Methoden der DNA-Isolierung und Analyse

Inhaltverzeichnis:

1. Vorwort

2. Isolierung der DNA
2.1. Isolierung der DNA aus der Mundschleimhaut
2.2. Probleme bei der DNA-Analyse bei Haaren

3. Restriktionsenzyme

4. Das Genom

5. Polymerase Chain Reaction (PCR)
5.1. Vorbetrachtung – Replikation
5.2. Prinzip und Durchführung der PCR

6. Fingerprinting
6.1. Agarose-Gelelektrophorese
6.1.1. Vorbetrachtung – Aufbau der DNA
6.1.2. Durchführung der Agarose-Gelelektrophorese
6.2. Auswertung
6.3. Mögliche Anwendungsfehler

7. Möglichkeiten des Missbrauchs ? – Die Rechtslage

8. Nachwort

Glossar

Anhang 1

Anhang 2

Quellenangabe

1. Vorwort

Am 28.10.2002 besuchte ich mit dem Leistungskurs Biologie (1. Semester) das Gläserne Labor. Dieses befindet sich auf dem Campus Berlin-Buch. Der Campus umfasst 32ha und ist ein einzigartiger Standtort für Biomedizin. Auf ihn befindet sich das Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC), das Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie (FMP) und für den Bereich der klinischen Forschung die Robert-Rössel-Klinik und die Franz-Volhard-Klinik. Hinzu kommen 28 biomedizinische und 6 Dienstleistungsunternehmen.

Das Gläserne Labor, ein Informationszentrum für Gen- und Biotechnologie, spielt dabei die Rolle einer Kommunikationsplattform zwischen dem Campus und der Öffentlichkeit. Hier kann die Allgemein unter Anleitung eines Experten einfache genetische Experimente durchführen. Das Labor ist etwa 50 Quadratmeter groß und ist eine Labor der Sicherheitsstufe 1. Sicherheitsstufe 1 bedeutet das hier nur Experimente mit gentechnisch veränderten Substanzen durchgeführt werden, von den keine Gefahr ausgeht. Das Labor ist mit allen Gerätschaften ausgestattet die in der Molekularbiologie Anwendung finden. Dazu gehören:

Mikropipetten, Zentrifugen, Elektrophoresekammern, Schüttler, Sicherheitswerkbänke und vieles mehr.

Unser Kurs führte zwei Experiment durch: Isolierung von DNA * aus der Mundschleimhaut und eine Simulation der forensischen DNA-Analyse. Die Dauer der Experimente betrug zusammen ca. 4 Stunden.

Beide Verfahren werden vor Allem in der Kriminalistik angewendet. Folgende Sachverhalte spiele dabei eine Rolle:

- Überführen eines Täters durch am Tatort hinterlassene Spuren (z.B. Sperma, Blut, Speichel, Haare, etc.)
- Nachweis von Serienstraftätern
- Nachweis einer Elternschaft bei ausgesetzten Kindern
- Aufdeckung doppelter Identitäten einer Person

Ein weiteres Gebiet auf dem die DNA-Analyse angewandt wird, ist die Medizin. Hie dient sieh vor Allem der Krankheit prävention *, -früherkennung und –frühbehandlung.

2. Isolierung der DNA

2.1 Isolierung der DNA aus der Mundschleimhaut

Unser erstes Experiment war die Isolierung der DNA (D esoxyribo n iclein a cid) aus der Mundschleimhaut. Ziel dieses Experiments war es die grundlegenden Arbeitstechniken bei der Gewinnung der DNA aus biologischen Substanzen kennen zu lernen, welch auch in der Forschung, Medizin und Kriminalistik verwendet werden.

Das Prinzip der Isolierung lässt sich so beschreiben. Der Speichel wird mit Hilfe eines sterilen Tupfers aus der Mundschleimhöhle entnommen. Die darin enthaltenen Zellen werden durch tensid- und salzhaltige Stoffe aufgeschlossen, so dass die DNA frei zugänglich wird. Diese wird an ein mineralisches Trägermaterial gebunden, gewaschen und so anschließend von Zellbestandteilen und Stoffen der Mundschleihaut getrennt. Zum Schluss wird die DNA noch vom Trägermaterial gelöst und durch Elektophorese * in einem Agarose-Gel* nachgewiesen.

