Aspekte der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktion im

malignen Melanom

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der

Naturwissenschaftlichen Fakultät III ­ Biologie und Vorklinische Medizin ­ der

Universität Regensburg

vorgelegt von

Richard Bauer

aus Hutthurm

Juli 2005

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Abkürzung

Liste der verwendeten Abkürzungen

Amp Ampicillin

BSA Rinder-Serumalbumin

CAM

cell adhesion molecule

Cdh Cadherin

CDNA copy

DNA

DNA desoxyribonucleic

acid

EDTA Ethylendiamin-N´,N´,N´,N´,Tetraacetat

EGF

Epidermal growth factor

ELISA

enzyme linked immunosorbent assay

ERK

extracellular signal-related kinase

FACS

fluorescence activated cell sorting

FGF

fibroblast growth factor

FKS

Fötales Kälberserum

GSK3 Glykogensynthasekinase

3

H/120

120 kDa schweres Fibronektinfragment

HCR

highly conserved region,

Promotorelement

HMG1

high mobility group 1,

Transkriptionsfaktor

IP Immunpräzipitation

kb Kilobasen

kDa Kilodalton

LEF/TCF lymphoid

enhancer

factor/T cell factor

MAP

mitogen activated protein

MBP

myelin basic protein

MIA

melanoma inhibitory activity

MITF

microphtalmia associated transcription

factor

MMP matrix

metalloproteinase

mRNA messenger-RNA

1

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Abkürzung

NTF N-terminal

fragment

PAGE Polyakrylamidgelelektophorese

PAX3 paired

box

3

RACE

rapid amplification of cDNA ends

RGD Arginin-Glycin-Asparaginsäure

RGP

radial growth phase

RNA ribonucleic

acid

RT-PCR

reverse transcriptase polymerase chain

reaction

RTS

rapid translation system

SHC

Src homology collagen protein

SOX10 SRY-box

containing gene 10

uPAR urokinase

plasminogen

activated

receptor

UpM

Umdrehungen pro Minute

VCAM

vascular cell adhesion molecule

VE vascular

endothelial

VGP

vertical growth phase

Wnt

Wingless and Int

50K

50 kDa schweres Fibronektinfragment

2

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Inhaltsangabe

Inhaltsangabe

Liste der verwendeten Abkürzungen _____________________________________________ 1

Inhaltsangabe ________________________________________________________________ 3

1

Zusammenfassung________________________________________________________ 6

2

Einleitung _______________________________________________________________ 8

2.1

Struktur und Aufbau der Haut __________________________________________ 8

2.1.1

Funktion der Melanozyten ___________________________________________ 9

2.2

Das Maligne Melanom ________________________________________________ 10

2.2.1

Das Melanom ­ Geschichtlicher Hintergrund ___________________________ 10

2.2.2

Mortalität und Inzidenz des malignen Melanoms ________________________ 12

2.2.3

Proteine, die an der Entstehung des malignen Melanoms beteiligt sind _______ 12

2.3

Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle im malignen Melanom _______________________ 17

