Die Glutaminsynthetase in Brassica napus I. Eine Untersuchung der Verteilung


Praktikumsbericht / -arbeit, 2020

14 Seiten, Note: 1,3


Leseprobe

Inhaltsverzeichnis:

Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung
1.1 Fragestellung
1.2 Brassica napus
1.3 Glutamin-Synthetase
1.4 Desoxyribonukleinsäuren in Pflanzen
1.5 Ribonukleinsäuren in Pflanzen

2 Material und Methoden

3 Ergebnisse

4 Diskussion
4.1 DNA und RNA im Vergleich
4.2 Restriktionserfolg
4.3 Verteilung der GS in verschiedenen Geweben
4.4 Fehlerdiskussion

5 Zusammenfassung

6 Literaturverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1 Einleitung

1.1 Fragestellung

Die Durchgeführten Versuche beschäftigen sich mit der Frage, wie die Verteilung plastidärer und cytosolischer Glutamin-Synthetase in verschiedenen Geweben des Kreuzblütlers Brassica napus ist. Insbesondere wird dabei die semiquantitative Verteilung von DNA und RNA untersucht. Dabei wäre hypothetisch ein erhöhter Anteil plastidärer Glutamin- Synthetase in photosynthetisch aktiven Geweben zu erwarten.

1.2 Brassica napus

Der Raps Brassica napus ist eine Pflanze aus der Familie der Kreuzblütengewächse (Brassicaceae). Er ist ein Hybrid aus Gemüsekohl und Rübsen, der vom Menschen hauptsächlich als Nutzpflanze verwendet wird. Das Öl der Samen wird unter anderem für Biodiesel und zu Speisezwecken genutzt. Außerdem sind die bei der Ölherstellung anfallenden Abfälle auch als Tierfutter nutzbar. Aufgrund seines raschen Wachstums und des geringen Kultivierungsaufwandes ist B. napus gut als Modellorganismus und Versuchsobjekt geeignet (siehe Sauer et al., 1983).

1.3 Glutamin-Synthetase

Die Glutamin-Synthetase (GS) ist ein Enzym, dass der Übertragung von Ammonium (NH4+) auf Glutamat dient. Dabei entsteht Glutamin. Glutamat und Glutamin sind Aminosäuren und damit ein grundlegender Bestandteil aller Lebewesen. Daher ist die GS ein sehr weit verbreitetes Enzym, das in drei Klassen vorkommt. Die in Brassica napus zu findende Klasse besteht aus zehn identischen Untereinheiten, mit einer Masse von jeweils 42-44 Kilodalton und kommt hauptsächlich in Photosynthetisch aktiven Pflanzenteilen vor. Es gibt dabei zwei Isoformen der GS. Die cytosolische (CYGS), die hauptsächlich in den Wurzeln zu finden ist und die plastidäre (PLGS), die sich hauptsächlich in grünen Geweben findet. In Pflanzen dient die GS der Assimilation von toxischem Ammoniumstickstoff. Über den GS/GOGAT-Zyklus (Glutamin-Synthetase/Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferase) wird unter ATP-Verbrauch Ammonium auf Glutamat übertragen (s. Abb. 1). Anschließend wird eine Aminogruppe des dadurch entstandenen Glutamins auf 2-Oxoglutarat übertragen, wodurch wieder Glutamat entsteht (s. Shapiro und Stadtman, 1970).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Der GS/GOGAT-Zyklus

Assimilation von Stickstoff unter ATP und NADPH Verbrauch (aus Harper et al., 2010).

1.4 Desoxyribonukleinsäuren in Pflanzen

Desoxyribonukleinsäuren (DNA) sind Moleküle, die genetische Information von Lebewesen speichern. Sie kommen in Pflanzen im Zellkern (Kern-DNA), in den Mitochondrien (mt-DNA) und in den Plastiden (ct-DNA) vor. Die Kern-DNA ist als Chromatin im Zellkern verpackt und macht den größten Teil der pflanzlichen DNA aus. Die Menge dieser DNA kann bereits zwischen verschiedenen Arten deutlich variieren, obwohl sich deren Komplexität nicht zwingend unterscheidet. Häufig sind die Gründe dafür ein abweichender Ploidiegrad, oder viele repetitive Sequenzen, die nicht proteincodierend sind. Auch die Menge an mt-DNA in Pflanzenzellen kann artspezifisch stark variieren, obwohl diese in jedem Fall nur wenige verschiedene Proteine codiert. Ihr Anteil an der gesamten DNA-Menge liegt zumeist unter 1%. Die ct-DNA unterscheidet sich in ihrem Aufbau grundlegend von den anderen genannten DNA­Spezies, da sie in ringförmigen, statt linearen Molekülen vorliegt. Die Vernetzung mit der übrigen pflanzlichen DNA ist, trotz ihres geringen Gesamtanteils von nur etwa 1%, relativ hoch (s. MacCammon und Harvey 1989).

