Aus der Klinik und Polikliniken für Zahn-, Mund- und Kieferkrankheiten
der Universität Würzburg
Abteilung für Funktionswerkstoffe der Medizin und der Zahnheilkunde

Bestimmung des Zetapotentials von Calcium-Phosphat-Partikeln in wässriger und organischer Phase

Inaugural - Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde der
Medizinischen Fakultät
der
Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg

vorgelegt von

Kai-Uwe Felix Schimmang

Würzburg, Juni 2006

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung und Problemstellung ... 1

2. Kenntnisstand und Grundlagen ... 5
2.1 Calciumphosphate ... 5
2.1.1 Calciumhydrogenphosphat-Anhydrid (DCPA) ... 6
2.1.2 Tricalciumphosphate (TCP) ... 6
2.1.3 Tetracalciumphosphat (TTCP) ... 7
2.1.4 Hydroxylapatit (HA) ... 8
2.2 Calcium-Phosphat-Zemente (CPC) ... 8
2.2.1 Hydroxylapatit (HA) bildende Calcium-Phosphat-Zemente (CPC) ... 10
2.2.2 Bruschit (DCPD) bildende Calcium-Phosphat-Zemente (CPC) ... 12
2.2.3 Reaktivitätssteigerung durch Mahlung/mechanische Aktivierung ... 13
2.3 Disperse Systeme ... 14
2.3.1 Allgemeines Suspensionsverhalten ... 15
2.3.2 Stabilität einer Suspension ... 16
2.4 Zetapotential ... 19
2.4.1 Das Schichtenmodell nach Stern, Helmholz und Gouy-Chapman ... 19
2.4.2 Potentialverlauf im Schichtenmodell bei der Elektrophorese ... 22
2.4.3 Mechanismen zur Zetapotentialerhöhung ... 23
2.5 Elektrokinetische Effekte ... 24
2.6 In vivo/vitro Untersuchungen ... 27

3. Material und Methode ... 29
3.1 Zetapotentialmessaperatur (Zetasizer 3000) ... 29
3.2 Messdurchführung ... 32
3.3 Calciumphosphate ... 33
3.4 Suspensionsmedien ... 34
3.5 Antibiotika und Albumin ... 35

4. Ergebnisse ... 37
4.1 Zetapotentiale in wässriger Phase ... 37
4.2 Zetapotentiale in organischen Medien ... 38
4.3 Zetapotentiale in Gemischen aus wässriger und organischer Phase ... 39
4.4 Zetapotentiale in wässriger Phase mit Pufferlösung ... 40
4.5 Einfluss von Additiven auf das Zetapotential in wässriger Phase ... 41
4.6 Reproduzierbarkeit der Methode ... 44

5. Diskussion ... 47
5.1 Zetapotentiale in organischen Medien ... 47
5.2 Zetapotentiale in wässriger Phase durch Zusatz von Additiven ... 51

6. Zusammenfassung ... 55

7. Literaturverzeichnis ... 57

8. Anhang

1. Einleitung und Problemstellung
In den letzten Jahren ist die Nachfrage nach synthetischen Knochenersatzstoffen vor dem Hintergrund der schonenderen und schnelleren Rekonstruktion von Gesichts- und Schädelpartien drastisch gestiegen [1-3]. Körpereigene Knochensubstanz zu transplantieren ist wegen der guten Bioverträglichkeit derzeit die beste Möglichkeit zur Deckung eines Knochendefekts [4]. Da in der Regel eine Zweitoperation für die Entnahmestelle notwendig ist, aber auch eine begrenzte Verfügbarkeit des Knochens, sind die Bemühungen verständlich, den Kieferchirurgen verbesserte Ersatzfabrikate und optimierte Verarbeitungsmethoden anzubieten. Versuche mit nicht körpereigenen Knochenersatzwerkstoffen, beispielsweise mit Polymethylmethacrylat (PMMA)-Zementen [5] und Keramik-Formkörpern [6], führten zwar zum Erfolg, jedoch nicht ohne erhebliche Nachteile für den Patienten. PMMA-Zemente bieten zwar eine hohe mechanische Druckfestigkeit, binden aber unter einer exothermen Reaktion ab. Das kann zu Nekrosenbildung des umliegenden Gewebes führen. Darüber hinaus sind die Zemente vom Körper nicht abbaubar. Vorgeformte Keramikkörper aus gesintertem Hydroxylapatit sind zwar biokompatibel und verbinden sich bindegewebsfrei mit dem Knochen, können jedoch nicht resorbiert, bzw. zu Knochen umgewandelt werden [7, 8]. Die starren Körper stellen außerdem ein Problem bei der Anpassung an die Defektgröße dar. Als künstliche Zahnwurzel-Implantate ist ihr Einsatz aber gut vorstellbar [9]. Es wurde überlegt ein Material einzusetzen, das am Operationsort frei formbar ist und eine gute Bioverträglichkeit besitzt. Zemente auf Calciumphosphat-Basis besitzen diese Fähigkeiten und binden isotherm ohne Volumenänderung zu einer stabilen Zementmatrix ab [10].