2.3.1 Cadherine ______________________________________________________ 17

2.3.2

Die Rolle der klassischen Cadherine im malignen Melanom _______________ 19

2.4

Zell-Matrix-Adhäsionsmoleküle im malignen Melanom _____________________ 21

2.4.1 Integrine _______________________________________________________ 21

2.4.2

Die Struktur der Integrine __________________________________________ 22

2.4.2.1

Die extrazelluläre Domäne _______________________________________ 23

2.4.2.2 Die

zytoplasmatische Domäne ____________________________________ 23

2.4.3

Die Rolle der Integrine im malignen Melanom __________________________ 24

2.4.4

Die Integrinexpression in Melanozyten ________________________________ 25

2.4.5

Die Integrinexpression im malignen Melanom __________________________ 25

2.5

Die Adhäsion von Zellen ______________________________________________ 26

2.5.1

Signalkaskaden, bei der Zell-Matrixadhäsion, ausgehend von Integrinen _____ 26

2.5.2

Signalkaskaden bei der Zell-Zelladhäsion ausgehend von Cadherinen _______ 32

2.6

Das Protein MIA _____________________________________________________ 33

2.6.1

Die Rolle von MIA bei der Zelladhäsion im malignen Melanom _____________ 35

3

Material und Methoden ___________________________________________________ 37

3.1

Materialien _________________________________________________________ 37

3.1.1 Allgemeine

Materialien ____________________________________________ 37

3.1.2 Geräte _________________________________________________________ 39

3.1.3 Organismen_____________________________________________________ 40

3.1.4 Säugerzelllinien__________________________________________________ 41

3.1.5 Oligonukleotide __________________________________________________ 41

3.1.6 Peptide ________________________________________________________ 44

3

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Inhaltsangabe

3.2

Medien, Antibiotika und Puffer _________________________________________ 45

3.2.1

Medien zur Anzucht von E.coli und Säugerzellkulturen ___________________ 45

3.2.2 Antibiotika ______________________________________________________ 45

3.2.3

Puffer und Lösungen______________________________________________ 45

3.3

Methoden __________________________________________________________ 49

3.3.1

Arbeiten mit Escherichia Coli _______________________________________ 49

3.3.1.1

Kultivierung von Bakterien _______________________________________ 49

3.3.1.2

Transformation von E.coli ________________________________________ 49

3.3.1.3

Herstellung kompetenter Bakterien_________________________________ 50

3.3.1.4

Isolierung von Plasmid DNA ______________________________________ 50

3.3.1.5

Isolierung von Plasmid DNA im größeren Maßstab (Midipräparation) ______ 51

3.3.1.6 Isolierung

genomischer

DNA aus eukaryontischen Zellen._______________ 51

3.3.2 Molekularbiologische

Methoden _____________________________________ 51

3.3.2.1

DNA- und RNA Methoden________________________________________ 51

3.3.2.1.1

Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen _________________ 51

3.3.2.1.2

Gelelektrophorese von DNA___________________________________ 52

3.3.2.1.3

Isolierung und Reinigung von DNA-Fragmenten ___________________ 52

3.3.2.1.4 DNA-

und

RNA-Konzentrationsbestimmung_______________________ 52

3.3.2.1.5 Reverse

Transkription _______________________________________ 52

3.3.2.1.6 Polymerase

Kettenreaktion (PCR) ______________________________ 53

3.3.2.1.7

3´RACE (rapid amplification of cDNA ends)_______________________ 53

3.3.2.2

RNA-Methoden: RNA Isolierung aus Säugerzellen bzw humanen Geweben_ 53

3.3.2.3 Proteinchemische

Methoden _____________________________________ 53

3.3.2.3.1

Rekombinante zellfreie Herstellung von biotinyliertem MIA ___________ 53

3.3.2.3.2

Herstellung von Gesamtproteinextrakten _________________________ 54

3.3.2.3.3 Konzentrationsbestimmung von Gesamt- und Kernproteinen _________ 54

3.3.2.3.4 SDS-Polyacrylamid

Gelelektrophorese __________________________ 54

3.3.2.3.5 Western

Blot _______________________________________________ 55

3.3.2.3.6 Proteindetektion auf Western-Blots _____________________________ 55

3.3.2.3.7

Silberfärbung im SDS Gel ____________________________________ 57

3.3.2.3.8 ELISA ____________________________________________________ 57

3.3.2.3.9 MAP-Kinase-Aktivitätsassay___________________________________ 58

3.3.2.3.10 Ko-Immunpräzipitation ______________________________________ 58

3.3.2.3.11 Immunhistochemie _________________________________________ 59

3.3.3 Zellkulturmethoden _______________________________________________ 59

3.3.3.1 Kultivierung

von

eukaryontischen Zellen_____________________________ 59

3.3.3.2

Stabile und transiente Transfektion von Zellkulturzellen_________________ 59

3.3.3.3 Durchflußzytometrische

Analyse von Zellen (FACS) ___________________ 60

4

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Inhaltsangabe

4

Ergebnisse _____________________________________________________________ 61

4.1

Untersuchungen an einer verkürzten und sezernierten Form von P-Cadherin in

Melanomzellen ____________________________________________________________ 61

4.1.1

Suche nach Veränderungen bei Zelladhäsionsmolekülen während der Entstehung

des malignen Melanoms____________________________________________________ 61

4.1.2

Analyse der P-Cadherinexpression in Melanomzelllinien __________________ 62

4.1.3

Sezernierung der verkürzten Form von P-Cadherin ______________________ 64

4.1.4 Analyse

der

in situ

Expression der 50 kDa Form von P-Cadherin ___________ 66

4.1.4.1

Analyse der P-Cadherinexpression in

tissue microarrays (TMA)

