Universität Leipzig
Fakultät für Biowissenschaften
Pharmazie und Psychologie

Diplomarbeit

Beziehungen zwischen somatischen Mutationen im Tumorgewebe
und bekannter Keimbahnmutation der Gene BRCA1 und BRCA2
beim hereditären Mammakarzinom

vorgelegt von: Heinz-Jürgen Voß
vorgelegt am: 25. März 2004

Inhaltsverzeichnis

1. Einführung in die Problematik ... 1

1.1. Erblicher und sporadischer Brustkrebs ... 2

1.2. Ablauf der Karzinogenese ... 3

1.3. An der Auslösung von Brustkrebs beteiligte Gene ... 5
1.3.1. BRCA1 – breast cancer susceptibility gene 1 ... 6
1.3.2. BRCA2 – breast cancer susceptibility gene 2 ... 9
1.3.3. Weitere Brustkrebs-beeinflussende Gene und BRCAX ... 12

1.4. Charakteristika erblichen Brustkrebses ... 15

1.5. Diagnose und Prävention bei familiärem Brustkrebs ... 16

1.6. Zielstellung ... 18

2. Material und Methoden ... 19

2.1. Auswahl der Patientinnen ... 19

2.2. Angewandte Methoden ... 23
2.2.1. Entparaffinieren und Separation der Tumorzellen ... 23
2.2.2. Isolierung genomischer DNA ... 24
2.2.2.1. Phenolreinigung ... 24
2.2.2.2. Invisorb Kit ... 25
2.2.2.3. Qiagen Kit ... 25
2.2.2.4. Chelex Spurenisolierung ... 26
2.2.3. Reinigung genomischer DNA ... 27
2.2.4. Photometrische Konzentrationsbestimmung ... 27
2.2.5. Polymerasekettenreaktion (PCR) ... 27
2.2.6. Gelelektrophorese ... 34
2.2.7. Sequenzierung ... 34
2.2.7.1. Probenvorbereitung ... 35
2.2.7.1.1. Reinigung der PCR–Produkte ... 35
2.2.7.1.2. Sequenzierreaktion ... 36
2.2.7.1.3. Fällung ... 36
2.2.7.2. Sequenzieren ... 37
2.2.7.2.1. Reinigung der Platten ... 37
2.2.7.2.2. Zusammensetzen der Gelkammer und Gießen des Gels ... 37
2.2.7.2.3. Sequenzervorbereitung und Probenauftrag ... 38
2.2.8. Untersuchung des Methylierungsstatus ... 39
2.2.8.1. Deaminierung ... 39
2.2.8.2. Reinigung ... 40
2.2.8.3. Methylierungsspezifische PCR ... 40

2.3. Übersicht über verwendete Reagenzien ... 42

2.4. Übersicht über genutzte Geräte ... 46

3. Ergebnisse ... 48

3.1. Tumormaterial der Patientinnen ... 48
3.2. DNA-Isolierung, PCR und Gelelektrophorese ... 48
3.3. Reinigung genomischer DNA und photometrische Konzentrationsbestimmung ... 50
3.4. Mutationsprofil des Tumorgewebes ... 51
3.5. Loss of heterozygosity als second hit ... 52
3.6. Hypermethylierung als second hit ... 54

4. Diskussion ... 57

4.1. Methodendiskussion ... 57
4.1.1. Tumormaterial der Patientinnen ... 57
4.1.2. Isolierung genomischer DNA ... 57
4.1.3. Reinigung genomischer DNA ... 58
4.1.4. Photometrische Konzentrationsbestimmung ... 58
4.1.5. PCR ... 59
4.1.6. Gelelektrophorese ... 59
4.1.7. DNA-Sequenzierung ... 60
4.1.8. Hypermethylierung ... 61

4.2. Ergebnisdiskussion ... 62
4.2.1. Mutationsprofil im Tumorgewebe ... 62
4.2.2. Loss of heterozygosity beim Mammakarzinom ... 63
4.2.3. Hypermethylierung ... 65
4.2.4. Weitere Ereignisse, die zum vollständigen Verlust der Expression führen könn(t)en ... 66
4.2.5. Ansatzpunkte für weitergehende Untersuchungen ... 66

