Ramantitrationskurven in Bezug zum Bohr-Effekt des monomeren Hämoglobins CTT III

Diplomarbeit
dem Fachbereich Physik/Elektrotechnik der Universität Bremen

Ramantitrationskurven in Bezug zum Bohr-Effekt des monomeren Hämoglobins CTT III

vorgelegt von Walter Jentzen
1989

Inhalt

1 Einleitung und Problemstellung ... 1

2 Eigenschaften der Hämoglobine CTT III und CTT IV ... 4
2.1 Grundlagen ... 4
2.1.1 Hämoglobinmolekül und Allosterie ... 4
2.1.2 Sauerstoffbindungskurve ... 6
2.1.3 Bohr-Effekt ... 8
2.1.4 Ratenkonstanten ... 10
2.2 Eigenschaften der monomeren Hämoglobine CTT III und CTT IV ... 11
2.2.1 Aufbau und Struktur ... 11
2.2.2 Bohr-Effekt ... 13
2.2.3 Ratenkonstanten ... 14
2.3 Bohr-Effekt-Mechanismus ... 18
2.3.1 Molekularer Mechanismus des Bohr-Effektes ... 18
2.3.2 Trans-Effekt-Mechanismus ... 20
2.4 Ursachen des Bohr-Effektes und Bedeutung der Salzbrücke ...  22
2.4.1 Ursachen des Bohr-Effektes ...  22
2.4.2 Bedeutung der Salzbrücke ...  22

3 Allosterische Modell der Hämoglobine CTT III und CTT IV ... 24
3.1 Allosterische Modell ... 24
3.2 Quantitative Formulierung ... 27
3.3 Bohr-Effekt-Kurve ... 30
3.4 Protonenfreisetzungskurve ... 31
3.5 Berechnung der Ratenkonstanten ... 32
3.5.1 Ratenkonstanten für n-Konformationszustände 32
3.5.2 Dissoziationskonstanten k¹eff , k¹x,eff und k¹y,eff ... 36
3.5.3 Assoziationskonstanten k⁰eff , k⁰x,eff und k⁰y,eff ... 38
3.6 Berechnung der Molenbrüche ... 39

4 Auswertung der experimentellen Daten ... 44
4.1 Struktur des Fitprogramms ... 44
4.1.1 Minimierungsprogramm Minuitl ... 44
4.1.2 Fitprozedur ... 45
4.2 Ergebnis der Fitprozedur ... 46

5 Statische Verzerrungen der Hämgruppe ... 56
5.1 Theorie der resonanten Ramanstreuung ... 56
5.2 Elektronische Struktur der Hämgruppe ... 58
5.3 Depolarisationsgrade und Anregungsprofile von Hämproteinen ... 60
5.4 Einfluß von statischen Verzerrungen der Hämgruppe auf den Polarisierbarkeitstensor ... 61
5.5 Effektiver Polarisierbarkeitstensor ... 63

6 Experimentelle Methoden und Meßergebnisse ... 65
6.1 Experimentelle Methoden ... 65
6.1.1 Präperation und Durchführung ... 65
6.1.2 Auswertung der Ramandaten ... 67
6.2 Meßergebnisse ... 67
6.2.t Ramanspektrum von Desoxy-Hb CTT III ... 67
6.2.2 Dispersionskurven in Abhängigkeit vom pH-Wert ... 70
6.2.3 Ramantitrationskurven ... 71

7 Diskussion ... 77
7.1 Vergleich von C(i,o,h)^A1g,R und k^oci... 77
7.2 Bohr-Effekt-Mechanismus im Licht des trans-Effekt-Modells ... 79
7.3 Allosterische Modell der Hämoglobine CTT III und CTT IV ... 81
7.3.1 12-Zustand-Modell ...81
7.3.2 Gersonde-Sick-Modell (8- Zustand-Modell (A)) ... 81
7.3.3 8-Zustand-Modell (B) ... 82
7.3.4 Fitergebnis der 8-Zustand-Modelle ... 82
7.3.5 Vergleich der Modelle ... 83
7.3.6 Schlußfolgerung ... 84

