Anreicherung des DNA-Bindungsproteins Sac7e aus Sulfolobus acidocaldarius

Inhaltsverzeichnis

1 Einführung
1.1 Bibliographische Beschreibung
1.2 Aufgabenstellung
1.3 Theoretische Grundlagen
1.3.1 Bedeutung von DNA - Bindungsproteinen
1.3.2 Prinzipien der Proteinreinigung

2 Material und Methoden
2.1 Chemikalien
2.2 Geräte
2.3 Mikroorganismen
2.4 Methoden
2.4.1 Kultivierung der Mikroorganismen
2.4.2 Gewinnung des Proteinrohextraktes
2.4.3 SDS - Polyacrylamidgel - Elektrophorese
2.4.4 Chromatographie an Heparin - Sepharose
2.4.5 Lyophilisierung

3 Ergebnisse und Diskussion
3.1 Kultivierung der Mikroorganismen
3.2 Gewinnung des Proteinrohextraktes
3.3 1. SDS - Polyacrylamidgel - Elektrophorese
3.4 1. Chromatographie an Heparin - Sepharose
3.5 2. SDS - Polyacrylamidgel - Elektrophorese
3.6 2. Chromatographie an Heparin - Sepharose
3.7 3. SDS - Polyacrylamidgel - Elektrophorese
3.8 Lyophilisierung

4 Zusammenfassung

Literatur

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1 Einführung

1.1 Bibliographische Beschreibung

Natalie Bordag

Schülerin der Wilhelm - Ostwald - Schule (Gymnasium)

Anreicherung des DNA - Bindungsproteins Sac7e aus Sulfolobus acidocaldarius

angefertigt am Institut für Biochemie der Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie an der Universität Leipzig

34 Seiten Text, 6 Abbildungen, 5 Tabellen

1.2 Aufgabenstellung

Das Ziel dieser Arbeit ist es, das DNA - Bindungsprotein Sac7e aus Sulfolobus acidocaldarius bis zur elektrophoretischen Reinheit anzureichern.

Dazu wird der E. coli Stamm BL21-DE3 [pLys S] mit dem transformierten Expressionsvektor pET-3c/sac7e verwendet, um das Protein Sac7e überexprimieren zu können. Aus dem zellfreiem Extrakt der E. coli Zellen wird das Protein isoliert und anschließend lyophilisiert.

1.3 Theoretische Grundlagen

1.3.1 Bedeutung von DNA - Bindungsproteinen

Proteine spielen eine wichtige Rolle in Lebensprozessen. Das Protein, mit dem sich diese Arbeit beschäftigt, ist ein DNA - Bindungsprotein aus einem extrem thermoacidophilen Archeon, dem Sulfolobus acidocaldarius. Die Archaea, die neben den Bakterien und den Eukaryoten das dritte Urreich der Biosphäre bilden, gedeihen in ökologischen Nischen. Diese Nischen sind meist durch hohe Temperaturen (thermophil), hohe Salzkonzentrationen (halophil) oder durch extreme pH - Werte (z. B. acidophil) gekennzeichnet. Solche extremen Umweltbedingungen, von denen lange Zeit angenommen wurde, daß sie ohne jedes Leben sind, bringen besondere Anpassungserscheinungen hervor. Unter anderem muß bei einem thermophilem Archeon wie S. acidocaldarius die DNA unter den extremen Wachstumsbedingungen (Temperaturen von 75 - 80 C als Optimum) stabilisiert werden, denn die DNA wird bei nicht thermophilen Organismen bei Temperaturen von über 40 C zusammen mit den meisten anderen Proteinen denaturiert. Die Denaturierung von Proteinen ist ein häufig irreparabler Schaden, durch den das Protein nicht mehr fähig ist, seine ursprüngliche Funktion auszuführen. DNA - Bindungsproteine wie Sac7e haben in den Archaea die Funktion, die DNA zu stabilisieren und eine Denaturierung zu verhindern. Das Protein Sac7e hat eine Molmasse von 7338 DA, ist basisch (isoelektrischer Punkt: 10,1 [ku]) und thermostabil (Schmelzpunkt: über 90 C).

Die thermostabilisierende Funktion von Sac7e und anderen DNA - Bindungsproteinen im Zusammenhang mit der Thermophili der Organismen ist von besonderem Interesse [7],[8]. Durch die geringe Größe, das Auftreten als Monomere und das Fehlen von Metallbingungsstellen und Disulfidbrücken scheinen diese Proteine für umfangreiche Studien zur Proteinfaltung und Stabilität besonders geeignet zu sein [9], [10].

1.3.2 Prinzipien der Proteinreinigung

Bei einer Proteinreinigung löslicher Proteine aus Mikroorganismen unterscheidet man folgende wesentliche Schritte:

- Kultivierung der Zellen
- Zellaufschluß
- Gewinnung eines zellfreien Rohextraktes
- Fraktionierte Fällung mit strukturformierenden Ionen
- Chromatographieschritte
- Überführung der Proteinlösung in eine lagerfähige Form

Für die Anreicherung des Proteins Sac7e wurde der E. coli Stamm BL21-DE3 [pLys S] mit dem transformierten Expressionsvektor pET-3c/sac7e verwendet. Mit diesem Expressionsystem kann bezogen auf die Zellzahl wesentlich mehr Sac7e synthetisiert werden als bei Verwendung des Orginalstammes S. acidocaldarius. Wie in der Diplomarbeit von S. Tschiedel [ch] gezeigt wurde, entspricht das rekombinante Sac7e - Protein dem nativen, wodurch eine Darstellung über E. coli möglich ist.

