Bericht zur Arbeit der Universität Greifswald zur statistischen Erfassung und Auswertung von FSME- und Borreliosepotentialen an Zecken aus lokalen Forsten

Bericht zur Arbeit der Universität Greifswald zur statistischen Erfassung und Auswertung von FSME- und Borreliosepotentialen an Zecken aus lokalen Forsten

Zecken gehören zu den Raubmilben unter den Spinnentieren (da sie 8 Beine haben). Sie leben vom Blut und der Gewebsflüssigkeit ihrer Wirte, die sie durch die Haut absaugen.

Eine Zecke entwickelt sich aus dem Ei zunächst zu einer Larve, dann in eine Nymphe. Die zweite und letzte Metamorphose im Leben einer Zecke ist die, zur Adulten.

Das jeweils nächst höhere Stadium wird durch eine Blutmahlzeit und eine Häutung erreicht.

Die Nymphe ist ein Unisexer Organismus, Männchen bzw. Weibchen bilden sich erst nach der 2.Häutung heraus. Im 3. Stadium nimmt die weibliche Zecke eine letzte Blutmahlzeit ein, während welcher sie begattet wird.

Nach dem Akt sterben die männlichen Zecken, die weiblichen tragen ihre Eier aus und sterben nach dem der Eiablage.

Beim einnehmen der bereits erwähnten Blutmahlzeiten, sticht die Zecke ihren Wirt bei diesem Stich können verschiedene Krankheitserreger auf diesen übertragen werden.

Die in unseren Breiten wohl am häufigsten auftretenden, durch Zecken übertragenen Krankheiten sind:

1. TBEV - Dieses Virus bewirkt die Hirnhautentzündung FSME (Frühsommer-Meningenzephalitis)

FSME ist die wohl am besten impfbare und somit, durch Hinweise, am weitesten bekannte, durch Zecken übertragene, Krankheit. FSME wird, entgegen ihrer Bezeichnung, vom Frühjahr bis zum Herbst übertragen. Überträger ist der gemeine Holzbock (Ixodes ricinus).

Die Krankheit tritt gehäuft in einigen Regionen in Süddeutschland auf, d.h. sie ist bei uns, im Norden Deutschlands, relativ selten.

FSME-Erreger werden sehr schnell übertragen, es ist also nicht möglich eine Infektion durch rasches Entfernen der Zecke zu verhindern. Daraus ergibt sich ein hoher Stellenwert für den Impfschutz, da sich diese Erkrankung nach Ausbruch auch nicht Therapieren lässt. Ein Impfschutz ist für alle unbedingt ratsam, die in Endemiegebieten leben oder dorthin Reisen, z.B. Osteuropa.

Krankheitsbild der FSME:

Das Erkrankungsrisiko nach Infektionen mit dem FSME-Virus liegt bei ca. 30%.

Nach einer Inkubationszeit von 7-14 Tagen (Extremwerte: 2-28 Tage) verlaufen über 90% der Infektionen asymptomatisch oder in einer 2-4 Tage dauernden Virämiephase mit Fieber und leichten, grippeähnlichen Erscheinungen (,,Sommergrippe") . Nur etwa 10% der Infizierten erkranken in einer 2. Phase, meist nach einem beschwerdenfreien Intervall von 8 Tagen, unter erneutem Fieberanstieg (Rückfallfieber), an FSME. In seltenen Fällen kann die Symptomfreie Phase fehlen; beide Phasen gehen dann unmittelbar ineinander über.

Aufgrund der Manifestation im ZNS kann FSME zu sehr unterschiedlichen neurologischen Bildern führen, wie z.B. Meningitis serosa (Hirnhautentzündung) oder Meningoenzephalomyelitis(Gehirnentzündung¹ ). Es kann aber auch zu Lähmungserscheinungen, Gedächtnis- oder Konzentrationsschwäche kommen. Die Zunahme der Letalität (Sterberate) bewegt sich direkt proportional zum Alter der infizierten Person. D.h. je älter der infizierte ist, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass er an FSME stirbt. Es ist bei ca. 10% der Erkrankten mit neurologischen Restschäden zu rechnen. Die durchschnittliche Letalität liegt bei 1-2%.

2. Borrelien - Diese bakteriellen Krankheitserreger können verschiedenste Arten der Borreliose hervorrufen In unseren gemäßigt, subpolaren Breiten ist die Lyme-Borreliose am häufigsten anzutreffen.