Anhang:

I. Zusammenfassung ... I
II. Abbildungsverzeichnis ... II
III. Tabellenverzeichnis ... III
IV. Literaturverzeichnis ... IV
V. Patientenmaterial und kooperierendes Institut ... XIX
VI. BRCA1-Primer – Herstellung der Endkonzentrationen von 10 μM aus den Stammlösungen ... XX

Danksagung

1. Einführung in die Problematik

Krebserkrankungen stellen nach Erkenntnis der Weltgesundheitsorganisation (WHO) mit 12,5%, nach Herz-Kreislauferkrankungen (29,2%) und Infektionen¹ (26,2%), die dritthäufigste Todesursache weltweit dar² [WHO Jahresbericht, 2003(1)]. In der Bundesrepublik Deutschland und in anderen industrialisierten Staaten sind Krebserkrankungen die zweithäufigste Todesursache [Statistisches Bundesamt, 2003; WHO Jahresbericht, 2003(2)]. Entsprechend verständlich ist das Interesse von Wissenschaft und Gesellschaft, die Ursachen der Krebsentstehung zu erkennen und Behandlungsmöglichkeiten zu entwickeln.

Voraussetzung für die Entwicklung eines Tumors sind genetische Veränderungen in einzelnen oder mehreren Zellen, die bereits in der Keimbahn vorhanden sein können oder somatisch entstehen. Keimbahnmutationen manifestieren sich in allen Zellen des betroffenen Individuums vor und können an Nachkommen weitergegeben werden. Somatische Veränderungen entstehen dagegen spontan und bleiben i.d.R. auf wenige Zellen beschränkt. Für die Krebsentstehung sind immer mehrere Veränderungen notwendig. Von einem Tumor wird deshalb erst dann gesprochen, wenn durch eine progressive Abfolge von Veränderungen die Stadien der Immortalisierung³ und Transformation⁴ durchschritten wurden. Durch weitere genetische Veränderungen kann der Tumor „bösartiger“ werden und aggressiv Metastasen⁵ bilden. In der Regel sind sechs bis sieben Mutationen für die Entstehung eines Tumors notwendig. Bei Vorliegen einer Keimbahnmutation kann dagegen schon eine weitere somatische Mutation für die Ausbildung eines Tumors ausreichend sein. Im Fall einer vorhandenen Keimbahnmutation wird deshalb von einer genetischen Prädisposition gesprochen [Lewin, 1998 (S. 911 - 14); Alberts et al, 1995 (S. 1489 - 1509)].

Im Rahmen der Diplomarbeit wurden Gewebeproben von Patientinnen und Patienten⁶, die an einem Mammakarzinom (Brustkrebs) erkrankt waren, untersucht. In der Arbeit wird in einer „Einführung“ auf bisherige Erkenntnisse der Brustkrebsentstehung eingegangen. In diesem Zusammenhang werden die Charakteristiken und die Entstehung von familiärem und sporadischem Brustkrebs und wichtige involvierte Gene und Auswirkungen auf betroffene Patientinnen erläutert. In den folgenden Kapiteln, „Material und Methoden“, „Ergebnisse“, „Diskussion“, werden Auswirkungen sporadischer Veränderungen auf die Brustkrebsentwicklung an einer Patientinnengruppe (n=16) mit erblichen Gendefekten in den Genen BRCA1 und BRCA2 (breast cancer susceptibility genes 1 und 2) nachvollzogen.

1.1. Erblicher und sporadischer Brustkrebs

Jährlich erkranken nach Angaben des Robert-Koch-Instituts 46.000 Frauen in der Bundesrepublik Deutschland an einem Mammakarzinom. 18.000 Frauen sterben jährlich an den Folgen dieser Erkrankung. Zwischen dem 35. und 55. Lebensjahr stellt Brustkrebs bei Frauen die häufigste Todesursache dar. Die Wahrscheinlichkeit einer Frau im Laufe ihres Lebens an Brustkrebs zu erkranken, liegt bei ca. 10%. [Deutsche Krebshilfe, 2002].

