Aus der Abteilung für Klinische Pharmakologie
Medizinische Klinik Innenstadt
der Ludwig-Maximilians-Universität München

Aufklärung der Struktur-Wirkungsbeziehungen von CpG-A- und
CpG-C-Oligodesoxynukleotiden als Grundlage für die
Entwicklung immunstimulatorischer Nanopartikel

Dissertation

zum Erwerb des Doktorgrades der Humanbiologie
an der Medizinischen Fakultät der
Ludwig-Maximilians-Universität zu München

vorgelegt von: Christine Richter

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ... 8

1.1 Das humane Immunsystem ... 8
1.1.1 Die angeborene und die adaptive Immunität ... 8
1.1.2 Toll-like Rezeptoren - Erkennungssysteme der angeborenen Immunität ... 9
1.1.3 Typ-I Interferon - ein Effektor der angeborenen Immunität ... 13
1.1.4 Dendritische Zellen - Mittler zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunität ... 14
1.1.5 B-Zellen - Effektorzellen der adaptiven Immunität ... 16

1.2 CpG-Oligodesoxynukleotide ... 17
1.2.1 Geschichtlicher Hintergrund: Von bakteriellen Lysaten zu synthetischer CpG DNA ... 17
1.2.2 Wirkung und Wirkmechanismen von CpG-DNA ... 19
1.2.3 Definition von drei Klassen synthetischer CpG-ODN: CpG A, CpG B und CpG C ... 21
1.2.4 Therapeutischer Einsatz von CpG-Oligodesoxynukleotiden ... 22

1.3 Ziele dieser Arbeit ... 25

2 Material und Methoden ... 27

2.1 Geräte, Chemikalien und Reagenzien ... 27
2.1.1 Geräte ... 27
2.1.2 Verbrauchsmaterialien ... 27
2.1.3 Chemikalien ... 28
2.1.4 Reagenziensätze ... 28
2.1.5 Materialien für die Zellkultur ... 28
2.1.6 Zytokine ... 29
2.1.7 Zellkulturmedien, Puffer und Lösungen ... 29
2.1.7.1 Medien und Puffer für die Zellkultur ... 29
2.1.7.2 Puffer und Lösungen für die Gelelektrophorese ... 29
2.1.8 Antikörper für die Durchflusszytometrische Analyse ... 30

2.2 Oligodesoxynukleotide ... 30
2.2.1 Zur Zellstimulation eingesetzte Sequenzen ... 30
2.2.2 Zur Gelelektrophorese eingesetzte Sequenzen ... 31
2.2.3 Temperatur-Präinkubation von ODN 2216 ... 34
2.2.4 Temperatur-Präinkubation von ODN M362 ... 34

2.3 Polyvalente Linker ... 35
2.3.1 Polyvalente Linker - CpG DNA ... 35
2.3.2 Trivalente Linker - palindromische RNA ... 36
2.3.3 Poly-L-Arginine als Transfektionsreagenzien ... 36
2.3.3.1 Herstellung des ‚Master-Mixes‛ zur Transfektion ... 36

2.4 Zellulär – immunologische Methoden ... 37
2.4.1 Isolation der gewünschten Zellpopulation ... 37
2.4.1.1 Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes ... 37
2.4.1.2 Plasmazytoide dendritische Zellen ... 38
2.4.1.3 Gesamt B-Zellen (CD19+) ... 39
2.4.2 Herstellung autologen Serums ... 39
2.4.3 Zellkultur ... 39
2.4.4 Durchflusszytometrie (FACS-Analyse) ... 40
2.4.4.1 Grundprinzip der FACS-Analyse ... 40
2.4.4.2 Durchflusszytometrische Bestimmung der Reinheit von plasmazytoiden dendritischen Zellen und B-Zellen ... 41
2.4.5 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ... 42
2.4.5.1 Zytokine ... 42
2.4.5.2 Proliferation (BrdU-ELISA) ... 42

