Aktivierung von Cyclophosphamid
in Extrakten aus embryonalen Hühnerlebern –
Entwicklung einer Methode zur quantitativen Bestimmung
eines Aktivierungsproduktes

Hausarbeit
im Fach naturwissenschaftliche Grundlagen
im Rahmen des Ersten Staatsexamens
für das Lehramt an berufsbildenden Schulen

vorgelegt von:
Aline Wipprecht

Juni 2006

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ... 10

1.1 Tierversuche, Ersatz- und Ergänzungsmethoden ... 10

1.2 Untersuchung von Metabolisierungswegen durch die Nutzung hepatischer Funktionen für in- vitro Verfahren ... 11

1.3 Die Entwicklung des Hühnerembryos ... 12

1.4 Entwicklung der embryonalen Hühnerleber ... 14

1.5 Cytochrom P 450 und die Biotransformation von Fremdstoffen ... 15
1.5.1 Cytochrom P 450 ... 15
1.5.2 Biotransformation von Fremdstoffen ... 15
1.5.3 Biotransformation von Cyclophosphamid ... 16
1.5.3.1 Cyclophosphamid ... 16
1.5.3.2 Metabolismus von Cyclophosphamid ... 17

1.6 Ziel der Arbeit ... 17

2 Materialien und Methoden ... 19

2.1 Materialien ... 19
2.1.1 Cyclophosphamid (Reaktant) ... 19
2.1.2 Acrolein (Produkt) ... 19
2.1.3 Sonstige Chemikalien ... 20
2.1.4 Biologisches Material ... 21

2.2 Methoden ... 21
2.2.1 Die Herstellung des gebrauchsfertigen Leberextraktes ... 21
2.2.1.1 Inkubation der Eier und Entnahme der Lebern ... 21
2.2.1.2 Extraktion und Fraktionierung des Lebergewebes ... 22
2.2.2 Pre-Test: Bestimmung der De-O-Ethylase-Aktivität des gewonnenen Leberextraktes mit Ethoxycoumarin ... 23
2.2.2.1 Bestimmung von Hydroxy- und Ethoxycoumarin im Fluoreszenzspektrometer ... 22
2.2.2.2 Durchführung des Enzymtests mit Ethoxycoumarin ... 23
2.2.2.3 Differentielle Extraktion von Ethoxy- und Hydroxycoumarin ... 24
2.2.3 Quantitative Bestimmung von Acrolein ... 25
2.2.3.1 Herstellung von Stammlösungen ... 25
2.2.3.2 Herstellung eines Derivatisierungsreagenzes zur fluorimetrischen Bestimmung von Acrolein ... 26
2.2.3.3 Die Derivatisierung von Acrolein zu 7- Hydroxychinolin und Herstellung von Eichkurven ... 26
2.2.3.4 Bestimmung von Acrolein mittels Messungen am Fluorimeter ... 27
2.2.3.5 Durchführung des Enzymtests zur Aktivierung von Cyclophosphamid ... 29
2.2.3.6 Neutralisieren der Enzymansätze ... 30
2.2.3.7 Extraktion von 7- Hydroxychinolin aus derivatisierten und neutralisierten Enzymansätzen ... 31
2.2.3.8 Bestimmung von Acrolein durch Dünnschichtchromatographie und densitometrische Auswertung der Chromatogramme ... 32
2.2.3.9 Proteinbestimmung nach Bradford ... 33

3 Ergebnisse ... 35

3.1 Aktivitätstest für Cytochrom P 450 mit 7- Ethoxycoumarin ... 35
3.1.1 Fluoreszenz von Ethoxy- und Hydroxycoumarin ... 35
3.1.2 Quantitative Bestimmung der Aktivität von Cytochrom P 450 mittels Messung der De-O-Ethylierung von Ethoxycoumarin zu Hydroxycoumarin ... 36

3.2 Kalibrierung der Fluoreszenzsignale von 7- Hydroxychinolin, dem Derivatisierungsprodukt aus Acrolein und 3- Aminophenol ... 38
3.2.1 Fluoreszenz von 7- Hydroxychinolin im Fluorimeter ... 38
3.2.2 Fluoreszenz von 7- Hydroxychinolin nach Dünnschichtchromatographie und Auswertung am Densitometer ... 40