Die Kultivierung sowie die Induktion der Proteinsynthese erfolgte nach den Angaben von Studier et al. [st].

Nach dem Aufschluß der Zellen durch Ultraschall wurde zunächst mit einer SDS - PAGE (Trennsystem nach Laemmli et al. [la]) überprüft, ob die E. coli Zellen das gewünschte Protein in ausreichender Menge synhetisiert hatten. Die Zuordnung erfolgte über die bekannte Molmasse des Sac7e - Proteins.

Bei ausreichender Menge an Protein im Rohextrakt ist nach Angaben von S. Tschiedel [ch] eine Affinitätschromatographie an Heparin - Sepharose ausreichend, um das Sac7e - Protein anzureichern. Es wurde keine fraktionierte Fällung mit srukturformierenden Ionen durchgeführt, da das Protein Sac7e wegen seiner geringen Größe dafür nicht geeignet war.

Anschließend wurde die Proteinlösung lyophilisiert, denn andere Methoden zur Lagerung von Proteinen erschienen ungeeignet, vor allem wegen der Größe des Proteins, welche ein Auskristallisieren in Gegenwart von strukturformierenden Ionen erschwert.

2 Material und Methoden

2.1 Chemikalien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.3 Mikroorganismen

Zur Gewinnung des rekombinanten Sac7e - Proteins wurden E. coli Zellen des Types BL21-DE3 [pLys S] verwendet, die mit dem Expressionsvektor pET-3c/sac7e transformiert waren. Für die Überlassung des Stammes danke ich Frau Dagmar Kulms.

2.4 Methoden

2.4.1 Kultivierung der Mikroorganismen

Die Kultivierung von E. coli BL21-DE3 [pLys S] (transformierter Expressionsvektor pET-3c/sac7e) erfolgte nach den Angaben von Studier et al. [st].

Lösungen:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Vorkultur:

In ein steriles 10 ml Kulturröhrchen wurden 4 ml steriles Selektionsmedium gegeben und mit einer Gefrierkultur durch eine Impföse in der Sterilbank angeimpft. Bei 37 C und 220 rpm erfolgte die Kultivierung im Schüttelinkubator. In Zeitabständen wurden steril Proben entnommen, um photometrische Dichtemessungen vorzunehmen. Nach dem Erreichen einer optischen Dichte (; d=1 cm) der Größe 0,6 - 1,0 wurden die Kulturen bei 4 C bis zur Weiterverarbeitung aufbewahrt.

Hauptkultur:

Von den Zellen der Vorkultur wurde das überstehende Medium vorsichtig entfernt. Die Resuspendierung des Zellsedimentes erfolgte mit 4 ml frischem Selektionsmedium. Die Hauptkultur (100 ml Selektionsmedium in 500 ml Schüttelkolben) wurde im Volumenverhältnis 25 : 1 mit Vorkultur angeimpft und im Schüttelinkubator bei 37 C und 220 rpm kultiviert. Nachdem die optische Dichte (; d=1 cm) einen Wert von etwa 0,8 erreicht hatte (etwa 2 - 3 h Kultivierungszeit), erfolgte die Induktion der Proteinsynthese durch Zugabe von 100 ml IPTG - Lösung (1mM) pro 100 ml Hauptkultur. Nach 1 h wurde die Kultivierung abgebrochen und die Zellen wurden durch zentrifugieren (15 min bei 4000 rpm, 4 C) geerntet. Das Zellpellet wurde in 4 ml 0,05 M Tris-HCl Puffer (pH 7,5, 2 mM EDTA enthaltend) resuspendiert und bei -70 C aufbewahrt.

2.4.2 Gewinnung des Proteinrohextraktes

Lösungen:

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Zellaufschluß:

Das bei -70 C eingefrorene Zellpellet einer 100 ml Hauptkultur wurde bei Raumtemperatur aufgetaut. Bei 4 C erfolgte der Aufschluß durch Ultraschall (4 mm starke Nadelschwingsonde mit 80 Watt/cm) über einen Zeitraum von 1 - 1,5 min. Bei zu hoher Viskosität der Suspension wurde nochmals 1 min lang beschallt. Anschließend wurde bei 4 C mit 18000 rpm 20 min zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgegossen und das Sediment verworfen.

