Sequenzierung und Charakterisierung der
Triosephosphat-Isomerase aus Tenebrio molitor

Diplomarbeit
im Studiengang Biotechnologie
der technischen Fachhochschule Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades eines Diplom-Ingenieurs (FH)

vorgelegt von

Daniel Knobeloch

April/2002

Inhaltsverzeichnis

1. Aufgabenstellung ... 1

2. Zusammenfassung ... 2

3. Abkürzungsverzeichnis ... 3

4. Einleitung ... 5
    4.1 Rolle der TIM im Stoffwechsel ... 6
    4.2 Regulation der Glycolyse ... 7
    4.3 Triosephosphat-Isomerase in Insekten ... 7
    4.4 Struktur der Triosephosphat-Isomerase ... 8
        4.4.1 Aktives Zentrum ... 8
    4.5 TIM-Genomorganisation (Introns und Exons) ... 10
        4.5.1 Frühe-Intron-Theorie ... 10
        4.5.2 Späte-Intron-Theorie ... 10
    4.6 Sequenzierungsmöglichkeiten ... 11
    4.7 Rekombinante Expression ... 11
    4.8 Wahl des Organismus ... 12

5. Material ... 14
    5.1 Geräte ... 14
    5.2 Fein- und Biochemikalien ... 14
    5.3 Verbrauchsmaterialien ... 16
    5.4 Puffer ... 16
        5.4.1 Standardpuffer ... 16
        5.4.2 Puffer für Agarosegelelektrophorese ... 16
        5.4.3 Puffer für die Aktivitätsbestimmung ... 16
        5.4.4 Puffer für Einschlusskörper-Reinigung ... 17
        5.4.5 Puffer für Polyacrylamidgelelektrophorese ... 17
        5.4.6 Puffer für Affinitatschromatographie ... 18
            5.4.6.1 Ni-NTA-Säule ... 18
            5.4.6.2 9E10-Säule ... 18
    5.5 Kits ... 18
    5.6 Primer ... 19
    5.7 Vektoren ... 20
    5.8 Proteine ... 20
    5.9 Stämme ... 20
    5.10 Marker ... 21
    5.11 Präparat ... 21
    5.12 Medien ... 21
    5.13 Software ... 22

6. Methoden ... 23
    6.1 Nukleinsäure-Analytik ... 23
        6.1.1 RNA-Präparation ... 23
        6.1.2 cDNA-Synthese ... 23
        6.1.3 cDNA-Amplifikation ... 24
        6.1.4 Gelelektrophorese ... 25
        6.1.5 PCR-Reinigung ... 25
        6.1.6 Amplifikation der TIM-Sequenz ... 25
        6.1.7 DNA-Präparation und Sequenzierung ... 25
        6.1.8 RACE-PCR ... 26
    6.2 Konstruktion, Transformation und Expression ... 28
        6.2.1 pGP-S100 Vektor ... 28
            6.2.1.1 Ligation und Transformation ... 29
            6.2.1.2 Expression ... 29
        6.2.2 pGP-ST2 Vektor ... 29
            6.2.2.1 Ligation und Transformation ... 29
            6.2.2.2 Expression ... 29
        6.2.3 pCR T7/NT Vektor ... 30
            6.2.3.1 Konstruktion und Reinigung des Inserts ... 30
            6.2.3.2 Ligation und Transformation ... 31
            6.2.3.3 Expression ... 31
    6.3 Zellaufschluss ... 32
        6.3.1 French Press ... 32
        6.3.2 Ultraschall ... 32
    6.4 Proteinfraktionierung ... 32
        6.4.1 Probenvorbereitung ... 32
        6.4.2 Totallysat ... 32
        6.4.3 Lösliche und unlösliche Proteine ... 32
        6.4.4 Periplasma-Gewinnung ... 33
        6.4.5 Einschlusskörper-Reinigung ... 33
    6.5 Proteinreinigung (Affinitätschromatographie) ... 33
        6.5.1 Ni-NTA-Säule mit Stufenelution (pGP ST2) ... 33
        6.5.2 Ni-NTA-Säule mit linearer Elution (pCR NT/T7) ... 33
        6.5.3 9E10-Säule mit einfacher Elution (pCR NT/T7) ... 34
    6.6 Proteinanalytik ... 34
        6.6.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ... 34
        6.6.2 Western-Blot ... 34
        6.6.3 Coomassieblue-Farbung ... 35
        6.6.4 Aktivitätsbestimmung ... 35

