Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut für Ernährungswissenschaft
Fachbereich Agrarwissenschaft, Oecotrophologie und Umweltmanagement

Untersuchungen zur genetischen Toxizität und Chemoprävention von Brassica-Pflanzensäften in humanen Hepatomzellen (Hep G2)

Nicola Höfer

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ... 1

2 Material und Methoden ... 4

2.1 Materialien ... 4
2.1.1 Chemikalien und Reagenzien ... 4
2.1.2 Lösungen ... 4
2.1.3 Verbrauchsmaterialien und Geräte ... 5
2.1.4 Benzo[a]pyren: Mutagen und Referenzkontrolle ... 6
2.1.5 Charakteristische Merkmale der HepG2-Zelllinie ... 7
2.2 Methoden ... 10
2.2.1 Probenvorbereitung des Pflanzenmaterials ... 10
2.2.2 Kultivierung und Behandlungsmethoden der Zellkulturen ... 12
2.2.3 Alkalische Einzelzellgelelektrophorese (Cometassay) ... 15
2.2.4 Gaschromatographie und Massenspektrometrie ... 21

3 Ergebnisse ... 28

3.1 Gentoxische Effekte von Brassica ... 29
3.2 Antigentoxische Effekte von Brassica ... 36
3.3 Gen- und antigentoxische Effekte: Zusammenfassende Betrachtung ... 44
3.4 Qualitative und quantitative Analyse von Isothiocyanaten ... 46
3.4.1 Anteil der Trockensubstanz ... 46
3.4.2 ITC-Konzentrationen in der Trockensubstanz ... 46
3.4.3 ITC-Konzentrationen im Pflanzensaft ... 48

4 Diskussion ... 49

4.1 Isothiocyanate in Brassicaceae ... 49
4.2 Gentoxizität von Brassicaceae und Inhaltsstoffen ... 49
4.2.1 Gentoxische Effekte von Isothiocyanaten ... 49
4.2.2 Gentoxische Wirkmechanismen von Isothiocyanaten ... 50
4.2.3 Gentoxizität von Brassicaceae ... 51
4.2.4 Untersuchungsergebnisse zur Gentoxizität von Brassicaceae versus bisherige Studienergebnisse ... 52
4.3 Antigentoxizität von Brassicaceae und Inhaltsstoffen ... 54
4.3.1 Chemoprotektive Wirkmechanismen von Isothiocyanaten ... 54
4.3.2 Antigentoxizität von Brassicaceae ... 58
4.3.3 Bisherige Untersuchungen zur Antigentoxizität von Brassicaceae-Pflanzensäften ... 60
4.3.4 Nachweis der krebs-präventiven Aktivität von Brassicaceae und Isothiocyanaten im Tierversuch und in epidemiologischen Studien ... 61
4.3.5 Pflanzensaft-Aufnahme des Menschen ... 64
Ausblick ... 66

5 Zusammenfassung ... 69

6 Literatur ... 71

7 Anhang ... 86

Originaldaten des experimentellen Teils ... 86

1 Einleitung

Jährlich erkranken in Deutschland etwa 395 000 Menschen an Krebs, davon versterben 210 000 Patienten an den Folgen ihrer Krebserkrankung (BERTZ et al. 2004). Maligne Neubildungen stellen dabei sowohl für Männer als auch Frauen nach Herz-Kreislauf-Erkrankungen die zweithäufigste Todesursache dar (DIFE 1999).
Neben genetischen Determinanten spielen exogene Faktoren, darunter vor allem Ernährungsfaktoren, eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung einer Krebserkrankung. Nach derzeitigen Schätzungen gehen Mediziner davon aus, dass etwa 30-35% aller Krebserkrankungen in der westlichen Welt durch Ernährungsfaktoren verursacht werden (KROKE und BOEING 2000). Es wird geschätzt, dass die Zahl der Krebsfälle mittels einer Ernährungsumstellung hin zu einer gesunden Ernährung, verbunden mit körperlicher Bewegung und dem Vermeiden von Übergewicht, um 30 bis 40 % vermindert werden könnte (WCRF 1997). Dies würde für Deutschland jährlich 120 000 bis 158 000 Krebsfälle weniger bedeuten.