Im Detail sieht der Versuchsablauf so aus:

Als erstes wird die Mundschleimhaut mit Hilfe eines sterilen Tupfers aus der Mundhöhle entnommen. Um eine größtmögliche Anzahl von Zellen zu erreichen wird der Tupfer 3 Minuten lang mit rollenden Bewegungen entlang der Mundhöhle geführt. Anschließend wird der Tupfer 5 Minuten in ein Reaktionsgefäß mit Lysispuffer * gestellt.

Im Speichel sind Zellen enthalten. Um an di e DNA zugelangen müssen diese Zellen zerstört werden. Dies geschieht durch den Lysispuffer. Die Zellmembran setzt sich aus Fetten und Proteinen zusammen. Um die Zellmembran aufzulösen und den Zellkern zu zerstören braucht man also eine salz- und seifenhaltige Lösung. In unserem Fall ist das der Lysispuffer. Schematisch sieht dieser Vorgang so aus:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Nach Ablauf der 5 Minuten wird der Tupfer aus dem Gefäß genommen und an der Gefäßinnenwand ausgedrückt.

Um die DNA zu lokalisieren, wird sie in nächsten Schritt an ein Trägermaterial gebunden. Diese Trägermaterial besteht aus kleinen mineralischen Partikeln. 200 ml Bindungspuffer, als Unterstützung der Bindung, und 10 ml Trägermaterial werden mit den zuvor gewonnen Zellproben vermischt. Die DNA ist somit an dem Trägermaterial gebunden.

Diese Verbindung ist schwerer und größer als die restlichen Bestandteile Zelle. Um nun diese Verbindung von den restlichen Bestandteilen zu trennen, muss die Lösung gefiltert und zentrifugiert werden. Dazu wird die Probe in ein spezielles Gefäß gegeben, welches im oberen Teil enthält. Das Reaktionsgefäß wird 2 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und anschließend für 6 Minuten bei 12.000 U/min zentrifugiert.

Die löslichen und ungebundenen Komponenten der Zellen werden durch den Filter gedrückt. Im Filter bleibt die gebundene DNA zurück.

Um sicher zu gehen, dass sich im Filter wirklich nur noch die gebundene DNA befindet, werden 550 ml Waschpuffer auf den Filter gegeben und schließlich bei 12.000 U/min 1 Minute lang zentrifugiert. Der Waschpuffer besteht aus Ethanol und löst somit alle übrigen Stoffe. Dieser Vorgang wird nochmals wiederholt.

Um auch das Ethanol zu entfernen, wird das Reaktionsgefäß ein letztes mal, ohne Zugabe von Lösungen, zentrifugiert.

Um die DNA nachweisen zu können muss sie von dem Trägermaterial gelöst werden. Dazu gibt man 50ml, eines auf 70°C vorgeheizten, Elutionspuffer direkt auf die Filtermembran und zentrifugiert das Gefäß 2 Minuten lang bei 10.000 U/min, nach dem man es 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen hat. Der Puffer löst die DNA von der dem Trägermaterial. Die Wärme beschleunigt diesen Vorgang. Am Ende liegt die DNA am Boden des Reaktionsgefäßes vor.

Als letzter Schritt folgt der Nachweis der DNA durch die sogenannte Agarose-Gelelektrophorese. Dieser Vorgang wird unter Punkt 6.1. erklärt. Ein Protokoll zum Versuchsablauf der Isolierung der DNA befindet sich in Anlage 1.

2.2. Probleme bei der DNA-Analyse aus Haaren

Die Isolierung von DNA vor Allem in der Kriminalistik verwendet. Die häufigsten Spurenarten bei Straftaten sind menschliche Haare. Doch hier gibt es bei der Isolierung und Analyse einige Probleme, die beachtet werden müssen.

Ein Haar in der Wachstumsphase, bezeichnet man als „anagenes Haar“. Es wird in den sogenannten Haarfollikel – eingesenkte Strukturen in der Haut – gebildet. Der Hauptbestandteil dieser Follikel sind gut durchblutete Gewebe. Um nun die Haare zubilden muss im Gewebe ständig Zellteilung ablaufen. Im Verlauf der Wachstumsphase beginnt das Haar sich zu verhornen. Die spindelförmigen Haarzellen werden mit Keratinproteinen* gefüllt, was eine Einstellung des Stoffwechselprozesses bedeutet. Des Weiteren werden die Zellkerne, in denen sich Kern-DNA, befindet aufgelöst und DNA-Stränge zu kurzen Bruchstücken abgebaut. Der Zustand des Haares wird jetzt als „telogen“ bezeichnet.

