Die Arbeit befasst sich mit der Entwicklung neuer Bindemoleküle an Rikenella microfusus zur Diagnostik Alzheimer relevanter Dysbiosen im menschlichen Darm. Diese spezifischen Bindemoleküle sind einzelsträngige DNA Aptamere, die mittels der FluCell-SELEX Methode evolvieren, um spezifisch an Rikenella microfusus zu binden. Der Einsatz von Aptameren bietet als relativ neue Stoffklasse unbegrenztes Potential in der Forschung, insbesondere wegen der günstigen Herstellungskosten bei großen Mengen. Die bei einer Dysbiose erhöhte Häufigkeit an Bacteroidetes, wie etwa Rikenella microfusus, ermöglicht die Diagnose von Alzheimer mittels der FluCell-SELEX.
Diese Arbeit kann als Vorlage und Motivation dienen, um zukünftige bindungsspezifische ssDNA Aptamere gegen Rikenella microfusus weiterzuentwickeln und um geeignete spezifische Biomarker zu identifizieren. Ebenso könnte diese neue diagnostische Methode der Alzheimer Erkrankung die bereits verwendeten Diagnosemethoden, wie Amyloid-spezifische Marker, Blutanalysen, Liquoruntersuchungen oder psychometrische Tests in der diagnostischen Sicherheit unterstützen.
Diese Arbeit ist eine Fortsetzung zu einer vorausgehenden Arbeit über die Evolution von Aptameren gegen Rikenella microfusus.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1 Die Alzheimer-Erkrankung und das Darmmikrobiom
1.2 Die SELEX-Methode
1.3 Die Zielzelle
2. Ziel der Arbeit
3. Materialien
4. Methoden
4.1 Herstellung eines 2% Agarosegels und Gelelektrophorese
4.1.1 Theorie
4.1.2 Durchführung
4.2 Vorbereitung und Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion
4.2.1 Theorie
4.2.2 Durchführung der Polymerasekettenreaktion (PCR)
4.2.3 Durchführung der Emulsions-Polymerasekettenreaktion
4.3 Vorbereitung und Durchführung der Strangtrennung
4.3.1 Theorie
4.3.2 Durchführung
4.4 Bestimmung der Stoffmenge von ssDNA Aptamere
4.4.1 Theorie
4.4.2 Durchführung
4.5 FluCell-SELEX der ssDNA Aptamere
4.5.1 Theorie
4.5.2 Durchführung
4.6 Fluoreszenzmessung
4.6.1 Theorie
4.6.2 Durchführung
4.7 Bindungsassay von Aptamere gegen Rikenella microfusus
4.7.1 Theorie
4.7.2 Durchführung
4.8 Spezifitätstest
4.8.1 Theorie
4.8.2 Durchführung
5. Ergebnisse
5.1 exemplarische Aufnahme des Agarosegels mit ssDNA Aptamere
5.2 Bindungsassay
5.3 Spezifitätstest
6. Diskussion
6.1 Bindungsassay
6.2 Spezifitätstest
6.3 Ausblick
Zielsetzung & Themen
Diese Bachelorarbeit zielt darauf ab, spezifische ssDNA-Aptamere zu entwickeln, die als Bindemoleküle an das Bakterium Rikenella microfusus dienen, um neue Ansätze für die Alzheimer-Diagnostik zu schaffen.
- Entwicklung und Evolution von DNA-Aptameren mittels FluCell-SELEX.
- Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Darmmikrobiom-Dysbiose und Alzheimer.
- Durchführung von Bindungsassays und Spezifitätstests zur Charakterisierung der Aptamere.
- Etablierung methodischer Abläufe wie PCR, Strangtrennung und Fluoreszenzmessung.
- Validierung der Bindungsspezifität gegenüber Ziel- und Kontrollbakterien.
Auszug aus dem Buch
1.2 Die SELEX-Methode
In den letzten zwei Jahrzehnten wurden Nukleinsäure-Aptamere zur Bindung an einer Vielzahl von spezifischen Molekülen und komplexen Systemen wie lebenden Zellen entwickelt [15]. Aptamere sind kurze, einzelsträngige Nukleinsäuren, bestehend aus Ribonukleinsäure (RNA) oder Desoxyribonukleinsäure (DNA) mit bis zu 100 Nukleotiden. Dabei besitzen sie eine dreidimensionale Struktur, z.B. eine Hairpin oder eine Loop-Struktur, die es ihnen ermöglicht spezifisch an bestimmte Zielstrukturen zu binden [16]. An der Ausbildung dieser Bindungen tragen Wasserstoffbrücken und van-der-Waals-Bindungen zu einem erheblichen Beitrag dazu bei. Ebenso führen spezielle strukturelle Voraussetzungen, wie z.B. Guanidiniumgruppen von Argininseitenketten in der Proteinzielstruktur zu spezifischen Bindungen [17]. Die Methode zur Isolierung zielspezifischer Aptamere wird als “systematic evolution of ligands by exponential enrichment” (SELEX) bezeichnet [16]. Die Verwendung ganzer lebender Zellen als Ziel für SELEX-Experimente, der sogenannte Cell-SELEX Prozess, ist eine vielversprechende Methode zur Erzeugung zellrezeptorspezifischer Aptamere, die ein großes Potential in den Bereichen Diagnostik, Therapie, regenerative Medizin und Zielvalidierung besitzen [18]. Zu Beginn des Cell-SELEX liegt eine randomisierte Bibliothek an Oligonukleotiden mit bekannten flankierten Regionen vor. Diese zufällige Bibliothek mit Aptameren wird mit dem Ziel inkubiert. Aptamere mit einer zielspezifischen dreidimensionalen Konformation binden an die Zielzelle und ungebundene Sequenzen werden durch mehrere Waschschritte entfernt [16]. Gebundene Aptamere werden von der Zielstruktur durch Erhitzung des Zell-DNA Aptamerkomplexes bei 95 °C und anschließender Zentrifugation gelöst [15]. Die erhaltenen Aptamere werden amplifiziert mit der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) unter Benutzung von Primern, welche komplementär zu den flankierenden konstanten Regionen der Aptamere sind [16].
