Je 73 Hashimoto-Tyreoiditis(HT)-Patienten und Kontrollprobanden wurden auf das CD45-Expressionsmuster (EM) der Leukozyten und auf das Vorhandensein der C>G Transversion getestet. Zudem wurde die Phagozytoseaktivität von 41 HT- und 42 Kontrollprobanden ermittelt.
Ein variantes CD45RA wurde in beiden Kollektiven je einmal beobachtet. Die molekulargenetischen Untersuchungen bestätigten die Transversion an Position 77 des Exon A bei beiden Trägern des veränderten CD45RA-Musters. Das CD45RA-EM zeigte bei den Personen mit der Transversion im Vergleich zu den Individuen mit dem klassischen CD45RA-Muster folgende Veränderungen: Erhöhte Lymphozytenzahl mit CD45ROΘ/RA+- und CD45RC+-Markierung, sowie in beiden Leukozytenpopulationen gesteigerte Zahl CD45RO+/RA+ - und erniedrigte Mengen CD45RO+/RAΘ-Zellen. Im Vergleich der HT- mit den Kontrollprobanden unter Ausschluss der gefundenen Punktmutationsträger ergaben sich signifikante Differenzen bzgl. der gesteigerten CD45RA- und CD45RC-Expression auf Lymphozyten, der reduzierten CD45RO+- und CD45RO+/RAΘ-Lymphozytenzahl und einer gesenkten CD45RB-Expression auf Granulozyten im Kontrollkollektiv. Im Granulozytenfunktionstest wurde ein Transversionsträger den restlichen Kontroll- und HT-Probanden gegenübergestellt. Diese zeigte eine erhöhte Phagozytoseaktivität an den ersten beiden Messpunkten im Vergleich mit den beiden anderen Personengruppen. Zudem war hier eine signifikante Reduktion der Granulozytenaktivität im Patientenkollektiv zu erkennen. Im weiteren Untersuchungsverlauf nährten sich die Aktivitäten der Granulozyten in den Kollektiven an.
Eine Assoziation zwischen der CG-Transversion und der HT besteht nicht. Die gefundenen Differenzen in der CD45RO- und CD45RA-Expression lassen sich sowohl durch die Transversion als auch durch die ständig ablaufende Immunreaktion bei HT-Patienten erklären. Die veränderte Phagozytoseaktivität zwischen den Kollektiven lässt einen Einfluss der CD45-Isoformen auf diese Zellfunktion vermuten.
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung
2 Einleitung
2.1 Autoimmunthyreoiditis Typ Hashimoto
2.1.1 Epidemiologie
2.1.2 Klinik
2.1.3 Diagnostik
2.1.4 Prognose
2.1.5 Therapie
2.1.6 Ätiologie und Pathogenese
2.2 CD45-Molekül
2.2.1 Aufbau
2.2.2 Funktion
2.2.3 Regulation des CD45
2.2.4 Alternatives Spleißen und genetische Polymorphismen
2.2.5 Bindung der CD45R-AK
2.2.6 CD45 und Autoimmunerkrankungen
3 Fragestellung und Ziele
4 Material
4.1 Probanden
4.1.1 Patientenkollektiv
4.1.2 Kontrollkollektiv
4.2 Materialien
4.2.1 Antikörper
4.2.2 weitere Chemikalien
4.2.3 Verbrauchsmaterialien
4.2.4 Geräte
4.2.5 Software
5 Experimentelle Methoden
5.1 Herstellung von Lösungen
5.1.1 Herstellung von PBS
5.1.2 Herstellung der Lyselösung
5.2 Durchflusszytometrische Analytik
5.2.1 Grundlagen der Durchflusszytometrie
5.2.2 Einstellungen des Durchflusszytometers
5.2.3 Anfärbung der CD45-AG von Leukozyten mit CD45-mAK
5.2.4 Isotypkontrollen für die verwendeten CD45-AK
5.2.5 Bestimmung der Phagozytoseaktivität von Granulozyten
5.3 DNA-Analytik
5.3.1 Präparation der DNA aus Vollblut
5.3.2 Nachweis der CG Punktmutation an Position 77 des Exon A des CD45-Gens
6 Statistische Methoden
6.1 Statistik – CD45R-Expressionsmuster
6.2 Statistik – Granulozytenfunktion
6.3 Statistik – Mutationshäufigkeit
7 Ergebnisse
7.1 Altersstruktur und Geschlechtsverhältnis in den Kollektiven
7.2 Durchflusszytometrische Darstellung der Leukozytenpopulationen
7.3 Ergebnisse der Isotypkontrollen
7.4 Grundlagen der CD45RO/RA-Expression auf Lymphozyten und Granulozyten
7.4.1 Charakterisierung eines varianten CD45RA-Expressionsmusters in der Lymphozytenpopulation
7.4.2 Charakterisierung eines varianten CD45RA-Expressionsmusters in der Granulozytenpopulation