2.5 Molekularbiologische Methoden ... 43
2.5.1 Gelelektrophorese ... 43
2.5.1.1 Prinzip der Gelelektrophorese ... 43
2.5.1.2 Prinzip der Detektion von Digoxigenin-markierten Oligodesoxynukleotiden ... 44
2.5.1.3 Prinzip der Detektion von DNA durch Ethidiumbromidfärbung ... 45
2.5.1.4 Durchführung der Gelelektrophorese ... 45
2.5.1.5 Blotting und Detektion Digoxigenin-markierter Oligodesoxynukleotide ... 45
2.5.1.6 Färbung mit Ethidiumbromid ... 46
2.5.1.7 Auswertung der Gelbilder ... 47
2.5.2 Partikelgrößenbestimmung durch Zetapotenzialmessung ... 47
2.5.2.1 Grundprinzip ... 47
2.5.2.2 Durchführung der Messung ... 48

2.6 Statistische Analyse ... 48

2.7 Software ... 48

3 Ergebnisse ... 49

3.1 Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehungen von CpG-A und CpG C ... 49
3.1.1 Untersuchung des Klasse A Oligodesoxynukleotids 2216 ... 49
3.1.1.1 CpG A bildet Nanopartikel im Größenbereich von Viren ... 49
3.1.1.2 Entwicklung der Temperatur-Präinkubationsmethode zur experimentellen Kontrolle der Multimerisierungen ... 50
3.1.1.3 Strukturelle Analyse: CpG-A multimerisiert im physiologischen Milieu ... 51
3.1.1.4 Identifizierung des zentralen Palindroms als notwendiges Element zum Aufbau größerer Partikel aus G Tetraden ... 53
3.1.1.5 Identifizierung der Natriumionen als wichtiges stabilisierendes Element zum Aufbau der G-Tetraden ... 54
3.1.1.6 Große Partikel sind die Voraussetzung zur raschen Induktion hoher Mengen von Interferon-alpha in plasmazytoiden dendritischen Zellen ... 55
3.1.1.7 Die Präinkubation von PDCs mit Interferon-beta verstärkt die Induktion von Interferon alpha durch Einzelstränge ... 57
3.1.1.8 B Zellen werden von kleinen Partikeln und Einzelsträngen des ODN 2216 nicht aktiviert ... 58
3.1.1.9 Strukturelle Analyse: Die Multimere öffnen ihre Bindungen bei pH < 6 ... 59
3.1.2 Untersuchung des Klasse C Oligodesoxynukleotids M362 ... 60
3.1.2.1 Strukturelle Analyse bei 4 °C: Die Stabilität der Duplices hängt von den anwesenden Natrium- oder Magnesiumionen ab ... 61
3.1.2.2 Strukturelle Analyse bei 37°C: Weder Duplices noch Hairpins sind im physiologischen Milieu stabil ... 62
3.1.2.3 Übertragung der Ergebnisse der strukturellen Analyse auf den Zellversuch ... 65

3.2 Design immunstimulatorischer Partikel unter Einsatz wirksamer Strukturelemente von CpG-A und CpG C ... 66
3.2.1 Polyvalente Linker - palindromische CpG DNA ... 66
3.2.1.1 Strukturelle Analyse ... 67
3.2.1.2 Starke Induktion von Interferon alpha in PBMCs nach Transfektion mit Poly L Arginin ... 68
3.2.1.3 Screening verschieden langer Poly-L-Arginine als Transfektionsreagenzien ... 69
3.2.1.4 Poly-L Arginin verbessert die endozytotische Aufnahme der Polyvalenten Linker ... 70
3.2.1.5 Untersuchung der CpG-Abhängigkeit des immunstimulatorischen Effektes ... 71
3.2.1.6 Wirkung der transfizierten Polyvalenten Linker auf plasmazytoide dendritische Zellen und B-Zellen ... 71
3.2.2 Trivalente Linker - palindromische RNA ... 73
3.2.2.1 Strukturelle Analyse: PVL-RNA multimerisieren zu definiert aufgebauten, großen Strukturen ... 74
3.2.2.2 Induktion von Interferon-alpha in PBMCs nach Transfektion mit Poly-L-Arginin ... 75