Im süddeutschen Raum (Baden-Württemberg,Bayern) ist die Infektionsgefahr, auf alle Zeckenstiche bezogen, gering (ca. 3-4%). Auf Stiche borrelienhaltiger Zecken bezogen, ist das Infektionsrisiko doch recht hoch (23-27%). Wenn man sich mit Borrelien infiziert, bedeutet das nicht gleichzeitig, dass es zum Ausbruch der Krankheit kommt. Viele Gestochene bilden Antikörper gegen ,,Borrelia burgdorferi". Auf die Masse aller Zeckenstiche bezogen liegt das Ausbruchsrisiko, nach einer Studie, bei 1%. Sieht man sich aber die Zahl der Ausbrüche auf die Zahl der Stiche durch borellienhaltige Zecken bezogen an, so erhält man ein Ausbruchsrisiko von ca. 10%.

Nach einem Stich kann der Infektion mit Borrelien durch schnelles Herausziehen der Zecke vorgebeugt werden. Die Erreger werden nämlich erst ca. 12h nach dem Stich übertragen. In den ersten 24h steigt die Übertragungsrate bis auf 30% an, nach 3 Tagen etwa ist die Ü-Rate auf 100% gestiegen.

Sind die Erreger übertragen und es kommt zu einem Ausbruch, so stellen sich verschiedene Symptome ein, diese werden im Laufe der Entwicklung für den Wirtsorganismus in 3 Stufen schrittweise gravierender.

Stadium I (Frühstadium):

- eine ringförmige Hautrötung (Erythema migrans)_ tritt bei nur ca. 60% der Infizierten auf
- grippeähnliche Beschwerden wie: erhöhte Körpertemperatur, Abgeschlagenheit, Schweissausbrüche, Gelenkund Muskelschmerzen

Stadium II (Wochen bis Monate nach Infektionsbeginn)

- Hirnhaut- und Gehirnentzündung kann auftreten, die sich durch starke, kappenförmige Kopfschmerzen, Nackensteifheit und Brennen im Kopf äussert
- Nervenentzündung mit Beteiligung des Rückenmarks Lähmungserscheinungen
- unerträgliche neuralgische Schmerzen treten vor allem nachts auf
- Herzrythmusstörungen, Herzjagen, oder sogar Herzblock
- verschwommenes Sehen oder Doppelbilder beeinträchtigen das Sehen
- Sensibilitätsstörungen wie Brennen, Piken oder Kribbeln sind in allen Körperteilen möglich
- Reizbarkeit, Vergesslichkeit, Schlaflosigkeit, unerklärliche Müdigkeit, depressive Stimmung >oft kommt es fälschlicherweise zu Falschdiagnosen mit psychologischem Hintergrund

Stadium III (Monate bis Jahre nach Infektionsbeginn)

- chronische Gehirn-, Muskel-, und Gelenkentzündungen
- Hautveränderung (Acrodermatitis chronica atrophicans) >dünne papierähnliche Haut
- Meistens verläuft die Krankheit mit einer Vielzahl bisher noch unbekannter Symptome.

Zur Therapie werden verschiedene Antibiotika (Infusion und/oder Tabletten) verabreicht.

Die Aussicht auf Heilung verschlechtert sich mit der Dauer der Erkrankung. Zur Klinik und Therapie der Lyme- Borreliose gibt es unter den Experten teilweise völlig verschiedene Positionen. Die Lyme-Borreliose ist von Mensch zu Mensch übertragbar. Es erkranken jährlich ca. 10.000 Menschen neu an Lyme-Borreliose. Dennoch ist diese Infektion in der Regel gut behandelbar- vorausgesetzt, sie wird als solche erkannt...

Um bestmögliche Therapien und Schutzmaßnahmen gegen die eben beschriebenen Krankheiten zu entwickeln, wird viel geforscht und beobachtet. Die zoologische Abteilung der Ernst-Moritz-Arndt-Universität in Greifswald führt unter anderem unter Leitung Prof. Dr. Hildebrandts und seines wissenschaftliche Assistenten Dr. C. Müller eine solche ,,Beobachtung" durch. Diese Arbeit sieht so aus, dass Zecken aus dem Umkreis der Hansestadt Greifswald gesammelt, auf Borreliose- und FSME-Erreger untersucht und die Ergebnisse statistisch erfasst werden. Um die gesammelten Proben zu analysieren sind verschieden Schritte nötig

I. Sammeln

Um Proben auf bestimmte Stoffe untersuchen zu können, müssen diese natürlich erst beschafft werden. In unserem Falle werden die Proben in anliegenden Forsten gesammelt. Die am weitesten verbreitete Methode dafür ist das ,,Abflaggen". D.h., dass der Sammler ein Stück Stoff ,wie eine Flagge, an einen langen Stock oder Ast bindet. Dieses Stoffstück sollte vor dieser Prozedur mit Schweiss in Berührung gekommen sein, um die Zecken zu locken. Die ,,Flagge" wird nun durch das Unterholz oder durch die Strauchschicht eines Forstes gezogen, die dort befindlichen Zecken halten sich in Erwartung, einen Wirt zu bekommen , an der Flagge fest. Nach Beenden dieser Prozedur kann der Sammler die Proben einfach von der ,,Flagge" absammeln, beschriften und konservieren.