Seit der Beschreibung der ersten Zementformulierung aus Calciumphosphaten durch Chow und Brown 1986 [11] wurden in den letzten Jahren viele verschiedene Zementtypen charakterisiert und auf ihre physikalischen und biologischen Eigenschaften untersucht. Beispiele dafür sind Pulvermischungen von α-/β-Tricalciumphosphat (TCP) mit Calciumcarbonat (CC) und primären Calcium-bis-dihydrogenphosphat (MCPA) [12, 13], Tetracalciumphosphat mit Calciumhydrogenphosphat (Monetit, DCPA) [14], bzw. mit Calciumhydrogen- Phosphat Dihydrat (Bruschit, DCPD) [15]. Bei einem Vergleich verschiedener Studien untereinander, ergibt sich trotz chemisch identischer Zusammensetzung der Calciumphosphat-Zemente (CPC) eine starke Schwankung der physikalischen Eigenschaften. Die Reaktivität der Zemente hängt hauptsächlich von der Lösungsrate der einzelnen Bestandteile ab. Diese wird in der Regel mit der Korngröße und somit über die spezifische Oberfläche eingestellt. Es ist daher besonders wichtig, eine gleich bleibende Größenverteilung und Durchmischung der Einzelbestandteile zu erreichen. Ergebnisse eigener Überlegungen und die Ergebnisse aus der Literatur lassen vermuten, dass das Zetapotential, das eng mit den Oberflächeneigenschaften verknüpft ist, mit der Reaktivität von Calciumphosphat-Partikeln in flüssiger Phase zusammenhängt. Zetapotential-änderungen von Materialien geben einen Anhaltspunkt über den Ionenaustausch zwischen der Hydratschicht um die Keramikpartikel und der Partikeloberfläche. Zetapotentialverläufe dienten auch dem Studium der Adsorption von Proteinen auf synthetischem HA [16] und spielen bei der Wechselwirkung der Werkstoffe mit Wirkstoffen und deren kontrollierten Freisetzung eine Rolle. Antibiotika, wie zum Beispiel Amoxicillinhydrat, Gentamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid, sind solche Wirkstoffe und könnten mit Hilfe der Zemente direkt an den Ort des infektiösen Geschehens transportiert werden [17, 18]. Änderungen der Ladungs- Verhältnisse an den Oberflächen können aber das Verhalten der Zementpaste während der Aushärtung entscheidend beeinflussen und zu negativen Ergebnissen führen. Die Bestimmung der Oberflächeneigenschaft ist somit die zwingende Voraussetzung für die Weiterentwicklung von Calcium-Phosphat- Zementen (CPC).

Ziel der Untersuchungen war die Bestimmung der Oberflächenladung verschiedener Calciumphosphate in Wasser bzw. organischem Suspensionsmedium. Mit Hilfe einer Zetapotential-Messapparatur der Firma Malvern Industries sollte untersucht werden, inwieweit das zur Feinstmahlung verwendete Medium eine elektrostatische Stabilisierung der Partikel bewirkt, und somit die Agglomeratbildung vermindert. Die Ergebnisse sollen dazu beitragen, geeignete Lösungen für hochwertige Mahlungen bzw. Mischungen von Calciumphosphatpulvern zu ermitteln, um somit die Partikelgrößen- Verteilung der CPC-Zementsysteme entsprechend zu optimieren. Daneben erfolgte eine Bestimmung der Wechselwirkung der Partikel mit Zusätzen, beispielsweise Natriumphosphaten, sowie mit pharmakologisch wirksamen Substanzen, wie Antibiotika, im Hinblick auf Adsorption der Wirkstoffe und Änderungen des Zetapotentials der Partikeloberfläche.

