfluss von Methylparaben auf das Wachstum von L. monocytogenes ... 66
4.1.4.1 Einfluss von Methylparaben auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes im Minimalmedium ... 66
4.1.4.2 Einfluss von Methylparaben auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes im Vollmedium ... 70

4.2 In vivo Versuche kulturell-mikrobiologische Untersuchungen ... 75
4.2.1 Bestimmung des Keimstatus des Räucherlachses mittels kulturell–mikrobiologischer Methode ... 75
4.2.2 Einfluss von Vanillinsäure und Methylparaben auf das Wachstum von L. monocytogenes im Räucherlachs im 7 und 30 °C Lagerversuch ... 76
4.2.2.1 7 °C Räucherlachs Lagerversuch ... 76
4.2.2.2 30 °C Räucherlachs Lagerversuch ... 78

4.3 Molekularbiologische Untersuchung ... 80
4.3.1 DNA-Konzentrationen der in vitro Versuche ... 80
4.3.2 Vergleich der ermittelten DNA-Konzentration von L. monocytogenes mit der gemessenen OD600 im in vitro Versuch ... 82
4.3.3 DNA-Konzentrationen der in vivo Versuche ... 87
4.3.4 Vergleich der ermittelten DNA-Konzentration von L. monocytogenes mit der Keimzahl im in vivo Versuch ... 89
4.3.5 Überprüfung der Spezifität der PCR Produkte der Real-Time PCR ... 93
4.3.5.1 Analyse der Schmelzkurve und der Gelelektrophorese der PCR-Produkte der in vitro Proben ... 93
4.3.5.2 Analyse der Schmelzkurve und der Gelelektrophorese der PCR-Produkte der in vivo Proben ... 96

5 Diskussion ... 99

5.1 Oleuropin ... 100
5.2 Vanilin ... 102
5.3 Vanilinsäure ... 107
5.4 Methylparaben ... 111
5.5 Einsatz von Vanilinsäure und Methylparaben im Räucherlachs bei 7 und 30 °C ... 112
5.6 Vergleiche des kulturell-mikrobiologischen Nachweises von L. Monocytogenes mit der Molekularbiologischen Methode ... 115

6 Zusammenfassung ... 119

7 Ausblick ... 121

8 Literatur ... 122

1 Einleitung

Seit Anfang der 80er Jahre hat sich die Meinung der Konsumenten bezüglich der Anwendung von Konservierungsstoffen in Lebensmitteln sehr gewandelt (Gill & Holley, 2004). Der aufgeklärte und gesundheitsbewusste Verbraucher der heutigen Zeit wünscht sich einerseits hochwertige, naturbelassene, konservierungsstofffreie Lebensmittel. Andererseits verlangt er, dass diese keimfrei und möglichst lange haltbar sind (Fitzgerald et al., 2003).