Proteinbestimmung:

Die Proteinbestimmung erfolgte nach der Methode von Kalb und Bernlohr [ka] durch Extinktionsmessung der Proben bei 230 nm und 260 nm (d=1 cm). Der Proteingehalt wird auf der Basis folgender Beziehung errechnet:

2.4.3 SDS - Polyacrylamidgel - Elektrophorese

Die SDS - PAGE wurde nach dem System von Laemmli et al. [la] durchgeführt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Herstellung der Gelplatte:

Zum Herstellen der Gelplatte wurden die entsprechenden Glasplatten der Elektrophoreseapperatur unter Einsatz einer Silikondichtung mit zwei Klammern aufeinandergepreßt und in der Elektrophoresekammer fixiert. Durch den gewählten Abstandshalter zwischen den fettfreien Glasplatten ergibt sich die Dicke der Gelplatte von 1 mm. Nach dem Einfüllen des Trenngeles (bis 1 cm unter die Kante der Platte mit dem Einschnitt) wurde das Gel vorsichtig mit Wasser überschichtet, damit eine glatte Oberfläche entsteht. Nach der Polymeriastion (ca. 30 min) wurde das Wasser entfernt. Es erfolgte eine Überschichtung des Trenngels mit Sammelgel. In das noch flüssige Gel wurde der Kamm zur Geltaschenbildung eingesetzt. Nach erfolgter Polymerisation (rund 30 min) wurde die Silikondichtung entfernt und zwischen die beiden Platten Filterpapier geschoben, um den Kontakt von Gel und Puffer zu garantieren. Die Platten wurden mit den Klammern in der Elektrophoresekammmer nach Vorschrift befestigt (angeschnittene Platte zum oberen Pufferreservoir). Danach wurden beide Pufferbehälter mit Elektrodenpuffer gefüllt, wobei dem oberen Reservoir 100 ml Bromphenolblaulösung zugesetzt wurden, um die Lauffront zu markieren.

Vorbereitung der Proben:

Es wurden 45 ml Proteinrohextrakt mit 5 ml SDS - Puffer 1 und 2,5 ml Mercaptoethanol vermischt und 5 min bei 95 C und im Thermomixer (600 rpm) inkubiert. Danach wurde den Proben zur Viskositätserhöhung jeweils 6 ml Glycerin/ 20 ml Lösung zugesetzt. Pro Geltasche können 20 ml Probe aufgetragen werden. Das aufgetragene Volumen sollte 1 - 15 mg Protein enthalten (Proteingehalt aus vorhergehenden Messungen bestimmbar).

Der Molmassenstandard wurde entsprechnd der Firmenschrift vorbereitet und jeweils 10 ml pro Geltasche aufgetragen.

Elektrophoresebedingungen:

Nach dem Auftragen der Proben und des Molmassenstandards wurde die Elektrophorese mit einer konstanten Stromstärke (10 mA) bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Laufzeit betrug 2 h 30 min.

Nachweis der Proteinbanden:

Nachdem die Lauffront das untere Viertel des Trenngeles erreicht hat, wurde die Stromzufuhr unterbrochen und die Glasplatten der Apparatur entnommen. Als die Glasplatten vorsichtig entfernt worden waren, wurde das Gel in eine Schale mit Färbelösung gelegt und für 30 min bei 30 - 40 rpm geschwenkt. Danach wurde die Färbelösung (mehrmalig verwendbar) abgegossen und das Gel wurde mit aqua dest. abgespült. Nach dem Abdekantieren des Wassers wurde Entfärber zugegeben. Die Schale wurde bei 30 - 40 rpm unter Wechsel des Entfärbers geschwenkt, bis die Hintergrundfärbung entfernt war.

Konservierung des Gels:

Nachdem das Gel photographiert worden war, wurde das Gel wie folgt konserviert:

Auf eine Glasplatte mit etwas größeren Abmessungen als das zu konservierende Gel wurde zunächst eine in dest. Wasser gequollene Einmachfolie luftblasenfrei aufgelegt. Das in Fixierlösung inkubierte Gel (2 h) wurde mittig plaziert und mit einer zweiten ebenfalls gequollenen Einmachfolie luftblasenfrei abgedeckt. Die Ränder der Folien wurden umgeschlagen. Das Trocknen erfolgte erschütterungsfrei bei Raumtemperatur. Nach zwei Tagen war das Gel untrennbar mit den Folien verklebt und die überstehenden Ränder wurden bis auf 1 cm Abstand zum Gel entfernt. So kann das Gel über Jahre aufbewahrt werden ohne zu schrumpfen oder zu reißen.

2.4.4 Chromatographie an Heparin - Sepharose

Lösungen:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Probenvorbereitung:

Der Proteinrohextrakt wurde in einen Dialyseschlauch (MWCO: 3.500; Spectra/Pro) gegeben und 2 h gegen 1 l Puffer 1 unter leichtem Rühren (Magnetrührwerk) dialysiert. Der Puffer wurde in konstanten Zeitabständen gewechselt. Nach der Dialyse wurde das Volumen und der Proteingehalt, der dialysierten Lösung bestimmt (siehe Material und Methoden).

Chromatographie:

Es wurden 8 ml Heparin - Sepharose in einer 10 ml Säule mit 4 Säulenvolumina Puffer 1 äquilibriert. Das Dialysat wurde vorsicht über das Gel geschichtet und langsam einsickern gelassen. Der Durchlauf wurde zur Analyse aufbewahrt. Danach wurde die Säule mit Puffer 1 gewaschen und anschließend mit diskontinuierlich steigender Konzentration an NaCl im Puffer eluiert. Das Fraktionsvolumen betrug 5 ml (Flußrate 0,32 ml/mg). Von jeder Fraktion einschließlich dem Durchlauf wurde der Eiweißgehalt bestimmt (siehe 2.4.2). Das Vorgehen bei der Elution wurde so gewählt, daß die nächst höhere Konzentration an NaCl erst dann eingesetzt wurde, wenn der Proteingehalt der Fraktionen unter einen Wert von ca. 0,12 mg/ml gefallen war. Nachdem die Summe der Proteingehalte der Fraktionen und des Durchlaufs etwa 70 % der aufgetragenen Proteinmenge betrug und die Proteinkonzentration der Fraktionen des zuletzt verwendeten Puffers abgesunken ist, wurde die Chromatographie beendet.