Zur Analyse der Haare werden nun zwei Techniken verwendet: 1. mikroskopisch – morphologische * und 2. molekularbiologische Untersuchung.

Die mikroskopisch – morphologische Untersuchung dient der Erfassung von Länge, Dicke, etc . (metrische Merkmale) und Kortexstruktur, Pigmentierung.

Die mikrobiologische Untersuchung lässt sich wiederum in 3 Methoden aufgliedern.

Die erste Methode ist die Analyse der Keratin -Typen. Diese Methode wird jedoch nicht so oft eingesetzt, da die Merkmalsverteilung ungünstig ist.

Die zweite Möglichkeit ist die Analyse der mitochondrialen DNA (mtDNA). Dieses Verfahren besitzt jedoch einen Sonderstatus, da die Mitochondrien nicht Bestandteile des Zellkerns sind. Jedoch lassen sich, laut Aussage von Wissenschaftler, bestimmte Merkmale der Kern-DNA zurückführen.

Die 3 Methode ist zugleich die wichtigste. Hier wird die Kern-DNA analysiert. Der Vorgang funktioniert genauso wie jede andere DNA Analyse. Wichtig ist hier, dass die Methode nur angewandt werden kann, wenn es sich nicht um ein telogenes Haar handelt. D.h. es müssen intakte Zellen im Wurzelbereich vorliegen.

3. Restriktionsenzyme

Das wichtigste Werkzeug in der Gentechnik sind die sogenannten Restriktionsenzyme.

Entdeckt wurden sie Anfang 1970. Der eigentlich Name ist Restriktionsendonuklease. Restriktionsenzyme sind DNA spaltende Enzyme, die die DNA nur an ganz bestimmten Stellen, sogenannten Palindromen, spalten. Entdeckt wurden sie in Bakterien, in Rahmen der einer Untersuchung wie sich diese gegen Viren verteidigen.

Wie arbeiten diese Restriktionsenzyme nun? Restriktionsenzyme erkennen auf der DNA eine für sie spezifische Basenabfolge von 4 bis 8 Basenpaare. Haben sie diese einmal erkannt, beginnen sie sie Durchzuschneiden. Eine solche Stelle wird daher als Schnittstelle bezeichnet.

Das diese Schnittstellen unterschiedlich verlaufen können, zeigen die folgenden Graphiken.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

4. Das Genom*

Das menschliche Genom besteht aus 23 Chromosomenpaaren. Genom ist die Gesamtheit aller Gene in einer Zelle. Von diesen 23 Paar sind 22 die sogenannten Autosomen und 1 Paar die Gonosomen. Letzteres bestimmt das Geschlecht. 2 X-Chromosomen bedeuten weiblich, ein X und ein Y-Chromosom bedeutet männlich.

Eine höhere Entwicklungsstufe ist nicht gleichzusetzen mit einer höheren Chromosomenanzahl. Dies zeigt die folgende Tabelle deutlich.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Interessant ist auch die Anzahl der Gene, die in einem Genom vorhanden sind. So ist es nicht so, dass sich in eukaryontischen* Zellen mehr Gene befinden als in prokaryontischen *. Selbst die eukaryontischen Arten, die am wenigsten Gene in ihre Zellkern haben, haben immer noch 10 mal mehr Gene als sich in einer Bakterienzelle befinden. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die eukaryontischen Organismen im Allgemeinen eine größere Mannigfaltigkeit und Komplexität der Stoffwechselvorgänge aufweisen. Besonders große Eukaryontengenome können sogar bis zu 2000mal so viele Gene besitzen wie eine E. coli-Zelle. Noch erstaunlicher jedoch ist, dass der Gengehalt des Genoms sogar zwischen verwandten Arten erheblich variieren kann. Bei Amphibien zum Beispiel kann der DNA-Gehalt einer Spezies 100mal größer sein, als bei einer anderen dieser Art.