II. DNS und RNS aus den Proben lösen und isolieren

Um überprüfen zu können, ob die gesammelten Proben den gesuchten Erreger in sich tragen, müssen zunächst die DNS und die RNS aus der Probe gelöst und isoliert werden, dies geschieht nach einem bestimmten Protokoll. Dieses Protokoll wird vom Hersteller der dafür vorgesehen Arbeitsmaterialien (Kit · ein vollständiges Set aller für die Experimentieranordnung benötigten Geräte und Chemikalien) festgelegt. Die Firma Invitek© schlägt für ihr ,,Twin spin kit" folgendes Protokoll vor:

1. Um die RNS und die DNS aus ihren festen Zellbestandteilen zu lösen, sollen die Proben in einem Gerät, das als ,,Ultra Turrax" bezeichnet wird, homogenisiert(in diesem Falle zerkleinert) werden. Dies geschieht in einer sogenannten Pufferlösung, welche für ein konstantes, vorteilhaftes Milieu sorgt (>pHWert, Ionenverteilung u.ä.). Die Pufferlösung nannte sich in diesem Kit ,,Lysissolution T".

2. Die in schritt 1 aus der Zelle gelöste RNS und DNS befindet sich in einem Medium, welches neben neben den von uns benötigten Nukleinsäuren auch andere Zellbestandteile wie Kohlenhydrate, Proteine und Lipide enthält. Um nun die DNS und die RNS zu isolieren, muss diese aus dem Medium gelöst werden. Dies geschieht, indem sie an einen speziellen, im Kit enthaltenen Filter unter bestimmten Bedingungen gebunden wird. Als erstes wird die DNS an den dafür vorgesehen Filter gebunden. Dafür wird die in Schritt 1 hergestellte Lösung auf den Filter gegeben und durch diesen hindurch zentrifugiert. Im Filter befindet sich nun die Gesamt-DNS. Der Durchfluss enthält nun ,,nur" noch die RNS und die restlichen Zellbestandteile (Kohlenhydrate, Proteine, Lipide usw.)

3. Der Durchfluss aus Schritt 2 wird muss, um ein bindendes Milieu für den RNS-Filter zu schaffen, mit Ethanol gemischt. Nachdem dies geschehen ist, wird das Gemisch aus dem Durchfluss und dem Ethanol auf den RNS-Filter gegeben. Wenn man den Durchfluss durch den Filter hindurch zentrifugiert hat, hat man die totale RNS an den Filter gebunden. Der Durchfluss aus diesem Schritt kann entsorgt werden.

4. Um nun die RNS und die DNS von sämtlichen Verschmutzungen zu befreien, müssen diese gewaschen werden. Dieser Waschvorgang wird mit der mitgelieferten Waschlösung durchgeführt In 2 ,,Waschgängen" wird die Waschlösung mit Hilfe der Zentrifuge durch beide Filter hindurchgedrückt. Die Durchflüsse werden alle entsorgt, da sie nur die herausgewaschenen Bestandteile enthalten. Um nun noch alle Ethanolreste von der RNS zu entfernen, werden die Filter 3 min. bei ca. 13.000 rpm zentrifugiert.

5. Nach Schritt 4. Befinden sich die RNS und die DNS auf dem Filter. Um diese von dort zu lösen und in eine wässrige Lösung zu bringen, müssen sie eluiert (vom Medium gelöst) werden. Dies wird mit den mitgelieferten Elutionslösungen getan. Die RNS-Elutionslösung werden auf die Filter gebracht und durchzentrifugiert, der entstandene Durchfluss wird auf Eis gelegt, da dieser nun die reine RNS und DNS enthalten. Um die DNS zu eluieren, wird die DNS-Elutionslösung zunächst auf 70°C erhitzt werden, bevor sie auf den Filter gegeben wird. Nach einer ca. 5 minütigen Inkubationszeit kann der Puffe durch den Filter zentrifugiert werden. Der Durchfluss wird auf Eis gelegt, da er die reine DNS enthält.