Regenerierung des Trägermaterials:

Nach erfolgter Chromatographie wurde die Heparin - Sepharose in zugegebenem dest. Wasser aufgewirbelt, auf eine Fritte gegeben und mit 1 - 2 Säulenvolumina dest. Wasser gewaschen. Danach wurde das Trägermaterial mit 10 Säulenvolumina Regenerationspuffer 1 auf der Fritte gewaschen. Dies wurde mit der gleichen Menge Regenerationspuffer 2 und anschließend erneut mit Puffer 1 wiederholt. Danach wurde das in Puffer 1 aufgewirbelte Gel in die Säule gegeben und mit 15 Säulenvolumina Puffer 1 für eine erneute Benutzung äquilibriert.

2.4.5 Lyophilisierung

Die gereinigte Proteinlösung wurde gegen 5 mM Ammoniumhydrogencarbonat (NHCO) - Lösung dialysiert (wie bei 2.4.4). Anschließend wurde die Proteinlösung in einen Rundkolben gegeben und mit flüssigem Stickstoff eingefroren, wobei der Kolben gedreht wurde. Der Kolben wurde an die Gefriertrocknungsanlage angeschlossen (Vakuum von 0,12 - 0,14 mB bei -50C). Nachdem das Protein in Pulverform vorlag wurde der Kolben über ein Ventil langsam beluftet und danach von der Apparatur getrennt.

3 Ergebnisse und Diskussion

3.1 Kultivierung der Mikroorganismen

Das DNA - Bindungsprotein Protein Sac7e aus Sulfolobus acidocaldarius wurde mit Hilfe von E. coli Zellen des Typs BL21-DE3 [pLys S] hergestellt, welche mit den mit den Expressionsvektoren pET-3c/sac7e transformiert waren. Die Kultivierung erfolgte aus einer Gefrierkultur über eine 4 ml Vorkultur und 100 ml Hauptkultur, nach den Angaben von Studier et al. [st].

Zunächst wurden drei Vorkulturen (siehe 2.4.1) angeimpft und nach 4 h die erste optische Dichtemessung (, d=1 cm) zur Überprüfung des Wachstums durchgeführt. Die Meßergebnisse dieser und folgender Messungen an den Vorkulturen sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1: Wachstumsverhalten der Vorkulturen von E. coli BL21-DE3

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Nach 4 h und nach 5 h 35 min wurde jeweils nur eine Vorkultur überprüft, um das Volumen durch die Entnahme von Proben (jeweils 400 ml) nicht zu stark zu verringern.

Nach einer Kultivierungszeit von 5 h 35 min war die geforderte optische Dichte von rund 0,8 erreicht und die Kultivierung wurde abgebrochen. Die Vorkultur wurde bis zum Animpfen der Hauptkultur bei 4 C aufbewahrt.

Am folgendem Tag erfolgte das Animpfen der drei 100 ml Hauptkulturen (siehe 2.4.1). Das Wachstum der Kulturen ist in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2: Wachstumsverhalten der Hauptkulturen von E. coli BL21-DE3

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Nach 2 h 50 min war eine optische Dichte erreicht, die von Studier et al. [st]. für die Induktion der Proteinsynthese empfohlen wird. Der empfohlene Wert beträgt 0,8 (, d=1 cm). Daraufhin erfolgte die Induktion der Proteinsynthese durch Zugabe des Induktors IPTG.

Erfahrungsgemäß wachsen induzierte Kulturen nur unwesentlich weiter, wenn die Proteinsynthese optimal erfolgt. Die Kulturen 1 und 3 haben trotz Induktion an Dichte zugenommen (siehe Tabelle 2). Dies könnte bedeuten, daß die Überproduktion des Sac7e - Proteins durch die Bakterien nicht oder nur mangelhaft erfolgte. Dazu muß festgestellt werden, daß die beiden Kulturen nur unwesentlich weitergewachsen sind. Theoretisch vermehren Bakterien sich exponentiell und hätten somit eine weitaus höhere optische Dichte bei ungehemmten Wachstum erreichen müssen. Außerdem erhöht sich die Ungenauigkeit der optischen Dichtemessungen, sobald der Wert außerhalb des Bereiches von 0,1 - 1,0 liegt. Ebenfalls sind die hier aufgetretenen Abweichungen noch innerhalb der Genauigkeits dieser Methode. Somit ist anzunehmen, daß in allen Kulturen eine Überproduktion von Sac7e erfolgt ist. Trotzdem wurde die Kultur 2 getrennt weitergeführt, da sie eine Konstanz der optischen Dichte zeigte. Die Kulturen 1 und 3 hingegen wurden vereint.