Beim menschlichen Genom ging man bis vor kurzem von einer Genanzahl von 100 000 aus. Dies Zahl musste aber deutlich korrigiert werden. Inzwischen geht man davon aus, dass das menschliche Genom zwischen 30 000 und 50 000 Gene besitzt.

Einen guten Überblick über die unterschiedliche Genomgrößen gibt folgende Tabelle:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

5. Polymerase Chain Reaktion (Polymerasen-Kettenreaktion, PCR)

Besondere Anwendung finden die Restriktionsenzyme in der PCR (Polymerase Chain Reaction).

5.1. Vorbetrachtung –Replikation*

Dazu sind einige Vorbetrachtung nötig. Das Verfahren beruht auf der Replikation der DNA.

Die Replikation dient der Verdopplung der DNA. Dazu ist es zunächst nötig den DNA-Doppelstränge in Einzelstränge zu zerlegen. Die Funktion über nehmen Helikasen und andere Proteine. Jetzt setzen Primasen an den 5’ – Enden der beiden Stränge an und synthetisieren ein kleines Stück komplementäre DNA. Dieses Stelle wird als Primer bezeichnet. Als nächsten docken DNA-Polymerasen an diesen Primerstellen an und synthetisieren die DNA in 3’-Richtung.

Da die Helikase die DNA immer weiter auftrennt, geht auf den einen Strang die Synthese bis zum Ende der DNA weiter. Hier wird der sogenannte Leitstrang synthetisiert. Auf dem gegenüberliegenden Strang läuft die Synthese jedoch genau in die andere Richtung. D.h. es müssen immer wieder neue Primerstellen hergestellt werden. Kommt eine DNA-Polymerase an eine zuvor schon synthetisierte Primerstelle , löst sie diese auf. DNA-Ligasen* stopfen das entstandene Loch wieder. Der synthetisierte Strang wird Folgestrang genannt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

5.2. Prinzip und Durchführung der PCR

Das Prinzip der Polymerasen-Kettenreaktion ist, dass eine gegebene DNA-Sequenz immer wieder kopiert wird. So erhält man in kürzester Zeit aus einer kleinen DNA-Probe genug um sie analysieren zu können. Angebracht ist diese Methode um eine bestimmte Basensequenz zu untersuchen.

Mit Hilfe der Restriktionsenzymen wird der spezifische DNA-Abschnitt heraus geschnitten Die PCR-Reaktion wird mit folgenden Bestandteilen durchgeführt:

- die gewünschten DNA-Abschnitte
- DNA-Startmoleküle (Primer)
- Polymerasen
- und Desoxyribonucleosid-triphosphate (dATP,dGTP,dTTP) => Energieträger

Jeder Reaktionszyklus besteht aus 3 Phasen

1) Aufspalten der DNA
2) Anlagerung der Startmoleküle bei
3) Synthese des DNA Doppelstrangs

Diese Phasen entsprechen der Replikation der DNA. Sie werden in der Regel 20-30 mal wiederholt.

Der Vorteil der PCR gegenüber einer natürlichen Replikation liegt darin, dass durch Wärme der Vorgang beschleunigt wird. Außerdem bildet jeder replizierter DNA-Abschnitt wieder eine Matrize zum weiterreplizieren. Je öfter der Vorgang wiederholt wird des so schneller steigt die Anzahl der replizierten DNA-Abschnitte, da dies exponentiell von statten geht (2,4,8,16,32,..)

6. Fingerprinting

Anwendung findet die PCR in forensischen (gerichtlichen) DNA-Analyse. Hier zu gehört das sogenannte Fingerprinting. Mit diesem Verfahren lässt sich genetischer Fingerabdruck eines Menschen erstellen. Günstig ist dies, wenn man an einem Tatort Speichel, Sperma oder sonst irgendwelches Material, welches DNA enthält, auffindet. Jetzt kann man über die Fingerprint-Methode diese DNA mit der DNA verdächtiger Personen vergleichen.

Das ganze verfahren erfolgt in zwei Schritten. Die erste Phase ist die Restriktionsspaltung, die zweite die Agarose-Gelelektrophorese.

