Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Lehrstuhl für Feststoff- und Grenzflächenverfahrenstechnik

Optimierung der Proteinkristallisation im Hinblick auf Filtrationseigenschaften des Präzipitats

Kevin Moritz

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ... 1

1.1 Problemstellung ... 1
1.2 Aufgabenstellung und Ziel der Arbeit ... 2

2 Theoretischer Teil ... 4

2.1 Biochemische Grundlagen ... 4
2.1.1 Allgemeines zu Proteinen ... 4
2.1.2 Hühnereiweiß-Lysozym (HEWL) ... 8
2.1.3 Bovine Serum Albumin (BSA) ... 10
2.2 Grundlagen der Kristallisation ... 14
2.2.1 Kristallisationskinetik ... 14
2.2.2 Kristallstruktur und Habitus ... 16
2.3 Prozesstechnische Grundlagen ... 18
2.3.1 Energieeintrag ... 18
2.3.2 Reaktionstechnische Berechnungen ... 22
2.4 Grundlagen der Filtration ... 23

3 Experimenteller Teil ... 27

3.1 Materialien und Methoden ... 27
3.1.1 Kristallisation ... 27
3.1.2 Filtration ... 29
3.2 Kristallisationen ... 31
3.2.1 Kristallisation von HEWL ohne Energieeintrag ... 31
3.2.2 Kristallisation von HEWL im Rührkessel ... 32
3.2.3 Kristallisation von BSA ohne Energieeintrag ... 32
3.2.4 Kristallisation von BSA im Rührkessel ... 34
3.3 Filtrationen ... 35
3.4 Ergebnisse ... 37
3.4.1 Kristallisation von Lysozym ohne Energieeintrag ... 37
3.4.2 Rührkesselversuche mit Lysozym ... 41
3.4.3 Kristallisation von BSA ohne Energieeintrag ... 50
3.4.4 Rührkesselversuche mit BSA ... 55
3.4.5 Filtrationsergebnisse ... 60
3.5 Diskussion ... 66
3.5.1 Beurteilung der HEWL-Kristallisationen ... 66
3.5.2 Bewertung der Kristallisation von BSA ... 70

4 Zusammenfassung ... 73

Literaturverzeichnis ... X

Anhang A: Übersicht von gemessenen Werten ... XIV
Anhang B: Auflistung der verwendeten Materialien und Laborgeräte ... XX

1 Einleitung

1.1 Problemstellung

Biologische Makromoleküle gewinnen zunehmend an Bedeutung. Peptide, Enzyme und Proteine sind als Medikamente in der Medizin nicht mehr wegzudenken. Allein am Beispiel des Peptidhormons Insulin zeigt sich die steigende Nachfrage an industriell hergestellten Biomolekülen. Mittlerweile hat sich diese Nachfrage längst auf andere Bereiche ausgedehnt. Neben der Pharmabranche, mit ihrer Forderung nach hochreinen Substanzen, haben sich vor allem die Kosmetik-, Lebensmittel- und Haushaltsindustrie als Interessenten von biologisch wirksamen Substanzen erwiesen. Dabei kommt es neben der Reinheit, zusätzlich auf die Menge und damit auf die Wirtschaftlichkeit der Produktion an. Werden die geringen Mengen an therapeutischen und analytischen Proteinen meist mit kostenintensiven Methoden, wie der Chromatographie gewonnen, genügt den übrigen industriellen Proteinen oft eine partielle Aufreinigung. Beispielsweise werden für die Herstellung von Waschmitteln hydrolytische Depolymerasen (Enzyme) in Mengen von 100 kg bis zu mehreren Tonnen pro Jahr produziert [1, 2]. In solchen Prozessen, aber auch als erste Reinigungsstufe der Aufarbeitung zum hochreinen Protein, hat die Kristallisation entscheidende Vorteile gegenüber anderen Trennungsmethoden. Ein einfacher apparativer Aufbau, eine schnelle Prozessführung sowie eine kostengünstige Verfahrensauslegung sind nur ausgewählte Eigenschaften, die für eine Kristallisation sprechen.