3.2 Gewinnung des Proteinrohextraktes

Die Gewinnung der Proteinrohextrakte aus den Hauptkulturen erfolgte wie in Material und Methoden 2.4.2 beschrieben. Die Proteingehalte der Proben sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

Tabelle 3: Proteinbestimmung der Rohextrakte

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Probe 1 ist der Proteinrohextrakt der vereinten Kulturen 1 und 3. Probe 2 ist der Proteinrohextrakt der Kultur 2. Probe 3 und 4 sind aus Kulturen, die von Frau Grafe zuvor (wie in Material und Methoden beschrieben) kultiviert wurden, entstanden.

Zu den Meßwerten der Tabelle 3 ist anzumerken, daß mit der Probenmenge 50 ml/2 ml (Verdünnungsfaktor 40) nur einmal gearbeitet wurde, da die ermittelten optischen Dichten relativ hoch waren. Optische Dichtemessungen dieser Art sollten stets zwischen 0,1 - 1,0 liegen, um den Meßfehler gering zu halten.

3.3 1. SDS - Polyacrylamidgel - Elektrophorese

Es mußte zunächst überprüft werden, ob bei der Kultivierung der transformierten E. coli Zellen das Protein Sac7e in erforderlicher Größenordnung synthetisiert wurde. Zur Analyse der hergestellten Proteinrohextrakte wurde die SDS - PAGE (siehe 2.4.3) eingesetzt, da Molmasse und demzufolge auch die relative Laufstrecke des Sac7e - Proteins bekannt sind. Wie aus der Diplomarbeit von S. Tschiedel [ch] folgt, hat das Sac7e Protein eine Molmasse von 7 kDa.

Wie aus der 1. Abbildung ersichtlich ist, existiert bei den Proben 1 - 3 eine starke Bande im unteren Geldrittel. Nach der Bestimmung des R - Wertes dieser Bande und dem Molmassenvergleich mit dem Proteinstandard (Abb. 2) kann dieser Bande eine Molmasse von etwa 7 kDa zugeordnet werden. Diesen Wert kann man im Rahmen der Fehlerdifferenz bestätigten, denn wenn man die durch die Punkte des Molmassenstandards angedeutete Kurve (Verhältnis von molarer Masse zum R - Wert ist indirekt Proportional) nach rechts verlängert, so ist im Bereich von x = 0,76 ±1 (R - Wert der untersten Bande, Messungenauigkeit von 0,5 mm) ein y - Wert von 7 kDa möglich. Zu der Messungenauigkeit mit dem Lineal kommt noch hinzu, daß im Bereich von so kleinen molaren Massen die Abhängigkeit von relativer Laufstrecke und molarer Masse nicht mehr genau indirekt proportional ist. Somit ist davon auszugehen, daß es sich bei dieser Bande um das Protein Sac7e handelt.

Außerdem stimmt das Bandenmuster der Rohextrakte in der SDS - PAGE (Abb. 1) mit dem Bandenmuster überein, das in vorhergehenden Untersuchungen zur Expression des Sac7e - Proteins in E. coli erhalten wurde [ch]. In der zitierten Diplomarbeit wurde auch der exakte Nachweis (Bestimmung des N - Terminus, Massenspektrometrie, Sequenzierung), daß es Sac7e und nicht ein ähnliches Protein (z. b. Sac7d) ist, erbracht.

In der Probe 4 ist die Bande an exprimiertem Sac7e - Protein schwächer ausgebildet (siehe Abb. 1). Dies könnte an dem Wachtumsverhalten dieser Kultur liegen, denn vor der Induzierung betrug dienur 0,7 und 1 h nach der IPTG - Zugabe sank dieser Wert um 0,15 ab.

Da die Zusammensetzung der 1. und 2. Probe annähernd gleich ist, wurden beide Rohextrakte vereint. Probe 4 wurde aufgrund der schwächeren Bande im folgenden nicht weitergeführt.

Für das Sac7e - Protein ergab sich somit ein R - Wert von 0,76 (siehe oben, Abb. 2), der in den folgenden Experimenten als Vergleichswert herangezogen wurde. Da der R - Wert unabhängig vom jeweiligen Experiment ist, ist er für ein und dasselbe Protein in verschieden SDS - PAGE’s gleich. Somit ist er eine geeignete Größe das angereicherte Protein zuzuordnen und zu charakterisiren.

3.4 1. Chromatographie an Heparin - Sepharose

Die Chromatographie erfolgte wie in 2.4.4 beschrieben. Es wurden die Rohextrakte von drei 100 ml Kulturen (hier Probe 1 und 2, insgesamt 12 ml) als Ausgangsmaterial verwendet. Nach der Dialyse gegen insgesamt 3 l Pufffer 1 (0,15 M NaCl enthaltend) (Wechsel aller 45 min) wurde das Rohextrakt (12,5 ml) auf eine äquilibrierte Heparin - Sepharose Säule aufgetragen und mit Puffern steigender NaCl - Konzentrationen eluiert.