Zuerst werden die Reaktionsgefäße mit der DNA der Verdächtigen, sowie der Tatortprobe mit einer Restriktionsenzymlösung und einen Restriktionspuffer gemischt. Zur Sichtbarmachung unter UV-Licht kommt noch ein Probenpuffer hinzu. Die Mengen betragen je 6 ml Enzymlösung und je 8 ml Restriktionspuffer. Dann werden die Gefäße verschlossen und mit Hilfe eines Vortexers (kleine, rotierende Gummischeibe) werden die Reaktionskomponenten vermischt. Zusätzlich werden die Gefäße noch kurz zentrifugiert, damit sich der Inhalt am Gefäßboden befindet. Zum Schluss werden die Gefäße in einen Heizblock gestellt und bei 37° C für 30 min bebrühtet. Dies beschleunigt den Vorgang der Restriktionsenzyme.

6.1 Agarose-Gelelektrophorese

Jetzt folgt die Agarose-Gelelektrophorese.

6.1.1. Vorbetrachtung – Aufbau der DNA

Um den Vorgang zu verstehen, sind einige Vorbetrachtungen zur DNA nötig!

Die DNA besteht aus einer Doppelhelix. Diese besteht aus zwei spiralisierten Strängen die sich ½ mal um eine Histonmolekül * gewickelt haben. 8 solcher Moleküle bilden ein Chromatin. Die spiralisierte und kondensierte Form des Chromatin nennt man Chromatid. 2 Chromatide haften zusammen und bilden so das Chromosom. Das Chromosom stellt die Transportform der DNA während der Zellteilung dar.

Auf chemischer Basis gesehen hat die DNA folgenden Aufbau. Die beiden zuvor erwähnten Stränge bestehen abwechselnd aus einem Zuckermolekül, der Desoxyribose, und einem Phosphatsäurerest. Zwischen den Strängen befinden sich Stickstoffbasen. Diese sind Adenin, Guanin, Cytosin, und Thymin. Jeweils zwei Basen liegen sich gegenüber. Entweder Adenin und Thymin oder Guanin und Cytosin. Eine Verbindung aus Zucker, Phosphatsäurerest und Base bezeichnet man als Monomer . Die beiden Stränge laufen Antiparallel, was eine spiralförmige Aufwindung zur Folge hat. Immer 3 benachbarte Basen codieren eine Aminosäure. Durch die Vorgänge Transkription (Überschreiben der DNA in eine m-RNA) und Translation (Übersetzung) werden Enzyme (Polypeptidketten) hergestellt die zur Merkmalsbildung nötig sind.

Schematisch lässt sich der Aufbau der DNA so darstellen:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Außerdem ist in der Graphik zu sehen, dass die gegenüberliegenden Basen durch Wasserstoffbrückenbindungen zusammengehalten werden. In Hinsicht auf die Agarose-Gelelektrophorese ist jedoch ein anderer Fakt wesentlicher. Der Phosphorsäurerest ist negativ geladen. Dadurch das die anderen Bestandteile elektrisch neutral sind, ist die DNA somit negativ geladen.

Genetisch gesehen sind alle Menschen zu 99,9% gleich. Dies liegt an der hohen Übereinstimmung der Basensequenzen. Wieso ist dies so ? Die Gene enthalten vor allen Dingen den Aufbauplan des Körpers und den Ablauf von Stoffwechselvorgängen. Das sind alles Lebenswichtige Dinge und kommen bei allen Menschen gleich vor. Das Aussehen, Größe, Augenfarbe, etc. bilden dabei nur einen ganz kleinen Prozentsatz. Des Weiteren werden diese Merkmale auch oft erst durch äußere Einflüsse gebildet.

Trotz dieser hohen Übereinstimmung, gibt es in jeder DNA einen für das Individuum spezifischen Bereich. Es kann vorkommen, dass drei benachbarte Basen keine Aminosäure codieren. Diese uncodierten Bereiche werden Intronregionen genannt. Auf diese Regionen hat es auch das Fingerprinting abgesehen. Denn was nützt es wenn man den riesigen identischen Bereich der DNA vergleicht ?? Die genaue Funktion dieser Bereich ist bis heute immer noch nicht geklärt.