3.3 Entwicklung einer Methode zur Isolierung von 7- Hydroxychinolin aus sauren Ansätzen mittels Neutralisation und anschließender Extraktion ... 41
3.3.1 Neutralisation der Derivatisierungsansätze ... 41
3.3.2 Extraktion von 7- Hydroxychinolin aus sauren und neutralisierten Derivatisierungsansätzen ... 42

3.4 Erfassung von Acrolein in Ansätzen mit Leberextrakt ... 43
3.4.1 Abhängigkeit der nachgewiesenen Acroleinmengen vom Volumen des eingesetzten Leberextraktes ... 44
3.4.2 Erfassung von Acrolein bei konstantem Volumen Leberextrakt im Enzymansatz ... 46
3.4.3 Auswirkung der Inkubationszeit auf die Erfassung von Acrolein ... 47

3.5 Aktivierung von Cyclophosphamid und Nachweis des Aktivierungsproduktes Acrolein mittels Dünnschichtchromatographie und densitometrischer Auswertung der Chromatogramme ... 48
3.5.1 Quantitativer Nachweis von Acrolein als Metabolisierungsprodukt von Cyclophosphamid in Abhängigkeit von der Zeit ... 49

4 Diskussion ... 51

5 Zusammenfassung ... 58

6 Literatur ... 60

7 Anhang ... 63

1 Einleitung

1.1 Tierversuche, Ersatz- und Ergänzungsmethoden

Die Prüfung von Lebensmitteln und deren Inhalts- und Zusatzstoffe sowie die Prüfung von Arzneimitteln, von kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenständen auf ihre gesundheitliche Unbedenklichkeit und Umweltverträglichkeit ist gesetzlich geregelt und erfolgt unter anderem im Tierversuch [1].

Laut Tierschutzgesetz spricht man dann von Tierversuchen, „…wenn zu Versuchszwecken Behandlungen und Eingriffe am Tier bzw. an dessen Erbgut vorgenommen werden, die mit Schmerzen, Leiden oder Schäden für das Tier bzw. für das Erbgut veränderte Tier verbunden sind“ [2].

In der Bundesrepublik Deutschland finden im Vergleich zu den Versuchstierzahlen anderer Verwendungsbereiche im Rahmen der Entwicklung und Prüfung von Arzneimitteln auf Grundlage der Bestimmungen zum Arzneimittelgesetz [3] die meisten Tierversuche statt [4]¹. Deshalb spielt der vom Gesetzgeber ausdrücklich geforderte Tierschutz im pharmazeutischen Bereich eine besondere Rolle. Es gilt daher, in diesem Bereich Prüfverfahren zu entwickeln, die einen geringeren oder schonenderen Einsatz von Versuchstieren bedeuten bzw. neben gebräuchlichen in-vivo- Verfahren auch Ersatz und Ergänzungsmethoden auf RRR– (Replacement, Refinement, Reduction) – Grundlagen anwenden[4].

Seit mehr als 100 Jahren wird nun bereits mit dem Hühnerembryo als Basisuntersuchungsmodell gearbeitet [5]. Mit der Entwicklung der HET- Embryotoxizitätsprüfung in den frühen 80- er Jahren wurden diese Grundlagenprüfungen erweitert und standardisiert. Die Prüfungen am bebrüteten Hühnerei (HET) liefern ebenfalls Informationen hinsichtlich der Embryoletalität, Retardierung, Teratogenität und systemischer Toxizität. Darüber hinaus lassen sich mit Hilfe dieser Methode aber auch Erkenntnisse zur Immunpathologie oder zu metabolischen Aspekten, wie sie im Rahmen dieser Arbeit von besonderem Interesse sind, gewinnen.

1.2 Untersuchung von Metabolisierungswegen durch die Nutzung hepatischer Funktionen für in- vitro Verfahren

Die oben genannte Testung am bebrüteten Hühnerei stellt laut Lüpke [5] einen Grenzfall zwischen in- vivo und in- vitro dar. Nach allgemeiner Ansicht kollidiert dies nicht mit ethischen und juristischen Aspekten, insbesondere der Tierschutzgesetzgebung.

Da das bebrütete Hühnerei in der Bundesrepublik Deutschland keinerlei tierschutzrechtlichen Restriktionen unterliegt, ist die innerhalb dieser Arbeit stattgefundene Entnahme embryonaler Hühnerlebern mit dem geltenden Gesetz vereinbar [2]. Auch ist laut Tierschutzgesetz §7, Abs. 1 eine „...Organentnahme aus dem zuvor getöteten Tier nicht als Tierversuch zu definieren…“ [4]. Tests mit aufbereiteten Hepatocyten sind zweifelsfrei als in- vitro- Verfahren zu betrachten. Die im Rahmen dieser Arbeit zu testenden Substanzen wurden nicht direkt in den Eikörper injiziert, eine invasorische Behandlung des lebenden Organismus fand also nicht statt.