4 Diskussion ... 77

4.1 Methodendiskussion ... 77
4.1.1 Möglichkeiten und Grenzen der Gelelektrophorese zur Simulation physiologischen Milieus ... 77
4.1.2 Wahrscheinlichkeit von strukturellen Veränderungen der PVL-Partikel durch die Inkubation mit Poly-L-Arginin ... 77

4.2 Struktur-Wirkungsbeziehungen von ODN 2216 (CpG A) ... 80
4.2.1 Zusammenspiel aus Poly-Guanin-Sequenzen, Palindrom und monovalenten Kationen (Na+/K+) zur Strukturbildung im physiologischen Milieu ... 4.2.1.1 Bildung von G Tetraden aus Poly-Guanin Motiven ... 81
4.2.1.2 Multimerisierungen von G-Tetraden-Grundstrukturen zu größeren Partikeln mit Hilfe des zentralen Palindroms ... 81
4.2.1.3 Stabilisierung der G-Tetraden durch zentral eingelagerte monovalente Kationen (Na+/K+) ... 82
4.2.2 Definierter Partikelaufbau trotz konzentrationsabhängiger Umlagerungen ... 83
4.2.3 Die Multimerisierung zu höhermolekularen Strukturen ist die Voraussetzung für die hohe Induktion von Interferon-alpha in plasmazytoiden dendritischen Zellen ... 84
4.2.4 Erklärungsmodelle für die hohe Induktion von Interferon-alpha durch große 2216 Partikel ... 85
4.2.4.1 Aktivierung eines autokrinen feedback-loops für Interferon alpha durch CpG-A ... 86
4.2.4.2 Clustering und Crosslinking von TLR 9 ... 87
4.2.5 TLR 9-Bindung einzelsträngiger ODN 2216 während der endosomalen Azidifizierung ... 88
4.2.6 Interpretation der geringen B-Zell-Aktivierung durch CpG A ... 88

4.3 Das Palindrom als zentrales Element in den Struktur-Wirkungsbeziehungen von ODN M362 (CpG C) ... 89
4.3.1 Eigenschaften Palindrom-basierter Strukturen von ODN M362 ... 89
4.3.2 Differenzielles Verhalten Palindrom-basierter Duplices im physiologischen Milieu: Aktivität trotz Strukturlabilität ... 91
4.3.3 Palindrom-basierte (Einzelstrang-) Effekte? ... 95

4.4 Design immunstimulatorischer Partikel unter Einsatz wirksamer Strukturelemente von CpG A und CpG C ... 96
4.4.1 Interpretation der strukturellen Analyse ... 97
4.4.2 Modelle der durch die palindromischen Nukleinsäuren ermöglichten Multimerisierungen trivalenter Linker ... 98
4.4.3 Differenzielles Aufnahmevermögen für große Partikel bei plasmazytoiden dendritischen Zellen und B Zellen ... 99
4.4.4 Verbesserte Aufnahme oder wirkungssteigernde Umlagerungen durch Poly L Arginin? ... 100
4.4.5 Palindromische RNA als partikelaufbauendes Element ... 101

4.5 Ausblick ... 101
4.5.1 G Tetraden-basierter Strukturaufbau immunstimulatorischer Partikel ... 102
4.5.2 Palindrom-basierter Strukturaufbau immunstimulatorischer Partikel ... 103

5 Zusammenfassung ... 105

6 Literaturverzeichnis ... 108

Verzeichnis der Abkürzungen und Akronyme ... 116

Veröffentlichungen ... 118

Danksagung ... 119

1 Einleitung

1.1 Das humane Immunsystem

Das Immunsystem (lateinisch: immunis = frei, unberührt) ist ein komplexes System aus Zellen, Molekülen und Mechanismen, dessen Hauptaufgabe darin besteht, den Körper vor Infektionen durch fremde Substanzen und Organismen, aber auch vor entarteten eigenen Zellen z. B. Tumoren zu schützen. Dieser Unterscheidung zwischen ‚selbst‛ und ‚fremd‛, wie auch ‚harmlos‛ und ‚gefährlich‛, folgen die direkte Bekämpfung der Krankheitserreger und der Aufbau eines wirkungsvollen Schutzsystems gegen das erneute Eindringen des Pathogens.