III. Überprüfung der DNS und RNS auf Erbmaterial von Borrelien

Nach Abarbeitung dieses Protokolls wird die Qualität der gereinigten DNS und RNS überprüft. Zu diesem Zweck werden die DNS und die RNS mit einem Stopper und H2O gemischt. Der Stopper besteht zu Großen Teilen aus Glyzerin und einem Farbstoff (Bromphenolblau).

Dieses Stopper-DNS- und Stopper-RNS-Gemisch wird nun auf ein vorher hergestelltes Agarosegel (1%) aufgetragen und in ein Elektrophoresegerät gegeben. Da RNS und DNS negativ geladen sind, bewegen diese sich in der Agarose in Richtung des positiven Pols. Da die einzelnen DNS- und RNS-Stränge unterschiedlich lang sind, sind sie auch unterschiedlich schnell in ihrer Bewegung zum positiven Pol. Aufgrund dieser Tatsache bildet sich das gewünschte Bandenmuster aus. Nachdem die Elektrophorese abgeschlossen ist, wird das Agarosegel in einen Farbstoff gegeben. Nach dem Färben, ist es möglich unter UV-Licht die unterschiedlich langen DNS- und RNS-Stränge zu erkennen.

Um nun aber die TBE-Viren und Borreliose-Bakterien nachzuweisen, muss ein anderes Verfahren angewandt werden.

Da die Erreger-DNS in sehr geringen, kaum nachweisbaren Mengen in die DNS den Präparationen vorhanden sind, müssen sie spezifisch amplifiziert (vervielfältigt) werden.

Dies wird mit einer PCR getan, PCR ist die Abkürzung für ,,Polymerasekettenreaktion".

III. 1. die PCR (Polymerasekettenreaktion)

Als Ausgangspunkt unserer PCR haben wir als 1. unsere in den letzten Schritten isolierte RNS, DNS mmit der zu amplifizierenden Zielsequenz. und unseren Primer (Adaptionsstück für bestimmte Basensequenzen). Es wird nun also ein Überschuss an 2 zueinander komplementären Primern, sowie Nukleotide und ein Helix-synthetisierendes Enzym zu der isolierten DNS hinzugegeben. Um eine möglichst hohe Ausbeute zu erlangen, wird das Milieu mit Hilfe eines Puffers auf das Optimum des Enzyms gebracht.

Da jetzt alle nötigen Bestandteile vorhanden sind, wird der Ansatz auf 94°C erhitzt, um die beiden Helixstränge durch Denaturierung voneinander zu trennen. Da die Stränge ja nicht nur getrennt werden sollen, sondern der Primer sich anlagern soll, wird nun auf 55°C abgekühlt. Bei 55°C lagern sich die beiden Helixstränge wieder aneinander, sind aber noch sehr instabil. Da ein hoher Überschuss an Primern vorhanden ist, setzen sich diese an bestimmte Teile des Stranges. Sobald das geschehen ist, wird auf 72°C erhitzt, da das zugegebene Enzym (einer in heissen Quellen lebenden Bakterienart entnommen) dort sein Wirkungsoptimum hat. Das vorher zugegebene Enzym beginnt nun unter Zuhilfenahme der freien Nukleotide den komplementären Strang entlang des Ausgangsstranges. Als Startpunkt für diese Synthetisierung dient der Primer. Da der Primer nur an einer Seite angelagert ist, synthetisiert das Enzym auch über den von uns gewollten Teil hinaus. D.h., wenn nach einer bestimmten Zeit die Temperatur wieder auf 94°C gebracht wird, und das Enzym zu arbeiten aufhört, hat die neu synthetisierte Helix einen klar definierten Anfang, aber ein ,,offenes" Ende.

Es wird nun wieder ein Annealingschritt (,,zusammenführen"· abkühlen auf 55°C) eingeleitet, wobei sich aber diesmal auch Primer an den neu synthetisierten Strang binden, diesmal aber an der ,,losen" Seite, da die Primer ja komplementär zueinander sind. Wird nun wieder ein Elongationsschritt (erhitzen auf 72°C) durchgeführt, so beginnt das Enzym an dem neu synthetisierten Strang in, Richtung des vorher klar definierten Endes, eine neue Helix zu synthetisieren da der Anfang dieses neuen Stranges klar durch einen Primer, und das Ende durch ein Ende der Ausgangshelix definiert ist, entsteht als neu synthetisierte Helix genau der Teil, der gewünscht ist. · Es wurde eine bestimmte Sequenz aus der Ausgangshelix spezifisch dubliziert.

Durch ständiges Wiederholen dieser Prozedur kann man die Zahl der synthetisierten Stücken so stark in die Höhe treiben, dass man sie per Elektrophorese nachweisen kann.