7.5 Verteilung des klassischen und varianten CD45RA-Expressionsmusters in den Kollektiven
7.6 Molekulargenetische Resultate
7.6.1 Nachweis des PCR-Produktes für Exon A des CD45-Gens
7.6.2 Nachweis der gesuchten Punktmutation durch RFLP-Analyse
7.6.3 Gegenüberstellung der Allelfrequenzen
7.7 Vergleich der klassischen mit den varianten CD45RA-Expressionsmustern
7.7.1 CD45RO- und CD45RA-Expression auf Lymphozyten
7.7.2 CD45RB- und CD45RC-Expression auf Lymphozyten
7.7.3 CD45RO- und CD45RA-Expression auf Granulozyten
7.7.4 CD45RB- und CD45RC-Expression auf Granulozyten
7.8 Vergleich des Patienten- und Kontrollkollektivs unter Ausschluss der Träger des C77G-Polymorphismus
7.8.1 CD45RO- und CD45RA-Expression auf Lymphozyten
7.8.2 CD45RB- und CD45RC-Expression auf Lymphozyten
7.8.3 CD45RO- und CD45RA-Expression auf Granulozyten
7.8.4 CD45RB- und CD45RC-Expression auf Granulozyten
7.9 Darstellung der Phagozytoseaktivität der Granulozyten
8 Diskussion
8.1 Allelfrequenz
8.2 Diskussion der Ergebnisse zwischen Personen mit varianten und normalen CD45RA-Expressionsmustern
8.2.1 CD45R-Expression auf Lymphozyten
8.2.2 CD45R-Expression auf Granulozyten
8.3 Diskussion der Ergebnisse zwischen Patienten- und Kontrollkollektiv unter Ausschluss der Träger des C77G-Polymorphismus
8.3.1 CD45R-Expression auf Lymphozyten
8.3.2 CD45R-Expression auf Granulozyten
8.4 Granulozytenfunktionstest
9 Schlussfolgerungen
Zielsetzung und thematische Schwerpunkte
Die vorliegende Arbeit untersucht die mögliche Assoziation des C77G-Polymorphismus im CD45-Gen mit der Hashimoto-Thyreoiditis (HT) sowie den Einfluss dieser genetischen Veränderung und der CD45-Isoform-Expression auf die Granulozytenfunktion und die Immunantwort.
- Analyse des CD45R-Expressionsmusters bei Patienten mit Hashimoto-Thyreoiditis im Vergleich zu einem Kontrollkollektiv.
- Untersuchung der Allelfrequenz des C77G-Polymorphismus mittels PCR-RFLP-Analyse.
- Charakterisierung varianten CD45-Expressionsverhaltens auf Lymphozyten und Granulozyten.
- Evaluation der Phagozytoseaktivität von Granulozyten in Abhängigkeit vom CD45-Expressionsstatus.
Auszug aus dem Buch
2.2.3 Regulation des CD45
Für die Regulation der CD45-Phosphataseaktivität werden mehrere Faktoren verantwortlich gemacht. Die Bindung von Liganden, die Interaktion mit anderen Proteinen sowie die Beeinflussung durch spezifische intrazelluläre Inhibitoren, wie NADPH (Fialkow et al. 1997), sind vermutete Einflussfaktoren (Hermiston et al. 2003).
Als mögliche Liganden werden CD22 und Galectin-1 diskutiert (Stamenkovic et al. 1991, Walzel et al. 1999), wobei ihre Bindung unspezifisch an T-Zell-Glykoproteine erfolgt (Pace et al. 1999, Pace et al. 2000, Trowbridge und Thomas 1994). Beweise für die Modulation der Phosphataseaktivität des CD45-Moleküls durch diese Faktoren gibt es bisher jedoch nicht. Weitere, evtl. zufällige Interaktionen des CD45-Moleküls im extrazellulären Bereich mit Thy-1, dem TZR und CD2 (Trowbridge und Thomas 1994) wurden beobachtet.
In anderen Studien wurde die Wechselwirkung von CD100 mit CD45-Isoformen, welche ein oder zwei variable Produkte der Exone A-C enthalten, beobachtet. Diese Verbindung soll Einfluss auf die T-Zelladhäsion haben (Herold et al. 1996). Des Weiteren wird für die Transduktion wachstumsinhibierender Signale in T-Zellen eine Konnektion zu der α-Kette des IFN-Rezeptors verantwortlich gemacht (Petricoin et al. 1997).
Im Bereich der transmembranen Domäne kommt das Membranprotein LPAP als Interaktionspartner in Frage (Cahir McFarland und Thomas 1995, Kitamura et al. 1995). Es scheint bevorzugt mit CD45-Monomeren zu kommunizieren (Xu und Weiss 2002). Da es widersprüchliche Ergebnisse bzgl. der Beeinflussung des CD45-Moleküls gibt, bleibt es abzuwarten, ob LPAP eine CD45-regulierende Komponente besitzt.