Aus Tabelle 4 wird deutlich, daß ca. 64 % des aufgetragenen Proteins fest an das Säulenmaterial absorbiert wurden, von dem etwa 12 % mit einer NaCl - Konzentration von 0,2 M eluiert werden konnten. Dabei könnte es sich um das gesuchte Protein Sac7e handeln, da bei S. Tschiedel [ch] das gesuchte Protein Sac7e in einem ähnlichem Konzentrationsbereich von eluiert wurde. Da nach der Proteinbilanz noch rund 52 % des Gesamtproteins am Träger gebunden sein mußten und die Menge an vermutetem Sac7e - Protein relativ gering schien, wurde die NaCl - Konzentration anschließend in einem größeren Schritt erhöht. Dabei konnten nochmals etwa 19 % des aufgetragenen Gesamtproteins eluiert werden. Von den rund 47 mg aufgetragenem Protein wurden ca. 69 % wieder eluiert (Der Durchlauf wird auch als Fraktion angesehen und deshalb in die Summenrechnung mit einbezogen).

Tabelle 4: Reinigung des Sac7e - Proteins an Heparin - Sepharose

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Proteingehalte wurden nach der Methode von Kalb und Bernlohr [ka] (mit Beachtung der Verdünnungs- und Umrechnungsfaktoren) bestimmt.

Abbildung 3 zeigt das Elutionsdiagramm dieses Chromaographieschrittes. Dieses Diagramm stellt die oben beschriebenen Sachverhalte graphisch dar.

Der Nachweis welche Fraktionen das Sac7e - Protein enthalten, wurde anschließend durch eine SDS - PAGE erbracht.

3.5 2. SDS - Polyacrylamidgel - Elektrophorese

Die Analyse der Fraktionen der Chromatographie an Heparin - Sepharose erfolgte wiederum durch eine SDS - PAGE (siehe 2.4.3). Abbildung 4 zeigt das Bandmuster einzelner Fraktionen des Chromatographie - Experimentes.

Es ist aus Abbildung 4 ersichtlich ist, daß das gesuchte Protein in der 10. Fraktion (Spur 8) eluiert wurde. Denn es kann der untersten, starken Bande ein R- Wert von 0,76 zugeordnet werden. Dieser Wert entspricht dem Wert der ersten Elektrophorese, so daß davon ausgegangen werden kann, daß es sich bei dieser Bande um das Protein Sac7e handelt.

Das Elektrophoresebild belegt weiterhin, daß das Sac7e - Protein nicht wie vermutet mit 0,2 M NaCl Puffer vom Trägetr eluiert wurde (Spur7). Bei dieser NaCl - Konzentration wurde lediglich Fremdprotein entfernt.

Abbildung 4 weist außerdem aus, daß das Sac7e - Protein durch die Chromatographie angereichert wurde und daß die Fraktion nicht völlig frei von Fremdprotein ist. Im oberen Molmassenbereich finden sich noch zahlreiche, wenn auch dünne Banden. Damit war das Ziel elektrophoretisch reines Sac7e Protein herzustellen, noch nicht erreicht, so daß ein 2. Reinigungsschritt angeschlossen werden müsste.

3.6 2. Chromatographie an Heparin - Sepharose

Die Vermutung, daß das Protein Sac7e mit einer Konzentration von 0,2 M NaCl vom Träger eluiert werden kann, wurde nicht bestätigt. Die Fraktion 10 der 1. Chromatographie (mit 0,5 M NaCl eluiert) in der das Sac7e - Protein angereichert war, wurde nochmals mit dem gleichen Verfahren unter Variation der Elutionsbedingungen behandelt, um eletrophoretisch reines Sac7e - Protein zu erhalten.

Für die 2. Chromatographie an Heparin - Sepharose wurde 4 h, 30 min mit 4 l Puffer 1 dialysiert (dreimaliger Pufferwechsel). Es wurde länger dialysiert, um die Salzkonzentration in der 10. Fraktion von 0,5 M NaCl auf die Äquilibrierungskonzentration abzusenken.

Die dialysierte Probe wurde auf die regenerierte Heparin - Sepharose Säule aufgetragen und zunächst mit Puffer 1 (0,15 M NaCl enthaltend) gewaschen. Nachfolgend wurde ebenfalls mit steigender NaCl - Konzentration im Puffer eluiert. Es lag die Vermutung nahe, daß eine Konzentration von 0,2 M NaCl nicht ausreichend war um Sac7e zu eluieren, der Schritt auf 0,5 M NaCl jedoch zu groß war und dadurch der Fremdproteinanteil erhöht wurde. Es ist anzunehmen, daß bei NaCl - Konzentrationen zw. 0,2 und 0,3 M Sac7e ohne die Fremdproteine eluiert werden kann. Deshalb wurde bei der 2. Chromatographie an Heparin - Sepharose nach der Elution mit 0,2 M NaCl im Puffer zusätzlich mit einer Konzentration von 0,3 M NaCl eluiert. Es wurde auch in der 2. Chromatographie mit 0,5 M NaCl haltigem Puffer 4 eluiert, um den Verlauf der Chromatographie abschließend bewerten zu können und um sicherzustellen, daß nicht Teile des gesuchten Proteins am Träger verblieben sind.

Tabelle 5: Reinigung des Sac7e - Proteins an Heparin - Sepharose

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Proteinbestimmung erfolgte nach der Methode von Kalb und Bernlohr [ka] (mit Beachtung der Verdünnungs- und Umrechnungsfaktoren).