Während meines 10-Tägigen Praktikums bei Dr. C. Müller haben wir 18 Tiere präpariert, die ersten 10 Versuche zeigten kein zufriedenstellendes Ergebnis, da ,wie wir später herausfanden, die ,,Lysissolution T"(der 1. Puffer) ,,defekt" war, die DNS also so stark gebunden hat, so dass sie beim 1. Zentrifugationsschritt als geleeartige Masse ausfiel. D.h., dass wir auf unseren 1. Bildern von der Elektrophorese nur RNS hatten, die DNS war ja ausgefallen. · Bild liegt an.

Nachdem Invitek© informiert war, wurde uns eine neue ,,Lysissolution T", ohne das verhängnisvolle Bindemittel versprochen. Aus bisher unbekannten Gründen dauerte es sehr lange, bis diese bei uns eintraf. D.h., wir waren ca. 5 Tage nicht in der Lage neue Proben zu präparieren. Um diese Zeit effektiv zu nutzen, führten wir PCRs für die bereits präparierten Tiere, zur Überprüfung auf Borrelien-DNS, durch.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Diese DNS-Aufschlüsselung zeigt die Ergebnisse einer PCR von 4 Proben.

Mittig befindet sich der Größenstandart. Die beiden Banden auf der linken Seite sind die positiven Ergebnisse in den Proben 1 und 3.

Der auf der linken Seite befindliche Balken ist die Positivkontrolle, wäre dieser Balken nicht vorhanden, hieße das, dass die PCR durch einen Durchführungsfehler nicht mehr aussagekräftig genug und somit unbrauchbar ist.

Das Bild wurde invertiert, um die Ergebnisse besser ablesen zu können.

Während des Praktikums begaben wir uns 2 mal in Forste der Umgebung Greifswalds (Ludwigsburg) um Proben zu sammeln. Bei der ersten Sammelaktion fingen wir 2 Nymphen. Bei der zweiten Aktion fingen wir ca. 12 Nymphen, 4 Weibchen und kein Männchen.

Die Ergebnisse der von uns gemachten Analysen bestätigten ungefähr die bisher von der Arbeitsgemeinschaft Prof.

Hildebrandt / Dr. Müller aufgestellte Hypothese von ca. 17% borrelieninfizierter Tiere. Bei unseren Analysen waren 2 von 18 Tieren borrelienpositiv, das entspricht einem Prozentsatz von ca. 11,1%.

Aus den gesammelten Daten kann man folgende Schlussfolgerung ziehen:

Die Notwendigkeit sich nach einem Waldgang auf Zecken abzusuchen ist aufgrund des hohen Infektionsrisikos auch in unserer direkten Umgebung unbedingt gegeben.

Bei einem Zeckenbiss oder Verdacht auf Borreliose sollte sofort ein Arzt aufgesucht werden.

Quellenverzeichnis:

,,Lyme-Borreliose - der verhängnisvolle Biss" (Flyer der Borreliose Selbsthilfe e.V. Berlin-Brandenburg)

,,Der Experimentator: Molekularbiologie"(2.Auflage) von Cornel Mülhardt (Spektrum-Akademischer Verlag)

,,Borreliose Magazin" - Publikation des Borreliose Bund Deutschland e.V. Nr.4/Mai2000

,,Zecken- Schützen sie sich und ihre Familie!" - Information der Baxter Deutschland GmbH, Hyland Immuno Division ,,Zecken" - von http://www.qualitaetspraxen.de/patinfo/zecken.htm

,,FSME" - http://www.dieterhassler.de/html/fsme.html

Invisorb© TwinSpin Cell Mini Kit-for human and animal cells (Protokoll) - Ivitek Gesellschaft für Biotechnik u. Biodesign mbH

,,Frühsommer-Meningoenzephalitis(FSME)-Erkennung und Verhütung Merkblatt für Ärzte- Deutscher Ärzte-Verlag ,,Vergleich FSME / Lyme-Borreliose - Zappe von http://www.tzuser.uni-heidelberg.de/~cn6/zecken/fsmelyme.htm Borreliose(Immubiologie) - Grube (http://www.bionet.schule.de/aquadata/immunbio/borrelio.htm)

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¹ Gehirnentzündung (Meningoenzephalitis) - Hier sind nicht nur die Hirnhäute, sondern das ganze Gehirn von der Erkrankung betroffen. Es kann neben den Symptomen einer Hirnhautentzündung unter anderem zu Bewußtseins-, Sprach- und Schluckstörungen, zu psychischen Veränderungen oder bestimmten Lähmungserscheinungen kommen.