1.5 Ribonukleinsäuren in Pflanzen

Ribonukleinsäuren (RNA) sind Moleküle, die in Pflanzen im Wesentlichen zur Umsetzung von genetischer Information in Proteine dienen. Dabei ist zwischen ribosomaler RNA (rRNA), transfer-RNA (tRNA), messenger-RNA (mRNA) und micro-RNA (miRNA) zu unterscheiden. Es gibt jedoch noch viele weitere RNA-Spezies. Den Großteil der gesamt-RNA in Pflanzen stellt die rRNA mit etwa 90%, da sie die Hauptkomponente der in jeder Zelle vorkommenden Ribosomen ist. Diese bestehen aus diversen Untereinheiten, die nach ihrem Sedimentationskoeffizienten S benannt sind. Die tRNA hat einen geringen Anteil von höchstens 15% und die sehr zahlreichen Vertreter der mRNA sind nur zu maximal 5% enthalten (s. Brosius und Tiedge 2004).

2 Material und Methoden

Das verwendete Pflanzenmaterial wurde durch Flüssigstickstoff aufgeschlossen. Die anschließende Extraktion der RNA erfolgte mittels Phenol/Chloroform-Extraktion, Isopropanolfällung und Cäsiumchlorid (CsCl)-Ultrazentrifugation. Die Extraktion der DNA erfolgte mittels Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung. Zur Quantifizierung wurde die Photometrie genutzt. Der Amplifikation der DNA diente eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR), für die RNA wurde eine Reverse- Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) genutzt. Die Auftrennung wurde mit einer nichtdenaturierenden Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt, die anschließende Färbung mit Ethidiumbromid. Detaillierte Beschreibungen der angewandten Methoden und des Versuchsablaufes sind im Praktikumsskript zu finden.

Davon abweichend wurde das Beladungsmuster bei der Gelelektrophorese der (RT-)PCR- Produkte leicht verändert. Die Taschen vier und fünf enthalten RT-PCR-Produkte aus der Wurzel anstelle der Proben aus den grünen Keimblättern.

3 Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt das mit Ethidiumbromid gefärbte und digital invertierte Gel extrahierter DNA- und RNA-Proben. Es ist aufgeteilt in Proben aus grünen Keimblättern, etiolierten Keimblättern und Wurzeln. Von diesen ist jeweils RNA vor und nach der Ultrazentrifugation und DNA zu sehen. Außerdem ist jeweils RNA aus E. coli und DNA aus dem Escherichia-Virus Lambda erkennbar. Alle DNA-Proben weisen lediglich eine Bande im oberen Drittel des Gels auf. Auch bei den nicht ultrazentrifugierten RNA-Proben ist diese Bande schwach vorhanden. Jedoch haben alle RNA-Proben außerdem ein ähnliches Bandenmuster in der unteren Hälfte des Gels. Bei den Proben aus der Wurzel ist dieses etwas weniger differenziert als bei den Keimblättern, die Bande der 16S rRNA ist dort nicht zu sehen. Im Vergleich zur RNA aus E. coli fällt auf, dass die 18S rRNA Bande nur in den Brassica napus Proben vorhanden ist. Weiterhin auffällig ist die fehlende Bande am Ende des Gels bei der Ultrazentrifugierten RNA. Diese ist bei allen anderen RNA-Proben vorhanden.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: Gefärbtes und invertiertes Gel der nichtdenaturierenden Agarose-Gelelektrophorese von Proben aus Brassica napus

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Ende der Leseprobe aus 14 Seiten

Details

Titel
Die Glutaminsynthetase in Brassica napus I. Eine Untersuchung der Verteilung
Hochschule
Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Veranstaltung
Laborpraktikum
Note
1,3
Autor
Jahr
2020
Seiten
14
Katalognummer
V1131611
ISBN (eBook)
9783346498793
Sprache
Deutsch
Schlagworte
Brassica napus, Glutaminsynthetase, Laborprotokoll
Arbeit zitieren
Falk Deegener (Autor:in), 2020, Die Glutaminsynthetase in Brassica napus I. Eine Untersuchung der Verteilung, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/1131611

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