Grundsätzlich hat sich gezeigt, dass die Proteinkristallisation den gleichen Prinzipien folgt, wie eine klassische Kristallisation von kleineren Molekülen. Erzeugen einer Übersättigung, meist durch Kühlung oder durch Zugabe von verdrängenden Substanzen, führt zu Keimbildung und Keimwachstum. Erweitert werden die Parameter einer Technischen Kristallisation durch die Proteinaktivität. Anders als bei gewöhnlichen Kristallen gilt es, neben der Optimierung der Ausbeute und Reinheit gleichzeitig eine Erhaltung der Aktivität zu gewährleisten [1]. Durch die typischen Eigenarten des Proteins führt dies unweigerlich zu Einschränkungen in der Prozessauslegung. Die geringe Belastbarkeit von Proteinen, vor allem gegenüber extremen Temperaturen und pH-Werten sowie die Unverträglichkeit mit bestimmten Fällungsmitteln, schließen von vornherein viele Kristallisationsmethoden aus. Ist ein Protein diesen zerstörenden Einflüssen ausgesetzt, verliert es zunehmend an Aktivität, denaturiert irreversibel und wird dadurch meist wertlos. In komplexen Systemen ist oft die Ausgangskonzentration an Protein zu niedrig, daher ist die Gewinnung von Proteinen durch gezielte Kristallisation aus Fermentationslösungen noch nicht weit verbreitet [1].
Die Auslegung einer Proteinkristallisation scheitert häufig an fehlenden Löslichkeitsdaten. Bislang existieren nur für wenige Proteine verlässliche Daten. Die Einflüsse der einzelnen Parameter einer Kristallisation im technischen Maßstab, beispielsweise im Rührkessel wurden noch nicht genauer untersucht und sind nicht vorhersagbar [1, 3, 4].
Ziel muss es sein, allgemein gültige Erkenntnisse für Proteinkristallisationen zu erhalten. Angesichts der Tatsache, dass jeder Proteintyp anders reagiert und jede Spezies eine individuell ausgeprägte Form eines Proteins besitzen kann, ist dies problematisch. Beispielsweise sind für Albumin starke Unterschiede festzustellen, je nachdem ob es vom Rind, Pferd, Mensch oder aus dem Hühnerei stammt.
Trotz aller Schwierigkeiten besitzt die Kristallisation viel Potential, eine noch wichtigere Rolle bei der Verarbeitung von Proteinen zu spielen.

1.2 Aufgabenstellung und Ziel der Arbeit

Zuerst wird in dieser Arbeit untersucht, welche Parameter die Proteinkristallisation beeinflussen. Dabei wird die Ausprägung dieser Einflussgrößen auf die Kristallisierbarkeit von Proteinen ermittelt und die Eigenschaften der Kristallisationsprodukte eruiert. Besonderes Interesse gilt hierbei der Filtrierbarkeit von Kristallsuspensionen. Ziel ist es, eine Erleichterung und Verkürzung der Filtration durch systematische Anpassung der Kristallisationsbedingungen zu erreichen. Für einen späteren Vergleich der Filtrationseigenschaften werden hierfür die Filtrationswiderstände an Modellpartikeln bekannter Korngrößenverteilung gemessen.

In ausgewählten Systemen bestehend aus Puffer, Salz und dem Protein Lysozym oder Albumin werden zunächst in Gefäßen ohne Energieeintrag Bedingungen gesucht, die einen geeigneten Kristallisationsbereich eingrenzen. Variablen sind hierbei Temperatur, Proteinkonzentration, pH-Wert, Salzart, Salzkonzentration und die Dauer der Kristallisation. Für die unterschiedlichen Bedingungen werden die Produkteigenschaften wie Partikelgröße und Morphologie mit dem Mikroskop sowie die Kinetik der Proteinkristallisation untersucht.

Mit der Erkenntnis geeigneter Kristallisationen werden dann Experimente in diskontinuierlich arbeitenden Rührkesseln mit verschiedenen verfahrenstechnischen Parametern durchgeführt, welche eine mechanische Abtrennung mittels Druckfiltration ermöglichen. Das Ergebnis der Kristallisation und Filtration hängt sowohl von der Wahl der chemischen als auch der verfahrenstechnischen Einflüsse ab. Hinsichtlich der chemischen Einflüsse gilt es, eine Optimierung von Salzkonzentration, Salzart sowie Proteinkonzentration bei gleichzeitiger Erhaltung der Proteinaktivität durchzuführen. Bezüglich verfahrenstechnischer Parameter sind bei der Kristallisation die Temperatur, Rührerdrehzahl und die Geometrie des Rührkörpers maßgeblich. Außerdem ist es wichtig, die Verweilzeit des Präzipitats im Rührkessel so zu wählen, dass einerseits möglichst viele Kristalle gewonnen, andererseits diese nicht wieder durch zu langes Rühren zerstört werden. Die durchgeführten Rührkesselkristallisationen sind anhand der Kristallisationskinetik, der Korngrößenverteilung und der Produktbeschaffenheit zu beurteilen. Im Rührkessel hergestellte Kristalle sind bezüglich ihrer Qualität mit geeigneten Methoden zu untersuchen.

Nach Beendigung der Kristallisation sollen die Filtrationseigenschaften in einer Druckfiltrationsanlage bestimmt werden. Es soll versucht werden, möglichst große und eng verteilte Partikel herzustellen, da sich bei der Druckfiltration der Widerstand des Filterkuchens vorwiegend durch die Korngrößenverteilung beeinflussen lässt. Daher ist das Ziel die Minimierung des Filterkuchenwiderstands mit einhergehender Verkürzung der Filtrationszeit.

Beide Hauptziele, Optimierung der Kristallisation und Optimierung der Filtration, sind entscheidend, um in einem industriellen Prozess ein trocknungsfähiges, konfektionierbares, stabiles und konkurrenzfähiges Produkt zu erhalten.

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