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Diese Einleitung beleuchtet die Relevanz der Alzheimer-Erkrankung im Kontext des Darmmikrobioms und erläutert die Grundlagen der SELEX-Methode sowie die Relevanz der Zielzelle.
2. Ziel der Arbeit: Das Kapitel beschreibt die Zielsetzung, spezifische Bindemoleküle (Aptamere) an Rikenella microfusus zur Entwicklung zukünftiger Diagnosemethoden für Alzheimer zu evolvieren.
3. Materialien: Eine detaillierte Auflistung der verwendeten Chemikalien, Verbrauchsmaterialien, Laborgeräte und Bakterienstämme für die experimentellen Arbeiten.
4. Methoden: Beschreibt die wissenschaftlichen Protokolle für Agarosegelelektrophorese, PCR, Strangtrennung, Quantifizierung der Aptamere, den FluCell-SELEX-Prozess, Fluoreszenzmessungen sowie die Bindungs- und Spezifitätstests.
5. Ergebnisse: Präsentation der experimentellen Daten, einschließlich der Gelelektrophorese-Aufnahmen und der statistischen Auswertungen der Bindungs- und Spezifitätstests mittels Fluoreszenzmessung.
6. Diskussion: Interpretation der erzielten Ergebnisse hinsichtlich der Aptamer-Bindungsspezifität sowie ein Ausblick auf zukünftige Potenziale und Anwendungsmöglichkeiten in der Diagnostik.
Schlüsselwörter
Alzheimer, Darmmikrobiom, Rikenella microfusus, Aptamere, SELEX, FluCell-SELEX, DNA, Bindungsassay, Spezifitätstest, Diagnostik, PCR, Fluoreszenzmessung, Dysbiose, Bindungsaffinität, Laboranalytik
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit befasst sich mit der Entwicklung von ssDNA-Aptameren, die spezifisch an das Darmbakterium Rikenella microfusus binden, um dieses als Marker für die Alzheimer-Diagnostik nutzbar zu machen.
Welches sind die zentralen Themenfelder der Publikation?
Die zentralen Themen sind die Alzheimer-Forschung, die Rolle des Darmmikrobioms, die SELEX-Technologie (insbesondere Cell-SELEX) und die molekularbiologische Detektion von Bakterien.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Das primäre Ziel ist die Entwicklung und Evolution von Bindemolekülen an Rikenella microfusus, um die bei Alzheimer-Patienten gehäuft auftretende Dysbiose spezifisch detektierbar zu machen.
Welche wissenschaftliche Methode wird zur Aptamer-Entwicklung verwendet?
Die Arbeit nutzt die FluCell-SELEX-Methode, ein Verfahren zur gerichteten Evolution von Aptameren gegen lebende Zellen.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil umfasst die detaillierte methodische Durchführung, beginnend bei der Vorbereitung, über die Selektionsrunden, bis hin zu den Bindungs- und Spezifitätstests zur Verifizierung der Aptamer-Qualität.
Welche Schlüsselbegriffe charakterisieren die Arbeit?
Wichtige Begriffe sind Aptamere, Alzheimer, Darmmikrobiom, SELEX, Rikenella microfusus und Bindungsspezifität.
Warum wird speziell Rikenella microfusus als Ziel gewählt?
Das Bakterium wurde gewählt, da eine Dysbiose mit einer erhöhten Häufigkeit dieser Spezies bei Alzheimer-Patienten assoziiert ist, was es zu einem relevanten diagnostischen Ziel macht.
Welche Rolle spielt die Fluoreszenzmessung?
Die Fluoreszenzmessung dient dazu, die Bindungsstärke und Spezifität der generierten Aptamer-Bibliothek quantitativ zu erfassen und den Erfolg der Selektionsrunden zu belegen.
Was zeigt der Ausblick auf?
Der Ausblick unterstreicht das Potenzial von Aptameren als neue diagnostische Klasse und schlägt vor, die entwickelten Aptamere zur Analyse von Stuhlproben bei Alzheimer-Patienten einzusetzen.
- Arbeit zitieren
- Nico Sachse (Autor:in), 2021, Rikenella microfusus, ein Alzheimer relevantes Darmbakterium als Target zur Entwicklung spezifischer Aptamere für die Diagnostik, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/1133536