Trotz allem weist die in- vitro- Nutzung des hier verwendeten Prüfmaterials engen Bezug zum Hühnereitest auf, da hier die Leber als Ort der Metabolisierung von zum Beispiel Xeno- oder Endobiotica als ein Baustein innerhalb einer Vielzahl von Prüfsystemen des Hühnerembryos, die im HET untersucht werden, isoliert betrachtet und auf seine Aktivität hin untersucht werden kann.

Die Mikrosomenaufbereitungen des entnommenen Lebergewebes eignen sich für die Prüfung metabolischer Aktivierung, da mithilfe dieses Testmaterials eine große Anzahl von in- vitro- Versuchen ermöglicht wird.

Bei in- vitro Metabolisationstests kann die Bestimmung der verstoffwechselten Substanzen durch direkten laborchemischen Nachweis erfolgen.

Das angebrütete Hühnerei ist in diesem Zusammenhang Gegenstand intensiver Forschungsarbeiten, insbesondere deshalb, weil es bereits sehr früh in seiner Entwicklung eine hohe metabolische Aktivität ausbildet.

Sicher stellt sich auch hier wie in anderen Prüfverfahren die Frage nach der Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den menschlichen Organismus. Denn die meisten in- vitro- Versuchsverfahren stellen nur ein monofaktorielles System dar. Verschiedene physiologische Abläufe innerhalb des in-vivo- Pharmakometabolismus wie der Leber- Nieren- Kreislauf oder der Leber- Darm- Kreislauf bleiben unberücksichtigt [7].

Jedoch bietet dieses in- vitro- Verfahren den Vorteil der Flexiblen Gestaltung der Experimente je nach Fragestellung. So zum Beispiel könnten Hepatozyten mit anderen Zelltypen kokultiviert werden, radioaktiv markierte Substanzen können einfach inkubiert und Hepatocyten oder Zellfraktionen für spätere Referenzversuche eingefroren werden. Da eine aufbereitete Leber ein Volumen liefert, welches hohe Versuchszahlen ermöglicht, kann aus diesem Prüfverfahren eine Reduktion von Tierversuchen resultieren.

Ein Verbundverfahren des BMBF ist bereits 1996 angelaufen, um die „...Nutzung hepatischer Funktionen für in-vitro- Verfahren zur Prüfung von Stoffen mit dem Ziel der Einsparung von Tierversuchen...“ zu erforschen [4].

Abschließend ist jedoch darauf hinzuweisen, dass sich in fortgeschrittenen Stadien der Arzneimittelentwicklung mit den angeführten Methoden abschließende Untersuchungen am Ganztier nicht ersetzen lassen.

1.3 Die Entwicklung des Hühnerembryos

Die Embryonalentwicklung aller Wirbeltiere ist ausschließlich in wässriger Umgebung möglich. Für terrestrisch lebende Organismen bedeutet dies die Erfordernis eines flüssigkeitsgefüllten Kompartimentes. Im Verlauf der Evolution entwickelte sich das von einer Schale umhüllte Ei der Reptilien, Vögel und Monotremen. Eine weitere Variante dieser Kompartimentiertung ist der Uterus placentaler Säuger. In Eischale und Uterus befinden sich die Embryonen in einer flüssigkeitsgefüllten Blase, dem Amnion, was zur Bezeichnung dieser Wirbeltierklassen als Amnioten beitrug [8].

Innerhalb der Klasse der Vögel (Aves) bilden die Hühnervögel (Galliformes) eine der insgesamt 28 Ordnungen [9], die wiederum in verschiedene Familien zu unterteilen sind. Die meisten Hühnervögel gehören der beinahe über die ganze Erde verbreiteten Familie der Fasanvögel (Phasianidae) an. Das Haushuhn, zu denen Rassen wie Leghorn, New Hampshire und Cochinchina gehören, stammt von einer weit verbreiteten Kammhuhnart, dem Bankivahuhn (Gallus gallus) ab [10].

[...]

1 Ein weiterer großer Teil der Versuche basiert auf den Bestimmungen des Chemikaliengesetztes (ChemG) und des Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetzes (LmBG) [Prisma]