Nach heutigem Kenntnisstand scheint ein hoher Verzehr von Obst und Gemüse eine protektive Rolle in der Ätiologie verschiedener Krebserkrankungen zu spielen (STEINMETZ und POTTER 1996, BLOCK et al. 1992, KOLONEL et al. 2000). Spezielle bioaktive Substanzen, wie sekundäre Pflanzenstoffe und Ballaststoffe, scheinen der Grund für die chemoprotektiven Effekte zu sein (STEINMETZ und POTTER 1996). Zu den wichtigsten sekundären Pflanzenstoffen gehören die Glucosinolate. Diese sind vorwiegend in Pflanzen der Familie Brassicaceae (syn. Cruciferae, dt. Kreuzblütler) zu finden (VERKERK et al. 1998). Dazu gehören Raps, Senf, Kresse, einzelne Rübenarten sowie Kohlgemüse (Brassica oleracea). Glucosinolate werden beim Kauen und Zerschneiden des Gemüses durch eine pflanzen-spezifische Myrosinase zu Isothiocyanaten (ITCs) metabolisiert. Auch ein intestinaler Abbau von Glucosinolaten zu Isothiocyanaten ist möglich (FAHEY 2001). Epidemiologische und experimentelle Daten liefern Hinweise, dass Brassicaceae und Isothiocyanate für eine Inhibition der Kanzerogenese verantwortlich gemacht werden können (VERHOEVEN et al. 1996; 1997, VAN POPPEL et al. 1999). Dabei scheinen die chemoprotektiven Effekte hauptsächlich auf einer Modulation fremdstoffmetabolisierender Enzyme zu beruhen (VERHOEVEN et al. 1997, CONAWAY et al. 2002, ZHANG 2004).
Auf der anderen Seite konnte für hohe Konzentrationen an Brassicaceae- Pflanzensäften und Isothiocyanaten nachgewiesen werden, dass sie selbst eine irreversible Transformation der DNA bewirken können, sprich gentoxisch wirken (KASSIE et al. 1996, 1999; KASSIE und KNASMÜLLER 2000). Bisherige Studienergebnisse zeigten, dass insbesondere die Pflanzensäfte Punktmutationen und DNA-Schäden in bakteriellen Testsystemen und chromosomale Aberrationen in Säugetierzellen induzieren können (KASSIE et al. 1996). Derzeit existieren nur wenige Daten, die sich mit dem gentoxischen Potential von Brassicaceae-Säften beschäftigen und eine Abwägung positiver und negativer Effekte möglich machen könnten.

Ziel der vorliegenden Arbeit war einerseits Pflanzensaft der Brassica oleracea-Arten Blumenkohl, Kohlrabi, Rot- und Weißkohl auf ihre gentoxischen Wirkungen zu untersuchen. Hierzu wurde die alkalische Einzelzellgelelektrophorese (Cometassay) eingesetzt. Der Cometassay ermöglicht einen Nachweis von DNA-Migration als Ausdruck von Doppelstrangbrüchen/Einzelstrangbrüchen, alkali-labilen Stellen, Exzisions-Reparaturstellen und DNA-DNA-/DNA-Protein-Quervernetzungen unter stark alkalischen Testbedingungen auf Einzelzellniveau (BRENDLER-SCHWAAB et al. 2005). Als Indikatorzellen wurden metabolisch kompetente humane Hepatomzellen (HepG2) eingesetzt. HepG2-Zellen exprimieren zahlreiche Enzyme des Phase-I- und Phase-II-Fremdstoffmetabolismus. Aus diesem Grund sind sie für gentoxische Experimente geeigneter als metabolisch inkompetente Zellsysteme oder Bakterien (KNASMÜLLER et al. 1998, 2004).
Zudem wurde das chemopräventive Potential der Pflanzensäfte von Blumenkohl, Kohlrabi, Rot- und Weißkohl im Cometassay mit HepG2-Zellen untersucht. Zu diesem Zweck wurden die Zellen zunächst gegenüber den Pflanzensäften und anschließend gegenüber dem Mutagen Benzo[a]pyren exponiert. Als Parameter für einen chemopräventiven Effekt wurde die durch die Pflanzensäfte verursachte Reduktion der Benzo[a]pyren-induzierten DNA-Migration ermittelt. Benzo[a]pyren wurde in den Versuchen zur Gentoxizität als Positivkontrolle eingesetzt.
Da insbesondere die Isothiocyanate für die gentoxischen und chemopräventiven Effekte der Gemüsesäfte verantwortlich gemacht werden, wurden die Brassica-Säfte mittels Gaschromatographie mit massenspektrometrischem Detektor (GC-MS/MS) auf Allyl- (AITC), Benzyl- (BITC), Methylthiobutyl- (MTBITC), Phenylethyl- (PEITC), Phenylisothiocyanat (PITC), Erysolin und Sulforaphan untersucht.
Zusätzlich wurde die Menge an Pflanzensaft ermittelt, die über eine Brassica- Gemüseportion aufgenommen werden kann und deren potentielle Verteilung im menschlichen Organismus berechnet. Anschließend erfolgte ein Vergleich der Gewebskonzentrationen mit den antigentoxisch wirksamen Pflanzensaftkonzentrationen.

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