7. Ergebnisse und Diskussion ... 36
    7.1 Sequenzierung der Triosephosphat-Isomerase ... 36
        7.1.1 RNA-Präparation ... 36
        7.1.2 Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion 
        (RT-PCR) ... 37
        7.1.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ... 38
        7.1.4 Reinigung, Minipräparation und Restriktionsanalyse ... 40
        7.1.5 Sequenzierergebnis ... 40
        7.1.6 Sequenzierung der DNA ... 43
        7.1.7 Intronvergleich ... 44
        7.1.8 5´/3´-Rapid Amplification of either 5´ or 3´ cDNA 
        Ends-Polymerase  ... 46
            7.1.8.1 5´ RACE-PCR ... 46
            7.1.8.2 5´ Nested-PCR ... 47
            7.1.8.3 3´-RACE-PCR ... 48
    7.2 Vektorenauswahl und Konstruktion der Inserts ... 49
        7.2.1 Konstruktion des Inserts für den pGP-S100-Vektor ... 49
        7.2.2 Konstruktion des Inserts für den pGP-ST2-Vektor ... 52
        7.2.3 Konstruktion des Inserts für den pCR-NT/T7-Vektor ... 53
    7.3 Expression in verschiedenen Systemen ... 54
        7.3.1 Expression in XL1 E.coli Zellen mit dem pGP-S100-Vektor ... 54
        7.3.2 Expression in XL-1 E.coli Zellen mit dem pGP-ST2-Vektor ... 56
        7.3.3 Affinitätschromatographie an der Ni-NTA-Saule ... 57
        7.3.4 Expression in BL21(DE3) pLysS E.coli Zellen mit dem 
        pCR-T7/NT-Vektor  ... 60
        7.3.5 Affinitätschromatographie an der Ni-NTA-Säule ... 61
        7.3.6 Affinitätschromatographie an der 9E10 Säule ... 64
    7.4 Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase ... 66
        7.4.1 Aktivitätsbestimmung ... 66
        7.4.2 Strukturmodellierung ... 67
        7.4.3 Strukturvergleich ... 68
    7.5 Abschlußdiskussion ... 71

8. Literatur ... 73

1. Aufgabenstellung

• Ziel der Arbeit ist es, die Triosephosphat-Isomerase aus Tenebrio molitor zu sequenzieren.
• Lokalisierung der Introns in diesem Gen.
• Konstruktion eines vollständige Proteinsequenz codierenden Gens zur Klonierung in einen Vektor.
• Expression dieses Proteins in einem ausgewählten Wirt.
• Erstellen eines Reinigungsprotokolls für das exprimierte Protein und anschließende Aktivitätsbestimmung.

2. Zusammenfassung
Die Sequenzierung und Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase (TIM) aus Insekten wurde nach einer Internet-Datenbankrecherche der geeignete Organismus Tenebrio molitor aus der Klasse der Käfer ausgewählt. Aus dessen Larve, die eine ausreichende Menge an Total-RNA aufweist, um die erfolgreiche Transkription in cDNA zu erlauben, konnte ein Teil im Geninneren befindlicher Sequenz amplifiziert und sequenziert werden. Bei der anschließenden Sequenzierung der genomischen DNA mittels spezifischer Primer, deren Sequenz-Abfolge aus der mRNA abgeleitet wurde, konnte die Position eines Introns lokalisiert und deren Basenabfolge bestimmt werden. Der Intronpositionsvergleich mit den zurzeit in Insekten bekannten Introns erbrachte eine neue Position, die nur in einer anderen noch nicht veroffentlichen TIM-Sequenz aus einem Kafer zu finden ist. Fur die Sequenzierung des 5´- und des 3´-Endes wurde das RACE-PCR-System (rapid amplification of either 5´ or 3´ cDNA ends-Polymerase-Kettenreaktion) verwendet. Dadurch konnte das noch fehlende 5´-Ende erfolgreich sequenziert werden. Nach Vergleich mit vollständig bekannten TIM-Sequenzen aus anderen Arten konnte das noch fehlende 3´ Ende auf eine Lange von 36 Basen bestimmt werden. Nach Vervollständigung der TIM-Sequenz durch Sequenzvergleiche mit bekannten TIM-Sequenzen aus Insekten und der anschließenden Herstellung eines Genkonstruktes fur ein Fusionsprotein, das sowohl den Nachweis als auch die Reinigung des Proteins erlaubt, konnte ein Expressionssystem verwendet werden, mit dem zurzeit die größtmögliche Menge an nativem Protein exprimiert werden kann. Dieses Fusionsprotein konnte über eine Affinitätschromatographie mittels myc-Tag gereinigt werden. Bei der gereinigten Proteinfraktion konnte eine Enzymaktivität mittels eines gekoppelten Aktivitätstestes nachgewiesen werden.