8 Zusammenfassung ... 86

Literatur ... 88

Abbildungen ... 94

Tabellen ... 96

Kapitel 1

Einleitung und Problemstellung

Einleitung

Mit Hilfe der resonanten Ramanstreuung hat man schon eine Fülle von Informationen über Struktur und Funktion von biologischen Makromolekülen wie zum Beispiel beim Hämoglobin erhalten. Beim Hämoglobin liegt das Absorptionsspektrum der prosthetischen Gruppe (Hämgruppe) im sichtbaren und nahen UV-Bereich. Dagegen liegen die Absorptionsbanden des Apoproteins im mittleren und fernen UV. Das ermöglicht ausschließlich die Schwingungen der Hämgruppe, an der die biologischen Vorgänge ablaufen, zu studieren, wenn die Anregungsfrequenz im sichtbaren Bereich liegt. Das resonante Ramanspektrum enthält dann nur Linien der Hämgruppe. Messungen des Depolarisationsgrades für die 1375 cm^-l - und 1638 cm^-1 -Ramanlinie in Abhängigkeit von der Anregungsfrequenz zeigen zum Beispiel beim Oxy- Hämoglobin Hb A eine starke Dispersion im präresonanten Bereich zwischen der Soret- und der Q-Bande. Diese Dispersion wird zurückgeführt auf symmmetrieerniedrigende statische Verzerrungen der Hämgruppe (Schweitzer el al., 1982). Denn in der idealen D4h-Symmetrie der Hämgruppe sind die Depolarisationsgrade der Ramanschwingungen unabhängig von der Anregungsfrequenz. Es gibt daher eine Methode, mit deren Hilfe man aus dem Dispersionsverlauf des Depolarisationsgrades Informationen über Verzerrungen der Hämgruppe aus der D4h-Symmetrie gewinnen kann. Die Störung der D4h-Symmetrie werden verursacht durch Bindung von verschiedenen Seitenketten und Häm-Globin-Wechselwirkungen. Änderungen der Häm-Globin-Wechselwirkungen können daher durch die resonante Ramanspektroskopie untersucht werden.
In der theoretische Behandlung des Polarisierbarkeitstensors sind die im Tensor enthaltenen vibronischen Parameter lineare Funktionen der symmetrieklassefizierten Verzerrungen δQ^Γj der Hämgruppe (Γj = A1g, B1g, A2g, B2g). Die theoretischen Dispersionskurven des Depolarisationsgrades und die dazugehörigen Anregungsprofile können mit Hilfe eines Computerprogramms mit den vibronischen Parametern als Fitparameter an die experimentellen Dispersionskurven angepaßt werden. Da die Dispersionskurven zum Beispiel vom pH-Wert abhängen (Schweitzer, 1983), sind die Fitparameter ebenfalls abhängig vom pH-Wert. Aus der pH-Abhängigkeit dieser Fitparameter kann man dann Rückschlüsse ziehen auf die Häm-Globin-Wechselwirkungen.

Mit diesem Ansatz analysierten Schweitzer-Stenner et al. (1986, 1989a, 1989b) die pH-Abhängigkeit der Dispersionskurven und damit die Hämverzerrungen. Sie wiesen nabh, daß durch Protonierung von allosterischen Effektorgruppen Konformationsänderungen induziert werden, die auf die Hämgruppe übertragen werden. Aus der pH-Abhängigkeit der Fitparameter konnten sie die pK-Werte von allosterischen Proteinseitengruppen bestimmen.
Vom Bohr-Effekt spricht man, wenn die Sauerstoffaffinität vom pH-Wert abhängt. In diesem Fall wechselwirken die Hämgruppen über eine Konformationsänderung mit den Säuregruppen der Aminosäuren (Bohr-Gruppen). Vom einfachen Bohr- Effekt spricht man, wenn die Wechselwirkung sich nur auf eine Hämgruppe und eine Bohr-Gruppe beschränkt. Das Menschen-Hämoglobin Hb A besteht aus vier Untereinheiten. Dieses Hämoglobin zeigt einen Bohr-Effekt, der auf eine Vielzahl von Wechselwirkungen zurückzuführen ist. Ein Hämoglobinmolekül, das nur aus einer Untereinheit (Monomer) besteht und nur einen einfachen Bohr-Effekt besitzt, wäre zum Studium der Wechselwirkung Hämgruppe <-> Bohr-Gruppe, eine geeignete Modellsubstanz. Die Larve der Zuckmücke Chironomus thummi thummi hat in ihrer Körperflüssigkeit (Hämolymphe) einige Hämoglobine gelöst, von denen zwei einen einfachen Bohr-Effekt besitzen: die monomeren Hämoglobine CTT III und CTT IV.
Eine Deutung des einfachen Bohr-Effektes der monomeren Hämoglobine CTT III und CTT IV ist möglich, wenn man zwei in pH-abhängigem Gleichgewicht befindliche Konformationszustände t = r mit verschiedener Sauerstoffaffinität annimmt (Gersonde, Sick, Wollmer, 1970; Wollmer, Sick, Gersonde, 1970 ). Der Konformationsübergang t = r wird dabei durch eine protonierbare Säuregruppe (Bohr- Gruppe) gesteuert (einfacher Bohr-Effekt). Die Sauerstoffbindung beeinflußt das t = r-Konformationsgleichgewicht ( " linked function" ). Das verschiebt den pK-Wert der Bohr-Gruppe, weil die Konformationszustände verschiedene Sauerstoffaffinitäten besitzen.
Der Bohr-Effekt der monomeren Insektenlarven-Hämoglobine ist jedoch nicht so einfach zu interpretieren. Denn sie zeigen eine Häm-Rotationsisomerie. Die Hämgruppe ist bezüglich einer 180°-Drehung um die α-γ-Achse asymmetrisch (Abb. 2.6, S. 13). Diese beiden Rotationszustände( gekennzeichnet mit x, y) werden in die Hämtasche eingebaut. Da die Hämtasche bezüglich dieser Achse ebenfalls asymmetrisch ist, gibt es daher zwei Rotationsisomere (x-Hb, y-Hb), die verschiedene Häm-Globin-Wechselwirkungen besitzen. Sie unterscheiden sich im Bohr- Efiekt-Verhalten und in der Sauerstoffaffinität (Gersonde et al., 1986): Das x- Rotationsisomer hat eine niedrige O2-Affinität und einen ausgeprägten Bohr-Effekt; das y-Rotationsisomer besitzt dagegen eine niedrige O2-Affinität und einen reduzierten Bohr-Effekt. Weil nun das Konzentrationsverhältnis [y-Hb]:[x-Hb] vom pH-Wert abhängt und die Rotationsisomere verschiedene Sauerstoffaffinitäten besitzen, hängt der Bohrt-Effekt also zusätzlich von der Häm-Rotationsisomerie ab.