__________ 68

4.1.5

Western Blot Analyse von P-Cadherin in Melanommetastasen _____________ 68

4.1.6

Analyse der genomischen P-Cadherinsequenz in Melanomzelllinien _________ 69

4.1.7

Analyse der P-Cadherin mRNA in Melanomzelllinien _____________________ 70

4.2

Charakterisierung von spezifischen Bindungspartnern des Proteins MIA _____ 72

4.2.1

Expression von rekombinantem biotinyliertem MIA_______________________ 72

4.2.2

MIA reduziert die MAP-Kinase Aktivität im malignen Melanom______________ 75

4.2.3

MIA bindet an die Zelloberfläche_____________________________________ 77

4.2.4 Identifikation

von

MIA- Bindungspartnern ______________________________ 79

4.2.5

MIA bindet direkt an alpha4 beta1 und alpha5 beta1 _____________________ 82

4.2.6

MIA inhibiert Integrinaktivität ________________________________________ 84

4.2.7

Analyse der Interaktion zwischen MIA und Integrinen_____________________ 85

5

Diskussion _____________________________________________________________ 89

5.1

Identifikation einer trunkierten Form von P-Cadherin im malignen Melanom ___ 89

5.2

Regulation des MAP-Kinase Signalweges über MIA _______________________ 96

5.3

Bindung von MIA an Integrine alpha4 beta1 und alpha5 beta1 _______________ 97

6

Literaturverzeichnis _____________________________________________________ 107

7

Danksagung ___________________________________________________________ 139

5

---

1 Zusammenfassung

1 Zusammenfassung

In dieser Arbeit wurde untersucht, ob MIA, neben Wechselwirkungen mit

Extrazellularmatrixmolekülen, auch spezifisch mit Rezeptoren auf der Oberfläche

von Melanomzellen interagieren kann. Zusätzlich sollte geklärt werden, um welche

Rezeptoren es sich dabei handelt. Zur Verbesserung der Detektion von MIA wurde

dieses biotinyliert. Die Herstellung des rekombinanten, biotinmarkierten Moleküls

erfolgte in einem zellfreien,

in vitro

Transkriptions-/Translationssystem auf

E.coli

Basis (RTS Roche). Das daraus gewonnene, biotinmarkierte Protein wurde für die

gesamten Experimente verwendet. Die korrekte Faltung des Proteins konnte

dadurch verifiziert werden, dass es möglich war, das biotinylierte MIA mittels

Antikörper in einem bereits etablierten ELISA-Assay nachzuweisen. Durch

zusätzliche funktionelle Assays, wie Zellmigrationsassay und Invasionsassay,

konnte ebenfalls sichergestellt werden, dass die migrationshemmende Wirkung

von MIA auf Zellen

in vitro

, auch nach dessen Biotinmarkierung, erhalten blieb.

In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass MIA die Aktivität der MAP-Kinase ERK 1/2

vermindert. Zusätzlich konnte erstmals gezeigt werden, dass MIA nicht nur an

Extrazellularmatrixproteine, sondern direkt spezifisch an die Fibronektinrezeptoren

alpha4 beta1 und alpha5 beta1 binden kann. Weitere Untersuchungen zur

Wirkungsweise von MIA auf Integrine ergaben, dass MIA die Aktivierung der

Integrine hemmen kann.

Im Rahmen eines weiteren Projekts stellte sich bei einer Untersuchung von Zell-

Zelldadhäsionsproteinen mittels Western Blot heraus, dass das klassische P-

Cadherin in Melanomzellen in einer verkürzten, 50 kDa Form vorliegt. Dabei

wurde gezeigt, dass die Verkürzung von P-Cadherin bereits auf mRNA-Ebene

nachgewiesen werden kann. Mittels RT-PCR konnte demonstriert werden, dass in

allen untersuchten Melanomzelllinien das 3´Ende der mRNA von P-Cadherin ab

Exon 10 fehlte.

Mit einer 3´RACE PCR und einem Datenbankscreening, welches spezifisch für

Spleißprodukte war, wurde ausgeschlossen, dass es sich bei der Verkürzung um

alternatives Spleißen der mRNA handelte. Die Daten ließen auch den

Rückschluss zu, dass es sich nicht um posttranslationale Prozessierung des

Proteins handeln konnte. Publikationen über diverse fragile Stellen an der P-

6

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1 Zusammenfassung

Cadherin Chromosomenstelle 16q22.1 führten zur Vermutung, dass die

Verkürzung von P-Cadherin von einer Translokation an dieser Stelle im

Chromosom herrühren muss. In weiteren Versuchen konnte zudem dargestellt

werden, dass die verkürzte Form von P-Cadherin in Melanomzellen, im Gegensatz

zur Wildtypisoform, nicht in der Membran der Zellen verankert ist, sondern in die

extrazelluläre Matrix sezerniert wird. Mittels eines

tissue microarrays

konnte der

membranständige und zytoplasmatische Verlust von P-Cadherin mit zunehmender

Tumordicke und zunehmendem Clark Level bestätigt werden.