Zusammenfassung der Kapitel
1 Zusammenfassung: Gibt einen Überblick über den Hintergrund, die Fragestellungen, die angewandten Methoden sowie die Ergebnisse und Schlussfolgerungen der Arbeit.
2 Einleitung: Erläutert das Krankheitsbild der Hashimoto-Thyreoiditis, die physiologischen und pathologischen Grundlagen des CD45-Moleküls sowie die Bedeutung von dessen Isoformen und Polymorphismen.
3 Fragestellung und Ziele: Definiert die Forschungsfragen hinsichtlich der Assoziation des C77G-Polymorphismus zur Hashimoto-Thyreoiditis und des Einflusses der CD45R-Expression auf die Granulozytenfunktion.
4 Material: Beschreibt das untersuchte Patienten- und Kontrollkollektiv sowie die verwendeten biologischen Materialien, Antikörper, Chemikalien und technischen Geräte.
5 Experimentelle Methoden: Detailliert die Vorgehensweise bei der Probenaufbereitung, der durchflusszytometrischen Analyse und der molekulargenetischen DNA-Analytik.
6 Statistische Methoden: Erklärt die angewandten statistischen Verfahren zur Signifikanzprüfung der Ergebnisse, einschließlich Normalverteilungstests und Gruppenvergleiche.
7 Ergebnisse: Präsentiert die erhobenen Daten zu Alter, Geschlecht, CD45-Expressionsmustern, Mutationshäufigkeit und der Phagozytoseaktivität der Granulozyten.
8 Diskussion: Interpretierte die Ergebnisse im Kontext aktueller wissenschaftlicher Erkenntnisse und erörtert die Bedeutung der Befunde für die Ätiologie und Pathogenese der Hashimoto-Thyreoiditis.
9 Schlussfolgerungen: Fasst die wesentlichen Erkenntnisse zusammen und bewertet das Potenzial von CD45-Isoformen als diagnostische oder therapeutische Angriffspunkte.
Schlüsselwörter
Hashimoto-Thyreoiditis, CD45, C77G-Polymorphismus, Autoimmunthyreoiditis, Phagozytose, Durchflusszytometrie, Granulozyten, Lymphozyten, Spleißen, Isoformen, T-Zellen, Immunantwort, Genexpression, Punktmutation, RFLP-Analyse.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser wissenschaftlichen Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit untersucht die Rolle des CD45-Moleküls, speziell die Auswirkungen einer bestimmten Punktmutation (C77G) und der verschiedenen CD45-Isoformen, bei der Hashimoto-Thyreoiditis.
Welches sind die zentralen Themenfelder der Studie?
Die Schwerpunkte liegen auf der Immunologie der Schilddrüse, der molekulargenetischen Analyse von CD45-Polymorphismen und der funktionellen Untersuchung von Leukozyten, insbesondere der Granulozytenphagozytose.
Was ist das primäre Ziel oder die zentrale Forschungsfrage?
Das Ziel ist zu klären, ob eine Assoziation zwischen dem C77G-Polymorphismus und der Hashimoto-Thyreoiditis besteht und wie sich unterschiedliche CD45-Expressionsmuster auf die Funktion der Granulozyten auswirken.
Welche wissenschaftlichen Methoden wurden verwendet?
Zum Einsatz kamen unter anderem die durchflusszytometrische Analyse (FACS) zur Bestimmung der CD45-Expression, die PCR-RFLP-Analyse zum genetischen Nachweis der Mutation und der Phagotest zur Messung der Granulozytenfunktion.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in die Darstellung der experimentellen Methoden, die statistische Auswertung und die detaillierte Präsentation der Ergebnisse zu den Patienten- und Kontrollgruppen.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Untersuchung am besten?
Hashimoto-Thyreoiditis, CD45, C77G-Polymorphismus, Phagozytose, Durchflusszytometrie und Autoimmunität sind die zentralen Begriffe.
Gibt es einen Zusammenhang zwischen dem C77G-Polymorphismus und der Hashimoto-Thyreoiditis?
Nein, die vorliegende Studie konnte keine signifikante Assoziation zwischen diesem Polymorphismus und dem Auftreten der Hashimoto-Thyreoiditis feststellen.
Wie beeinflusst die Mutation die Phagozytoseaktivität der Granulozyten?
Die Untersuchung deutet darauf hin, dass die Mutation und die damit verbundene veränderte CD45-Expression mit einer veränderten, in vitro teils erhöhten Phagozytoseaktivität einhergehen können.
- Quote paper
- Dr.med. Sina Weißenborn (Author), 2009, Analyse der Granulozytenfunktion und des CD45R-Expressionsmusters sowie Frequenzbestimmung einer definierten CD45-Punktmutation bei Patienten mit Autoimmunthyreoiditis vom Typ Hashimoto, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/128462