1.1.1 Die angeborene und die adaptive Immunität

Der Ablauf dieser Immunantwort kann grundsätzlich über zwei unterschiedlich aufgebaute immunologische Effektorsysteme erfolgen: 1) die angeborene (unspezifische) und 2) die adaptive (spezifische) Immunität. Die angeborene Immunität ist bereits auf der Entwicklungsstufe der Eukaryoten entstanden und dient der initialen Abwehr von Krankheitserregern. Sie kann diese jedoch nicht spezifisch erkennen und daher auch keinen Schutz gegen eine erneute Infektion (ein immunologisches Gedächtnis) entwickeln. Der Erkennungsprozess der angeborenen Immunität erfolgt über Rezeptoren, die in der sog. Keimbahn kodiert sind, wodurch ihre Spezifität genetisch festgelegt ist. Dies ist von großem Vorteil, weil gerade diese Rezeptoren, deren Spezifität sich unter dem Selektionsdruck der Evolution herausgebildet hat, nun von Generation zu Generation weiter gegeben werden. Sie werden pattern recognition receptors (PRRs) genannt und erkennen evolutiv hoch-konservierte Strukturen, die viele Mikroorganismen gemeinsam haben. Diese Strukturen werden als pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) bezeichnet und sind nicht im Wirtsorganismus zu finden. Sie sind jedoch essentiell für das Überleben der Erreger oder manchmal deren Pathogenitätsdeterminanten.

Eine erste Barrierefunktion gegen extrazelluläre Erreger erfüllen die Epithelien, welche die inneren und äußeren Oberflächen des Körpers bedecken, die Opsonisierung durch Komplementaktivierung sowie die Erkennung und Beseitigung der Mikroorganismen durch Makrophagen. Bei intrazellulären Erregern gestaltet sich die Abwehr schwieriger. Eine wichtige Rolle spielen natürliche Killerzellen (NK Zellen), die die befallenen Zellen erkennen und vernichten, und Interferone (IFN) - Zytokine, die den Körper in eine Art Alarmzustand versetzen und als Katalysatoren der Immunantwort die zelluläre Immunität initiieren.

Auch wenn das angeborene Abwehrsystem gerade für die frühe Immunantwort von entscheidender Bedeutung ist, gelingt es ihm jedoch häufig nicht alleine, den Erreger zu vernichten. Ein infektiöser Organismus, der diese ersten Abwehrlinien durchbricht, muss dann über die adaptive Immunantwort bekämpft werden. Diese unterscheidet sich von der angeborenen Immunität aufgrund der spezifischen Erkennung der Mikroben und der Ausbildung eines immunologischen Gedächtnisses, das einen stärkeren Schutz gegen eine erneute Infektion bietet. Hauptakteure der adaptiven Immunität sind Antigen präsentierende Zellen (APCs), darunter fallen vor allem die dendritischen Zellen (DCs) und Makrophagen, aber auch B Zellen.

Die wichtigste Funktion erfüllen jedoch T- und B Lymphozyten mit Antigen spezifischen Rezeptoren, welche durch klonale Selektion entstanden sind. Jeder dieser Lymphozyten ist mit einem strukturell einzigartigen Rezeptor ausgestattet. Da diese Rezeptoren nicht in der Keimbahn kodiert sind, sind sie nicht prädestiniert, ein bestimmtes Antigen zu erkennen. Vielmehr werden aus der Vielzahl zufällig generierter Rezeptoren im Laufe des Lebens durch positive und negative Selektionsmechanismen nur diejenigen ausgewählt und klonal expandiert, die ein Fremd Antigen erkennen. Im Lymphknoten verursacht die Antigen-Präsentation der DCs die klonale Expansion der entsprechenden Lymphozytenklone und die adaptive Immunantwort, indem extrazelluläre Infektionserreger von den durch B Zellen produzierten Antikörpern gebunden werden und T Zellen infizierte Zellen töten und andere Immunzellen unterstützen. Ein Teil dieser proliferierenden Lymphozyten differenziert zu Gedächtniszellen. Die Aktivierung der T und B Zellen hängt neben den T- und B Zell-Interaktionen auch von den kostimulatorischen Molekülen und Zytokinen der angeborenen Immunität ab, daher resultiert eine effektive Immunantwort immer aus wirkungsvollen Interaktionen zwischen angeborener und adaptiver Immunität.