MIA wurde in vorliegender Arbeit eine aktive Rolle in der spezifischen Hemmung

der Integrine alpha4 beta1 und alpha5 beta1 zugewiesen. Das in Melanomzellen

trunkierte und sezernierte P-Cadherin kann durch homophile Interaktion mit

membranständigem Vollänge-P-Cadherin benachbarter Zellen die Ausbildung

normaler Zell-Zell-Kontakte möglicherweise verhindern. Dadurch ist es entarteten

Zellen potentiell möglich, sich leichter aus dem organisierten Gefüge des

Gewebes zu lösen.

Zusammenfassend konnte in dieser Dissertation gezeigt werden, welchen Beitrag

die Proteine MIA und P-Cadherin möglicherweise bei der Auswanderung von

Tumorzellen aus dem Zellverband leisten können.

7

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2 Einleitung

2 Einleitung

2.1 Struktur und Aufbau der Haut

Die Haut ist das größte Organ des Körpers. Sie ist eine unterschiedlich dicke, sehr

sensible, gut vaskularisierte Schicht, die den Körper bedeckt. Die Basalmembran

trennt die epitheliale Epidermis von der bindegewebigen Dermis. Die Dermis

grenzt an das subkutane Fettgewebe, welches zwischen der Haut und tiefer

liegenden Strukturen liegt. Die Epidermis ist die äußerste Schicht der Haut und

enthält keine Nerven oder Blutgefäße. Sie schützt die Haut vor Umwelteinflüssen

und regelt den Flüssigkeitshaushalt des Körpers. Sie besteht aus mehreren

Zelllagen. Neben anderen spezialisierten Zellen enthält die Epidermis die

Keratinozyten, die im

Stratum basale

als hochprismatische Basalzellen vorliegen.

Ihre Tochterzellen wandern im Laufe der Zeit in Richtung Oberfläche und bilden

dort zunächst das

Stratum spinosum

, welches eine weitere Lage aus polygonalen

Zellen mit kurzen, stachelförmigen Fortsätzen bildet. Die älteren Zellen der

nächsten Lage, dem

Stratum granulosum

, enthalten im Zytoplasma die

namensgebenden Keratingranula. Keratin verleiht allen Teilen der Haut Festigkeit

und Widerstandskraft. In der obersten Lage, dem

Stratum corneum

, befindet sich

schließlich eine breite Lage von abgestorbenen Zellen, in denen das Keratin das

gesamte Zytoplasma und den Nukleus ersetzt.

Weitere Zellen der Epidermis, welche nicht von den Basalzellen abstammen, sind

die Melanozyten im

Stratum basale

. Diese Zellen bilden das Pigment Melanin

und geben es an die Zellen der Epidermis und die Haarfollikel ab.

Direkt unter der Epidermis liegt die Dermis. Diese Hautschicht besteht

hauptsächlich aus dicken Bündeln von Kollagen, in dem Nerven, Blut- und

Lymphgefäße, sowie Schweißdrüsen und Haarfollikeln, eingelagert sind. Bis in die

Papillen im

Stratum spinosum

, versorgt sie auch die Epidermis mit Gefäßen (siehe

Abbildung 2-1 und Abbildung 2-2 ).

8

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2 Einleitung

Abbildung 2-1

Gesamtübersicht über die verschiedenen Schichten der Haut (modifiziert nach Faller und Schünke,

2004).

Abbildung 2-2

Vergrößerte Ansicht der Epidermis

.

Die Abbildung zeigt, unter anderem, Melanozyten in der Basalzellschicht der Epidermis. Durch

dendritische Ausläufer treten sie in Kontakt mit Keratinozyten (modifiziert nach Faller und Schünke,

2004).

2.1.1 Funktion der Melanozyten

Melanozyten entstammen in der Entwicklung aus den Zellen der Neuralleiste des

Embryos. Die ersten Zellen, die der Melanozytenlinie zugeordnet werden können,

9

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