2. Kenntnisstand und Grundlagen
2.1 Calciumphosphate
Orthophosphorsäure H3PO4, eine dreibasige mittelstarke Säure, bildet den Ausgangsstoff für alle Ca-Phosphate. Sie bildet primäre (Dihydrogenphosphat), sekundäre (Hydrogenphosphat) und tertiäre Phosphate (Phosphat). Die Verbindungen mit Calcium lassen sich in unterschiedlichen molaren Ca/P-Verhältnissen differenzieren. Alle in der Tabelle 1 aufgeführten Calciumphosphatverbindungen, außer Fluorapatit, gehören zu dem Dreistoffsystem Ca(OH)2-H3PO4-H2O. Sie sind in der Reihenfolge ihres zunehmenden Ca/P-Verhältnisses und basischen Charakters geordnet. Eine genauere Übersicht über die physikalischen Eigenschaften der verschiedenen Verbindungen und ihrer Herstellung findet sich in der Literatur [19].

[...]

1. Costantino, P.D., C.D. Friedman, and A. Lane, Synthetic biomaterials in facial plastic and reconstructive surgery. Facial Plast. Surg, 1993. 9(1): p. 1-15.

2. Kamerer, D.B., B.E. Hirsch, C.H. Snyderman, P. Costantino, and C.D. Friedman, Hydroxyapatite cement: a new method for achieving watertight closure in transtemporal surgery. Am J Otol, 1994. 15(1): p. 47-9.

3. Pistner, H., J. Reuther, E. Reinhart, N. Kubler, and B. Priessnitz, [New hydroxylapatite cement for craniofacial surgery]. Mund Kiefer Gesichtschir, 1998. 2 Suppl 1: p. S37-40.

4. Nickell, W.B., M.J. Jurkiewicz, and K.E. Salyer, Repair of skull defects with autogenous bone. Arch Surg, 1972. 105(3): p. 431-3.

5. Breusch, S.J. and K.D. Kühn, Knochenzemente auf Basis von Polymethylmethacrylat. Der Orthopäde, 2003. 32: p. 41-50.

6. Kay, J.F., Bioactive surface coatings for hard tissue biomaterials. CRC Handbook of bioactive ceramics, 1990. 2: p. 111-122.

7. LeGeros, R.Z., Calcium Phospates in Oral Biology and Medicine. Karger, Basel, 1991.

8. Holmes, R., V. Mooney, R. Bucholz, and A. Tencer, A coralline hydroxyapatite bone graft substitute. Preliminary report. Clin Orthop, 1984. 188: p. 252-62.

9. Nishihara, K., Studies on artificial root therapeutics with newly tailored hydroxyapatite root. J. Jpn. Soc. Biomat., 1993. 11: p. 135-152.

10. Knepper-Nicolai, B., A. Reinstorf, I. Hofinger, K. Flade, R. Wenz, and W. Pompe, Influence of osteocalcin and collagen I on the mechanical and biological properties of Biocement. D. Biomol Eng, 2002. 19(2-6): p. 227-31.

11. Brown, W.E. and L.C. Chow, A new calcium phosphate, water-setting cement. Cements Research Progress, American Ceramic Society, Westervill, Ohio, 1986: p. 352-379.

12. Fernandez, E., J.A. Planell, S.M. Best, and W. Bonfield, Synthesis of dahllite through a cement setting reaction. J Mater Sci Mater Med, 1998. 9(12): p. 789-92.

13. Mirtchi, A.A., J. Lemaitre, and N. Terao, Calcium phosphate cements: study of the beta-tricalcium phosphate--monocalcium phosphate system. Biomaterials, 1989. 10(7): p. 475-80.

14. Chow, L.C., M. Markovic, and S. Takagi, Calcium phosphate cements; in Cements research progress 1997, L.J. Struble (Hrsg.). The Am. Ceram. Soc., Westerville, Ohio, 1998: p. 215-238.

15. Xie, L. and E.A. Monroe, Calcium phosphate dental cements. Mater. Res. Soc. Symp. Proc., 1991. 179: p. 25-39.

16. Matsumoto, M., T. Miyake, H. Noshi, M. Kambara, and K. Konishi, Zeta potential studies on the adsorption of proteins on a synthetic hydroxyapatite. Colloids and Sufaces, 1989. 40: p. 77-84.

17. Bohner, M., J. Lemaitre, P. Van Landuyt, P.Y. Zambelli, H.P. Merkle, and B. Gander, Gentamicin-loaded hydraulic calcium phosphate bone cement as antibiotic delivery system. J Pharm Sci, 1997. 86(5): p. 565-
72.

18. Zhang, Y. and M. Zhang, Calcium phosphate/chitosan composite scaffolds for controlled in vitro antibiotic drug release. J Biomed Mater Res, 2002. 62(3): p. 378-86.

19 Elliot, J.C., Structure and Chemistry of the Apatites and Other Calcium Orthophosphates. Elsevier, Amsterdam, 1994: p. 6.