Tabelle 5 weist aus, daß bei Salzkonzentrationen von 0,15 M und 0,2 M NaCl kaum Protein eluiert wurde. In Gegenwart von 0,3 M NaCl stiegt der Proteingehalt stark an. Bei dieser Konzentration wurden rund 61 % des ursprünglich aufgetragenen Proteins eluiert. Es ist wahrscheinlich, daß dies das Protein Sac7e ist, da mit 0,5 M NaCl nur noch ein geringer Proteinanteil, der dem Fremdpotein entsprechen könnte, von der Säule gewaschen wurde. Es wurde von ca. 7 mg aufgetragenem Protein etwa 83 % eluiert (der Durchlauf wird auch als Fraktion angesehen und deshalb in die Summenrechnung mit einbezogen).

Das Elutionsdiagramm der 2. Chroamtographie an Heparin - Sepharose in Abbildung 5 faßt diese graphisch zusammen.

Zur Analyse der erhaltenen Fraktionen wurde wiederum eine SDS - PAGE durchgeführt.

3.7 3. SDS - Polyacrylamidgel - Elektrophorese

Die Analyse der Fraktionen der 2. Chromatographie an Heparin - Sepharose erfolgte durch eine SDS - PAGE (siehe 2.4.3)

Das Bandmuster des Gels ist in Abbildung 6 dokumentiert.

Die Abbildung vergleicht die Ausgangslösung (Spur 4 und 5) mit einigen Fraktionen der 2. Chromatographie an Heparin - Sepharose. Dabei wird deutlich, daß das gesuchte Protein (unterste Bande der Spur 4, 5 und 7, R- Wert: 0,76) durch 0,3 M NaCl vom Träger eluiert worden ist (Spur 7). Dies bestätigt die nach der 2. Chromatographie geäußerte Vermutung.

Es konnte mit NaCl - Konzentrationen von 0,15 M und auch noch bei 0,3 M (Spur 6) Fremdprotein eluiert werden. Weitere Anteile an Fremdprotein blieben bei Behandlung mit 0,3 M NaCl am Träger gebunden. Ihre Elution erfolgte nach dem Sac7e - Protein in Gegenwart von 0,5 M NaCl (Spur 9).

Somit konnte der größte Teil von Fremdprotein von Sca7e getrennt werden. In der 7. Spur sind nur schattenhafte Fremdproteinbanden erkenntlich und deshalb davon auszugehen ist, daß Sac7e in elektrophoretisch reiner Form gewonnen werden konnte.

Nach dieser analytischen SDS - PAGE kann festgestellt werden, daß aus 300 ml Bakterienkultur (aus 50 mg Gesamtprotein) 2,42 mg reines Sac7e - Protein gewonnen werden konnte.

Allerdings hat es sich ergeben, daß statt einem zwei Reinigungsschritte benötigt wurden. Es kann jedoch sein, daß die vollständige Reinigung mit nur einer Chromatographie an Heparin - Sepharose durchgeführt werden könnte, indem von vornherein die Erhöhung der Salzkonzentration im Waschpuffer in kleineren kontinuierlichen Schritten erfolgt.

Das Protein (2,42 mg) liegt nun in einer Lösung mit einem Volumen von 5,5 ml vor. In dieser Lösung ist das Protein nicht lagerfähig. Es wurde deshalb im folgenden gefriergetrocknet.

3.8 Lyophilisierung

Die 7. Fraktion (5,5 ml; 0,44 mg/ml) der 2. Chromatographie an Heparin - Sepharose wurde (siehe 2.4.5) 22 h gegen insgesamt 9 l des flüchtigen Ammoniumhydrogencarbonat - Lösung (zweimaliger Wechsel) dialysiert, eingefroren und gefriergetrocknet. Die Lyophilisierung war nach 24 h beendet und ergab 2,42 mg Protein in Pulverform. Damit war das Ziel der Arbeit, das Protein Sac7e in elektrophoretisch reiner, lagerfähiger Form herzustellen erreicht.

4 Zusammenfassung

Die Aufgabe im Rahmen der vorliegenden Arbeit bestand darin, eines der DNA - Bindungsproteine aus Sulfolobus acidocaldarius in elektrophoretisch reiner Form anzureichern. Dazu stand der transformierte E. coli Stamm BL21-DE3 [pLys S] mit dem transformierten Expressionsvektor pET-3c/sac7e zur Verfügung.

Dieser gentisch veränderte E. coli Stamm ist in der Lage, größere Mengen des Zielproteins zu synthetisieren als der Ausgangsstamm, wodurch die Proteinreinigung wesentlich erleichtert wird.

Nach der Kultivierung der E. coli Zellen wurde aus insgesamt 300 ml Kultivierungsansatz die Zellpaste gewonnen und in 12 ml Puffer resuspendiert. Nachdem der Aufschluß durch Ultraschall erfolgt war, wurde ein zellfreie Rohextrakt durch Zentrifugation gewonnen.

Die elektrophoretische Analyse ergab, daß der Gehalt an Sac7e - Protein im Rohextrakt ausreichend groß war. Zur Präperation des Sac7e - Proteins wurde eine Chromatogphie an Heparin - Sepharose nach vorheriger Dialyse durchgeführt. Die anschließende elektrophoretische Analyse ergab, daß noch Fremdprotein in der Sac7e enthaltenden Fraktion vorhanden war. Deshalb mußte eine 2. Chromatographie an Heparin - Sepharose unter Variaton der Elutionsbedingungen durchgeführt werden. Das so gewonnene Präperat war weitestgehend elektrophoretisch rein.

