16.11.2006

Praktikum ,,Genetik und Molekularbiologie gramnegativer Bakterien"

Amplifikation und Klonierung von rDNA aus

Sinorhizobium meliloti

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

2. Material und Methoden

2.1. Isolierung chromosomaler DNA (Schnellverfahren)

2.2. Ansetzen der PCR

2.3. Kontrolle der PCR

2.4. Klonierung der Amplifikats

2.5. Kontrolle der Transformation

3. Ergebnisse

4. Diskussion

1. Einleitung

In diesem Versuch soll die 16S-rDNA des stickstofffixierenden Endosymbionten

Sinorhizobium meliloti

zunächst mit Hilfe einer PCR amplifiziert und anschließend mit Hilfe

von Transformation in

E.coli

kloniert werden.

Dazu wird zuerst die gesamte DNA der Bakterien in einem Schnellverfahren isoliert und

anschließend für die PCR eingesetzt. Diese ist in der Lage, auch aus einem komplexen DNA-

Gemisch eine bestimmte Gensequenz zu amplifizieren, wichtig sind hierfür jedoch u.a. die

richtige Wahl der Annealing-Temperatur und der Primer. Da es sich bei der 16S-rDNA um

hochkonservierte Sequenzen handelt (die z.B. auch für taxonomische Bestimmungen eine

bedeutende Rolle spielen), lassen sich hier unabhängig vom Bakterienstamm universelle

Primer einsetzen. Die Annealing-Temperatur wird, genauso wie die Auswirkung des für die

Replikation wichtigen Cofaktors Mg 2+, mithilfe mehrerer PCR-Ansätze getestet.

Nachdem mithilfe einer Gelelektrophorese der erfolgreichste Ansatz ausgewählt wurde (es

muss sich eine kräftige, dominierende Bande bei 1,5 kb zeigen), wird das amplifizierte Gen in

einen Vektor eingebaut und in den

E.coli

-Stamm JM109 transfomiert und anschließend

kloniert. Aus 10 Einzelkulturen wird schließlich die Plasmid-DNA isoliert und durch

Restriktionsanalyse kontrolliert.

Damit fasst dieser Versuch eine große Bandbreite molekularbiologischer Techniken

zusammen, von der DNA-Isolierung über die PCR bis zur Transformation und Klonierung.

2. Material und Methoden

Da das Skript eine ausführliche Beschreibung der Versuchsdurchführung enthält, sollen hier

nur Ergänzungen und Abweichungen aufgeführt werden. Nur die DNA-Isolierung wird noch

einmal Schritt für Schritt aufgeführt.

2.1. Isolierung chromosomaler DNA (Schnellverfahren)

1. Es wurden 2 mal 1,5 ml Zellen entnommen, 5 min bei 12000 rpm zentrifugiert, in je

1,5 ml kaltem NaCl gewaschen und dann in je 0,7 ml kaltem NaCl resuspendiert.

2. Die Suspensionen wurden 1 Stunde bei 4°C geschüttelt, anschließend zehnmal hin und

her pipettiert (zum Lösen der Bakterienkapseln).

3. Die Zellen wurden abzentrifugiert und in 200 µl Puffel L (enthält SDS) aufgenommen.