Die Ursachen des Mammakarzinoms sind multifaktoriell (Tabelle 1.1.1). Erst eine Vielzahl von genetischen und nichtgenetischen Veränderungen führen zum Ausbruch der Krebserkrankung. Nur ein Anteil von etwa 5 bis 20% aller Mammakarzinomerkrankungen kann mit angeborenen genetischen Prädispositionen in Verbindung gebracht werden [Kuschel et al, 2000; Wooster et al, 2003].

(Tabelle 1.1.1: Brustkrebs beeinflussende Faktoren; [Wawrzyn et al, 1999]. - in der Downloadversion enthalten)

Neben Veränderungen in den Genen p53 (Tumorprotein 53), ATM (ataxia teleangiectatica mutated) und PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten) sind vor allem Mutationen in den Genen BRCA1 und BRCA2 für die Entwicklung eines Mammakarzinoms entscheidend. Geht ihre Funktion verloren, steigt das Risiko für Brust- und Eierstockkrebs erheblich. Fünf bis zehn Prozent der erblichen Pankreas- [Arnold et al, 2001] und Prostatakrebserkrankungen [Cerhan et al, 1999; Gayther et al, 2000] sind ebenfalls auf Keimbahnmutationen in den Genen BRCA1 und BRCA2 zurückzuführen (Tabelle 1.1.2).

(Tabelle 1.1.2: Krebserkrankungsrisiko bei Mutationsträgern in den Genen BRCA1 und BRCA2; [Easton et al, 1997; Ford et al, 1998; Kuschel et al, 2000; Kiechle et al, 2003]. - in der Downloadversion enthalten)

1.2. Ablauf der Karzinogenese

Molekularbiologisch sind die Aktivierung von Onkogenen und die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen an der Krebsentstehung beteiligt. Onkogene sind Gene, deren Genprodukte Zellen transformieren können, so dass diese wie Krebszellen wachsen. Sie greifen in Signaltransduktionswege, Transportprozesse oder die Wachstumsregulation ein. Produkte von Onkogenen sind Wachstumsfaktoren, Kinasen, membrangebundene GProteine, Transkriptions-faktoren und Regulatoren des Zellzyklus. Proto-Onkogene codieren für wachstumsfördernde Faktoren. Bei einer mutationsbedingten Änderung eines Proteins, einer Überexpression, einer Expression in „falschen“ Zelltypen und/oder dem Nichtabschalten der Expression können sie in ein Onkogen übergehen. Tumorsuppressorgene codieren Genprodukte, die eine Kontrolle auf den Zellzyklus und das Zellwachstum ausüben. Sie wirken bei der Zelladhäsion, der Signaltransduktion, der Kontrolle der Transkription, der DNA-Reparatur, kontrollieren den Zellzyklus oder induzieren Apoptose. Der Wegfall dieser Kontrolle führt zu einer vermehrten und unregulierten Zellteilung und damit zur Tumorbildung. BRCA1 und BRCA2 sind Beispiele für Tumorsuppressorgene. Sie wirken bei der Kontrolle der Transkription, des Zellzyklus und der DNA-Reparatur.

[...]

1 “Infectious and parasitic diseases and Respiratory infections”

2 Angaben für das Jahr 2002

3 Immortalisierung beschreibt den Zustand einer Zelle, unbegrenzt zu wachsen, ohne dass sich der Phänotyp (das äußere Erscheinungsbild) ändert.

4 Durch die Transformation ist die Zelle nicht mehr in der Lage, normale Wachstumsbeschränkungen einzuhalten. Sie wird von Faktoren unabhängig, die sie normalerweise für das Zellwachstum benötigt.

5 Die Metastasierung beschreibt das Stadium, in der die Zelle die Möglichkeit erlangt, in normales Gewebe einzudringen. Sie kann das ursprüngliche Gewebe verlassen und im Körper „Kolonien“ bilden.

6 Es wurden 15 Frauen und 1 Mann untersucht. Die im Folgenden verwendeten weiblichen Bezeichnungen schließen alle Probanden ein und tragen der Bedeutung von Brustkrebs insbesondere für Frauen Rechnung.