1.1.2 Toll-like Rezeptoren - Erkennungssysteme der angeborenen Immunität

Zu den wichtigsten Vertretern der PRRs zählt die Familie der Toll-like Rezeptoren. Das Toll Protein wurde erstmalig in der Drosophila-Fliege als Molekül identifiziert, das die dorsoventrale Polarität in der Embryogenese bestimmt und eine Rolle in der antifungalen Abwehr des Organismus spielt [Lemaitre et al. 1996]. Eine dem Toll homologe Rezeptorfamilie, die Toll like Rezeptoren (TLR), wurden schon bald bei Vertebraten identifiziert [Medzhitov et al. 1997]. Toll-like Rezeptoren zählen zu den evolutionär hoch konservierten Typ-I Transmembranproteinen [Anderson 2000]. Die extrazelluläre Domäne enthält leucine rich repeats (LRRs). Die intrazelluläre, zytoplasmatische Region ähnelt dem IL-1 Rezeptor, daher wird sie auch TIR (Toll/IL 1 Rezeptor) genannt, und enthält drei immunglobulinartige Domänen. Bis heute sind in Vertebraten 13 TLR, im humanen System 10 TLR identifiziert worden [Hornung et al. 2002; Takeda et al. 2003] und viele Liganden, zumeist mikrobiellen Ursprungs, beschrieben [Barton und Medzhitov 2003; Underhill 2003]. Zusätzlich werden auch endogene Liganden diskutiert, die während einer Entzündungsreaktion freigesetzt werden [Matzinger 1998]. Tabelle 1 gibt einen Überblick über die humanen Toll-like Rezeptoren und ihre Liganden. Die TLR 1, 2 und 6 können ihr PAMP-Erkennungsspektrum erhöhen, indem sie in Rezeptorwechselwirkungen treten und heterodimerisieren [Ozinsky et al. 2000].

CpG DNA viralen oder bakteriellen Ursprungs wird über den TLR 9 erkannt [Hemmi et al. 2000]. Dieser wird beim Menschen in plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDCs) und B-Zellen exprimiert und befindet sich im Gegensatz zu den meisten anderen TLR nicht auf der Zelloberfläche sondern im endoplasmatischen Retikulum, wo die Nukleinsäuren nach der Internalisierung der Viren und Bakterien freigesetzt werden. Die Interaktion von CpG DNA und TLR 9 erfolgt während der endosomalen Reifung. Dabei kommt es zu einem Anschwellen und Ansäuern des Endosoms und der Erzeugung von reaktiven Sauerstoff-Spezies [Yi et al. 1998]. Weitere an der Erkennung viraler und bakterieller Nukleinsäuren beteiligte TLR sind TLR 3 (Ligand: doppelsträngige RNA, dsRNA) und TLR 7 und 8 (Liganden: einzelsträngige RNA, ssRNA; Imidazoquinoline), welche ebenfalls in den endosomalen Kompartimenten der Zelle exprimiert werden (Tabelle 1 - in der Dwonloadversion enthalten).

Seit kurzem werden außerdem TLR unabhängige zytosolische Wege zur Detektion viraler Nukleinsäuren in der Literatur diskutiert, die ebenfalls antivirale Mechanismen wie z.B. die Produktion von Typ-I Interferon auslösen [Hornung et al. 2004, Yoneyama et al. 2004, Ishii et al. 2006, Stetson und Medzhitov 2006].

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