6.1.2. Durchführung der Agarose-Gelelektrophorese

Für die Agarose-Gelelektrophorese ist eine bestimmte Apparatur notwendig. Dies hat folgenden Aufbau:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

In einem Gefäß aus Kunststoff befindet sich das Agarose-Gel und ein Elektrodenpuffer. Agarose-Gel ist elektrisch neutral und besteht aus vernetzten Molekülen. Auf der Linken Seite befinden sich vorgefertigte Taschen.

Die durch die PCR zerschnittene DNA wird mit 10 ml Probenpuffer versetzt und gemischt. Der Probenpuffer ist Ethidiumbromid und dient der Verstärkung des Fluoreszenzverhalten unter UV-Anregung. Mittels einer Mikropipette werden nun je 20 ml Proben-DNA in eine der im Gel vorgefertigten Taschen gegeben. Anschießend wird der Deckel des Gefäßes geschlossen.

Am Gefäß befindet sich eine Anode (positiver Pol) und eine Kathode (negativer Pol). Die DNA befindet sich an der Seite, an welcher eine negative Ladung besteht. Nun wird der Strom angeschalten und es fließt ein Strom mit der Spannung von 150 V. Diesen Zustand lässt man 15 min bestehen.

Aufgrund der eigenen negativen Ladung beginnt die Nucleinsäuremoleküle im Gel Richtung Plus-Pol zuwandern. In der PCR wurde die DNA in unterschiedlich große Stücke zerschnitten. Da das Agarose-Gel aus vernetzten Molekülen besteht, wandern kleine Nucleinsäuremoleküle im Gel weiter als größere. Es entstehen sogenannte Banden.

6.2. Auswertung

Nach dem die 15 min abgelaufen sind, wird die Spannungsquelle abgenommen. Das Gel wird aus der Elektrophoresekammer genommen und in einen UV-Lichtkasten gelegt. Der Schutzdeckel des Lichtkastens wird geschlossen und das Licht eingeschaltet. Nun sind durch das fluoreszieren die Banden erkennbar.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Handelt es sich, wie in unserem Fall um einen Vergleich von DNA, kann man nun an Hand der Verteilung der Banden und deren Größe erkennen ob es sich um ein und die selbe DNA-Probe handelt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Dies ist das Bild, welches dabei entsteht. Hier wurde die Elektrophorese gleichzeitig für 3 Überprüfungen gemacht. Jeweils in der oberen Zeile ist die Täter-DNA und in den 3 darunter liegenden Zeilen, die Proben der Verdächtigen. Im Fall A, wie auch in den anderen beiden Fällen, ist zu erkennen, dass jeweils die Probe in der letzten Zeile die größte Ähnlichkeit mit der Täterprobe hat. Diese DNA-Probe gehört somit mit hoher Wahrscheinlichkeit zur Person des Täters.

6.3. Mögliche Anwendungsfehler

Was in dieser Darstellung ebenfalls zu erkennen ist, ist der Fakt, dass die Banden der jeweils 2.ten Verdächtigenprobe nicht so weit gehen, wie bei den anderen. Hier liegt wahrscheinlich ein Anwendungsfehler vor. Die Restriktionsenzyme werden die DNA nur teilweise geschnitten haben. Dies kann passieren wenn in der Enzymlösung zu wenig Enzyme enthalten waren, die Temperatur zu niedrig war oder das Probengefäß zu zeitig aus dem Heizblock genommen worden ist.

Ein Protokoll zur Versuchsablauf des Fingerprintings befindet sich in Anhang 2.

7. Möglichkeiten des Missbrauchs ? – Die Rechtslage

Viele Menschen haben Angst, dass die Ergebnisse der DNA-Analyse in irgendeiner Weise Missbraucht werden können. Diese Angst ist jedoch völlig unbegründet. Mit den zuvor beschriebenen Verfahren lassen sich weder Rückschlüsse auf Charakter noch auf Aussehen schließen. Aller Höchstens kann man mögliche Verwandtschaften erkennen. Die einzige Möglichkeit des Missbrauchs die besteht, ist eine Gendatenbank. Hier werden zusätzlich zu den Ergebnissen der DNA-Analyse noch persönliche Daten gespeichert.

Wie sieht die Rechtslage in Deutschland zum Thema „DNA-Analyse“ aus ?