3. Abkürzungsverzeichnis

[...]

4. Einleitung
Die heute zur Verfugung stehenden molekularbiologischen Techniken ermöglichen eine detaillierte Aufklarung von Ablaufen in biologischen Systemen. Ein wesentlicher Beitrag wird durch die Sequenzierung der DNA und die Entschlüsselung der darin enthaltenden Informationen geliefert. Die sequenzielle Abfolge der Nukleotide in codierenden Regionen eines Gens bestimmt die Aminosäure-Sequenz, diese wiederum die dreidimensionale Struktur und damit die Funktion des jeweiligen Proteins. Proteine bilden die Basis aller biologischen Systeme. Zur Aufklarung biologischer Systeme gibt es verschiedene Losungsansatze. Eine Möglichkeit ist die vollständige Sequenzierung der genomischen DNA einzelner Organismen. Drosophila melanogaster war eines der ersten mehrzelligen Lebewesen, dessen Genom vollständig sequenziert und entschlüsselt wurde. Ein wesentlich größeres Vorhaben ist das Human Genom Projekt, bei dem erst kürzlich die genomische DNA des Menschen praktisch vollständig sequenziert wurde. Die Zuordnung und Interpretation solcher DNA-Sequenzen ist weit aufwendiger als die eigentliche Sequenzierung. Es entstehen Datenmengen im Megabasenbereich, deren Analyse und Annotierung nur noch automatisiert erfolgen kann. Dabei werden Sequenzvergleiche mittels Datenbanksuche durchgeführt. Eine andere Möglichkeit zur Klärung der Funktion eines Proteins bietet die Sequenzierung einzelner Proteine und spezieller codierender Bereiche auf der Ebene der DNA. Abhängig davon, ob das zu untersuchende Protein bekannt ist oder ob es sich um ein neues, unbekanntes Protein handelt, kann der experimentelle Aufwand sehr unterschiedlich sein. Als eine Möglichkeit lassen sich bei bereits bekannten, verwandten Proteinen durch Vergleich der codierenden Nukleotidsequenzen dieser Proteine Primer erstellen, die eine Amplifizierung der das unbekannte Protein codierenden Nukleotidsequenz mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ermöglicht.
Für die Sequenzierung und Charakterisierung in dieser Diplomarbeit wurde ein Protein ausgewählt, das besondere Kriterien erfüllt. Es sollte ein "kleines" Protein sein, also aus nur einer Domäne bestehen, die üblicherweise zwischen 100 bis 200 Aminosäure-Reste besitzt. Innerhalb des Organismus, aus dem die codierende Sequenz für das zu untersuchende Protein gewonnen wird, muss gewährleistet sein, dass dieses Protein keine multiplen Allele aufweist, ansonsten wurde diese Tatsache zu unterschiedlichen Ergebnissen bei der Sequenzierung fuhren. Daher ist es sehr hilfreich, wenn die proteincodierende Sequenz auf den Chromosomen homozygotisch vorkommt. Das ausgewählte Protein, die Triosephosphat-Isomerase (TIM), hat neben den bereits erwähnten, vorteilhaften Charakteristika, zusätzliche interessante Aspekte, die eine Sequenzierung nahe legen. TIM kommt ubiquitar vor und ist demnach in allen Pro- und Eucaryoten zu finden. Sie ist ein Schlüsselenzym des Glycolyse-Stoffwechselweges und darüber hinaus in Pflanzen am Calvin-Zyklus beteiligt.

4.1 Rolle der TIM im Stoffwechsel
Die Glycolyse, in deren Abfolge die Triosephosphat-Isomerase an fünfter Position vorkommt, ist ein Abbauweg der Glucose bei aerob und anaerob lebenden Organismen (Abb.1). In aeroben Organismen geht die Glycolyse dem Citrat-Zyklus und der Atmungskette voraus. Sie ist ein wesentlicher Bestandteil des Energiestoffwechsels. Unter aeroben Bedingungen tritt das Endprodukt Pyruvat in die Mitochondrien über und wird dort vollständig zu CO₂ und H₂O oxidiert. Unter anaeroben Bedingungen wird es in Ethanol oder Lactat umgewandelt. Der Glycolyse-Weg wird auch als Embden-Meyerhof-Parnas-Weg oder als Fructose-diphosphat-Weg bezeichnet. In einer Folge von zehn Reaktionsschritten wird dabei Glucose zu Pyruvat abgebaut. Die Gesamtreaktion der Glycolyse ist exergon und liefert eine Energie von zwei Mol ATP pro Mol Glucose.

[...]