Jedoch sind Lebensmittel in der Regel nicht frei von Keimen. Sie enthalten neben erwünschten Mikroorganismen, wie z. B. Milchsäurebakterien und Kulturschimmel, auch unerwünschte Keime wie Verderbnis- und Krankheitserreger. Zu Letzteren gehören die Listerien, wobei von den sechs Spezies, die zum Genus Listeria gehören, Listeria monocytogenes die weitaus bedeutendste humanpathogene Art ist (Krämer, 2002). Dieser Keim ist verantwortlich für die Listeriose, eine Lebensmittelinfektion. Eine Exposition verläuft bei gesunden Erwachsenen meist unbemerkt, stellt jedoch eine Gefahr für Schwangere und deren ungeborene Kinder, sowie für Immungeschwächte, vorwiegend ältere Personen, dar. Eine Infektion mit L. monocytogenes kann zu Früh- oder Totgeburt und Neugeborenenlisteriose bzw. zu Hirn- und Hirnhautentzündung und Sepsis führen. Diese Krankheitsformen verlaufen in 20-30 % der Fälle tödlich (McLauchlin, 1997). L. monocytogenes ist in der Umwelt weit verbreitet. Aus diesem Grund gibt es nur wenige frische Lebensmittel, die dieses Bakterium nicht enthalten. Besonders anfällige Produkte sind neben Weichkäse, Wurst, Fertigsalaten, gekühlten Fertiggerichten, abgepacktem Gemüse und Rohkost auch abgepackter Lachs und Räucherfisch (Becker & Holzapfel, 2000). Der Verzehr der letztgenannten Produkte stellt einen Listeriose-Risikofaktor dar, da L. monocytogenes sich leicht in geräuchertem Fisch nachweisen lässt, bzw. die Inokulation von geräuchertem Fisch mit L. monocytogenes zu einem sehr starken Wachstum führt. Den Wünschen der Verbraucher entsprechend, konservierungsstofffreie und lang haltbare Lebensmittel anbieten zu können, hat die Ernährungsindustrie begonnen, verstärkt die Wirkungsweise natürlicher antimikrobieller Substanzen zu erforschen. Verschiedene Pflanzen und die daraus gewonnenen Extrakte, die in Lebensmitteln aufgrund ihres Geschmackes und ihres Aromas eingesetzt werden, weisen die gewünschte antimikrobielle Wirksamkeit auf. Sie können somit eine Alternative zu den chemischen Konservierungsmitteln darstellen (Fitzgerald et al., 2005).
 

1.1 Listeria monocytogenes

1.1.1 Historischer Hintergrund

Frühere Berichte weisen darauf hin, dass L. monocytogenes aus Gewebeschnitten deutscher Patienten bereits 1891 und aus dem Liquor von Patienten mit Meningitis 1917 und 1920 isoliert werden konnte (Reed, 1958). Dennoch wurde das Bakterium erst 1926 vollständig beschrieben, als Murray et al. (1926) ein kurzes, grampositives, nicht sporenbildendes Stäbchenbakterium isolierten, das bei Kaninchen und Meerschweinchen 1924 den Ausbruch einer Tierseuche verursachte. Dieses Bakterium wurde, aufgrund der Tatsache, dass es die Monozyten im Blut infizierte, Bacterium monocytogenes genannt. Ein Jahr später isolierte Pirie den gleichen Organismus aus Wüstenrennmäusen in Südafrika und nannte diesen Listerella hepatolytica (Pirie, 1927). Für diese Gattung wurde 1940 zu Ehren von Dr. Lister, dem Entdecker der Antisepsis, der endgültige Name Listeria monocytogenes eingeführt. Die Erkrankung beim Menschen war bislang selten, so dass selbst in berühmten Lehrbüchern Listeria lange Zeit kaum beachtet wurde (Seeliger, 1989). Untersuchungen im Rahmen eines Listeriose-Ausbruchs in Kanada 1981, der durch kontaminierten Krautsalat verursacht wurde, trugen dazu bei, die Listeriose beim Menschen aufzuklären (Schlech et al., 1983). Die erste Diagnose für eine Listeriose-Erkrankung bei einem an Meningitis erkrankten Soldaten konnte während des Ersten Weltkrieges bestätigt werden (Rocourt, 1994). Dennoch machen verschiedene Historiker bereits die Listeriose als Ursache für Queen Annes 17 erfolglose Schwangerschaften im 17. Jahrhundert verantwortlich (Saxbe, 1972). Vor 1960 wurde nur von wenigen Fällen berichtet. Dahingegen wurden mehr als 10 000 Erkrankungen bis 1982 in der medizinischen Fachliteratur und mittlerweile Hunderte von Erkrankungen jährlich weltweit beschrieben (Rocourt, 1991; Rocourt & Brosch, 1991). Die ubiquitäre Verbreitung von L. monocytogenes in der Umwelt und dessen Fähigkeit selbst bei niedrigen Temperaturen bis +4 °C zu wachsen, können zu hohen Kontaminationen in verschiedenen Lebensmitteln führen (Rocourt, 1994).

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