Die Gen-Analyse ist eine relativ neue Technik. Somit befand sich diese zunächst im rechtsfreien Raum. Gesetze dazu musste erst erarbeitet werden. Im Oktober 1988 wurde nach einer Anhörung durch den Deutschen Bundestag zum Thema „Genomanalyse im Strafrecht“ die DNA-Analyse, welche ohne rechtliche Grundlage durchgeführt wurde, für unzulässig erklärt. Im Dezember des selben Jahres wurde erstmals ein Beschuldigter vor Gericht durch eine DNA-Analyse überführt. Nachdem die Entscheidungen der Gerichte sehr unterschiedlich ausgefallen waren, fällte der Bundesgerichtshof im September 1990 ein Grundsatzurteil: „Die DNA-Analyse ist zur Aufklärung schwerer Verbrechen als Beweismittel zulässig. Die Gen-Analyse ist jedoch nur dann gerechtfertigt, wenn keine Informationen über genetische Eigenheiten des Angeklagten gewonnen werden.“ Was jedoch unter „schwerer Verbrechen“ zu verstehen war, wurde nicht weiter definiert und ließ so einen recht großen Spielraum. 1992 wurde beschlossen, dass die DNA-Analyse vor Gericht nicht als ausschließliches Beweismittel gelten darf. Im März 1997, regelt ein neues Gesetz, das Genproben nur im laufenden Verfahren entnommen werden dürfen. Im Juni 1997 verabschiedet die EU ein Gesetz, nachdem alle Mitgliedstaaten zur Einrichtung einer nationale Datenbank aufgerufen werden. In einem weiteren Gesetz von 1998, welche ’99 und 2000 nochmals modifiziert wurde, wird die Speicherung, Verarbeitung und Nutzung der gewonnen DNA vor legal erklärt.

8. Nachwort

Im Großen und Ganzen fand ich die Exkursion sehr gut. Wir erhielten, wenn auch nur einen kleinen, Überblick über die Möglichkeiten der Genetik. Dadurch wurde mein Interesse an diesem Gebiet der Biologie, wie auch der Medizin, noch mehr verstärkt. Der im Unterricht doch oftmals recht trockene Stoff, wurde hier erstmals lebendig.

Sehr gut fand ich auch, dass die einzelnen Experimentschritte genauestens erklärt wurden. Somit verstand man auch welche Prozesse abliefen, wenn man einen bestimmten Schritt des Experiments durchführte.

Der einzige Punkt der zu bemängeln war, ist, dass Zeitweise viele Sachen wiederholt wurden, die vorher schon im Unterricht behandelt wurden. Jedoch bekam man somit die Möglichkeit den Stoff zu verinnerlichen.

Glossar

Alle hier erklärten Begriffe sind im Text kursiv geschrieben und mit einem * versehen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Anhang 1

Isolierung von DNA aus der Mundschleimhaut

Entnahme und Lysis der Zellen

1. Mit einem sterilen Tupfer Zellen der Mundschleimhaut entnehmen. Dazu mit rollender Bewegung den Tupfer kräftig entlang der Mundhöhle führen.

2. Tupfer in das mit Lysispuffer gefüllte Reaktionsgefäß stecken und darin 5 min stehen lassen.

3. Tupfer aus dem Reaktionsgefäß nehmen. Die im Tupfer enthaltene Flüssigkeit an der Gefäßinnenwand ausdrücken und Tupfer in das Abfallgefäß werfen

Bindung der DNA am Trägermaterial

4. 200 ml Bindungspuffer und 10 ml Trägermaterial in das Reaktionsgefäß mit der gewonnenen Zellprobe geben und den Inhalt vermischen.

Beladen des Zentrifugationsfilters

5. Gesamten Probeninhalt mittels Pipette auf den eingesetzte Zentrifugationsfilter überführen. Probe für 2 min bei Raum Temperatur stehen lassen.

6. Reaktionsgefäß verschließen und für 6 min bei 12.000 U/min zentrifugieren.

7. Die Flüssigkeit (Filtrat) im unteren Gefäßteil in das Abfallgefäß ausgießen.

Waschen des Zentrifugationsfilters

8. Den Zentrifugationsfilter wieder in das bereits verwendete Reaktionsgefäß einsetzen und 550ml Waschpuffer auf den Filtergeben. Reaktionsgefäß verschließen und für 1 min bei 12.000 U/min zentrifugieren.