Zur Überführung des Sac7e - Proteins (5,5 ml; 0,44 mg/ml) in eine lagerfähige Form wurde die Sac7e - Protein enthaltende Fraktion gefriergetrocknet.

Aus insgesamt 300 ml Kultivierungsansatz (46,9 mg Gesamtprotein im Rohextrakt) konnte 2,42 mg Protein gewonnen werden.

Mit dieser Proteinmenge (2,42 mg) können weitere Untersuchungen, die mehr Ausgangsmaterial erfordern, als bisher durch Kultivierung von Sulfolobus acidocaldarius dargestellt werden konnte, durchgeführt werden. Diese Untersuchungen können der Aufklärung der Struktur und Eigenschaften dieses Proteins dienen, um Einblick in die Mechanismen der Proteinfaltung oder der Stabilisierung der DNA zu bekommen.

Literatur

[1] Edmondson, S. P., Lingshi, Q. und Shriver, J. W.: (1995) Biochemistry 34, 13289-13304

[2] Grote, M., Dijk, J. und Reinhardt, R.: (1986) Biochem. Biophys. Acta 873, 405-413.

[3] Jaenicke, R. und Zavodsky, P.: (1990) FEBS lett. 286, 344-349.

[4] Kalb, R. und Bernlohr, W.: (1997) Anal. Biochem. 120, 267-275.

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[9] Tschiedel, S.: (1997) Reinigung und Charakterisierung rekombinanter DNA-Bindungsproteine aus Sulfolobus acidocaldarius (Diplomarbeit), Universität Leipzig.

Sekundärliteratur:

Kleber, H.P., Schlee, D. und Schöpp, W.: (1990) Biochemisches Praktikum, Gustav Fischer Verlag.

Lehninger, A. L., Nelson, D. L. und Cox, M. M.: (1994) Prinzipien der Biochemie Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg.

Firmenschrift: Heparin - Sepharose CL - 6B for affinity chromatographie, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden.

Selbstständigkeitserklärung

Ich erkläre hiermit, daß ich die Facharbeit ohne fremde Hilfe angefertigt und nur die im Literaturverzeichnis angeführten Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.

Leipzig, den 8. Juli 1999

Natalie Bordag

Danksagung

Es ist mir ein Bedürfnis, Frau PD Dr. M. Grunow für stete Aufmerksamkeit und die guten Bedingungen in ihrer Arbeitsgruppe zu danken.

Ebenso möchte ich mich beim Direktor des Instituts für Biochemie der Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie und bei allen Mitarbeitern, die durch ihre Unterstützung und durch ständig freundliche Atmosphäre zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, bedanken.

Für die hervorragende Einführung in die technische Ausstattung des Labors möchte ich mich gern bei Frau Grafe bedanken.

Besonders bedanken möchte ich mich bei Herr Dr. Goldberg von der Wilhelm-Ostwald-Schule (Gymnasium), allen Lehrern und der Schulleitung für das schaffen von günstigen Rahmenbedingungen, die das Entstehen dieser Arbeit während des normalen Schulbetriebes ermöglichten.

Thesen

Anreicherung des DNA - Bindungproteins Sac7e aus Sulfolobus acidocaldarius

1. Sac7e ist ein DNA - Bindungsprotein aus dem thermophilen Archeon Sulfolobus acidocaldarius.

2. Solche Proteine sind zur Charakterisierung der Wechselwirkung zwischen DNA und ihren Bindungsproteinen geeignet, wie auch für Untersuchungen von Proteinfaltung und Stabilität.

3. E. coli BL21-DE3 [pLys S] mit dem transformierten Expressionsvektor pET-3c/sac7e synthetisiert das Protein Sac7e in größeren Mengen.

4. Die Gewinnung eines zellfreien Extraktes mit hohem Gehalt an Sac7e - Protein ist durch Zellaufschluß mit Ultraschall und anschließender Zentrifugation möglich.

5. Der Nachweis des Sac7e - Proteins erfolgt mittels SDS - Polyacryamidgel - Elektrophorese.

6. Die Affinitätschromatographie an Heparin - Sepharose ist ein geeignetes Reinigungsverfahren für die Gewinnung von Sac7e - Protein.

7. Nach der Dialyse gegen einen Phosphatpuffer (0,15 M NaCl enthaltend) bindet das Sac7e - Protein quantitativ an das äquilibrierte Affinitätsgel.

8. Die Elution des Zielproteins erfolgt durch schrittweise Erhöhung der NaCl - Konzentration im Elutionspuffer.

9. Bei geeigneter Wahl der Elutionsbedingungen kann durch nur einen Chromatographieschritt weitgehend elektrophoretisch reines Sac7e - Protein gewonnen werden.

10. Das Sac7e - Protein läßt sich durch Gefriertrocknung in eine lagerfähige Form bringen.

11. Aus 300 ml Kultivierungsansatz (46,9 mg Gesamtprotein im Rohextrakt) können 2,42 mg elektrophoretisch reines Sac7e - Protein gewonnen werden, das für weitergehende Untersuchungen zur Verfügung steht.