9. Vorgang 7 und 8 wiederholen

10. Vorgang 7 wiederholen

11. Zentrifugationsfilter einsetzen und verschlossenes Reaktionsgefäß für 1 min bei 12.000 U/min zentrifugieren.

Ablösen der DNA vom Trägermaterial

12. Zentrifugationsfilter in ein neues Reaktionsgefäß einsetzen. Direkt auf die Filtermembran 50 ml des auf 70°C vorgewärmten Elutionspuffer geben. Für 5 min bei Raumtemperatur stehen lassen. Zentrifugation für 2 min bei 10.000 U/min.

Anhang 2

Simulation der forensischen DNA-Analyse

A) Restriktionsspaltung

1. Mit der Mikropipette je 6 ml Enzymlösung und 8 ml Restriktionspuffer in die mit der Verdächtigen-DNA bzw. Täter-DNA geben.
2. Reaktionskomponenten durch kurzes Andrücken der verschlossenen Reaktionsgefäße an die rotierende Gummischeibe des Vortexers vermischen. Konzentrieren des Inhalts auf dem Gefäßboden durch kurzes Zentrifugieren.
3. Reaktionsgefäß in einen Heizblock stellen und bei 37° C 30 min bebrüten

B) Agarose-Gelelektrophorese

1. Reaktionsgefäß aus dem Heizblock nehmen und in den Mikrogefäß-Ständer stellen.
2. 4 ml Probenpuffer in jedes Reaktionsgefäß überführen Zum Mischen der Komponenten Schritt A3 wiederholen.
3. Inhalt eines jeden Reaktionsgefäßes mittels einer Mikropipette (20 ml) in jeweils eine separate Tasche des vorbereiteten Agarose-Gels überführen. VORSICHT !!! Den direkten Hautkontakt mit dem Agarose-Gel unbedingt vermeiden !!!
4. Prüfen, ob das Agarose-Gel vorschriftsmäßig in der Elektrophorese-Kammer ausgerichtet ist und mit Elektrodenpuffer bedeckt wird.
5. Deckel der Kammer schließen und die Kabel mit dem Stromversorgungsgerät verbinden.
6. Spannungsquelle anschalten und das Gel bei 150 V für 15 min laufen lassen.
7. Das Gel aus der Elektrophorese-Kammer nehmen und den UV-Lichtkasten legen.
8. Schutzdeckel des Lichtkastens schließen und UV-Lampe anschalten. Muster der violett fluoreszierenden DNA-Fragente in den einzelnen Banden vergleichen und nach möglichen Übereinstimmungen suchen. Gel fotografieren, falls eine Fotoeinrichtung vorhanden ist.

Quellenangabe

Bücher:

- Hennig Genetik, 3. Auflage, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2002
- Das populäre Lexikon der Gentechnik, Thilo Spahl und Thomas Deichmann, Eichborn Verlag , 2001
- Medizinische Biochemie, S.M. Rapoport, VEB Verlag Vol und Gesundheit Berlin, 1987
- Genetik – Materialien für den Sekundarbereich II . Biologie, Lutz Hafner und Peter Hoff, Schroedel Schulbuchverlag, 1995

Internet:

- http://www.glaesernes-labor.de
- http://www.discovery-channel.de/de/pub/specials/verbrecherwoche/dna_analyse.htm
- http://www.quarks.de/taeter/03.htm
- http://www.uni-duesseldorf.de/MathNat/Biologie/Didaktik/dna/dna.pdf
- http://fachberatung-biologie.de/Themen/molgenetik/seitenprotbio/dnameth3gel.htm
- http://www.dradio.de/cgi-bin/es/neu-forschak/27184.html
- http://www.benecke.com/gloeggler.html
- http://www.benecke.com/tobias.pdf
- http://www.zum.de/Faecher/Materialien/hupfeld/index.htm?/Faecher/Materialien/hupfeld/methoden/restr-ez/Restr-ez.html
- http://www.dhgp.de/deutsch/intro/strategies/methoden01.html

Sonstiges:

- Mitschriften aus dem Unterricht
- Protokolle zur Versuchsdurchführung aus dem Gläsernen Labor
- 2002 Bibliographisches Institut & F. A. Brockhaus AG

Wörter: 4007