Problemstellung

Kinetische Untersuchungen am Hämoglobin CTT III und CTT IV haben ergeben, daß der Bohr-Effekt nur über die Dissoziationskonstante kontrolliert wird, weil nur sie vom pH-Wert abhängt (Gersonde et al., 1986). Die Assoziationskonstante ist vom pH-Wert unabhängig und daher auch vom Konformationsübergang t = r und von der Häm-Rotationsisomerie. Vermutlich " sieht " der Sauerstoff die gleiche Hämumgebung, obwohl in der Lösung Rotationsisomere vorliegen, die sich im Bohr-Effekt- Verhalten, in der Sauerstoffaffinität und in der pH-Abhängigkeit der Dissoziationskonstanten unterscheiden. Die Ursache hierfür könnte sein, daß der Zugang des Sauerstoffs zur Hämgruppe entscheidend von der Häm-Öffnung ( " Häm-Mund " ) abhängt. Wenn der "Häm-Mund" ratenbestimmend ist, dann hat die Bindungsgeometrie der Hämgruppe und damit der Verzerrungszustand der Hämgruppe nur einen geringen Einfluß auf die Assoziation des Sauerstoffs.
Die vorliegende ramanspektroskopische Untersuchung am Desoxy-Hämoglobin CTT III eröffnet nun die Möglichkeit die Auswirkungen der Konformationsäinderungen (t = r) und die Häm-Rotationsisomerie auf die Hämverzerrungen zu studieren. Mit Hilfe der resonaten Ramanspektroskopie kann man den Verzerrungszustand der Hämgruppe in Abhängigkeit vom pH-Wert untersuchen, wenn jeweils für einen pH-Wert die Dispersionskurven des Depolarisationsgrades und die dazugehörigen Anregungsprofile im präresonaten Bereich zwischen der Soret- und Q-Bande gemessen werden. Der theoretische Verlauf dieser Dispersionskurven wird durch den Polarisierbarkeitstensor berechnet. Weil die im Polarisierbarkeitstensor enthaltenden vibronischen Parameter lineare Funktionen der symmetrieklassefizierten Verzerrungen δQ^Γj sind, kann dann der Verzerrungszustand C^Γj der Hämgruppe (nach Symmetrien Γj klassefiziert) in Abhängigkeit vom pH-Werte ermittelt werden. Die Abtragung von C^Γj gegen den pH-Wert wird als Ramantitrationskurve bezeichnet. Das Ziel der ramanspektroskopischen Untersuchung am Desoxy-Hämoglobin CTT III ist daher, die nach Symmetrien klassefizierten Ramantitrationskurven C^Γj(pH) zu bestimmen.
Es kann dann entschieden werden, ob die Hämverzerrungen im Desoxy-Zustand vom Konformationsübergang t = r und von der Häm-Rotationsisomerie abhängen.
Die Auswertung der Ramandaten setzt allerdings voraus, daß die Molenbrüche der Zustände als Funktion des pH-Wertes bekannt sind. Es muß daher unter Berücksichtigung der experimentellen Ergebnisse ein Modell entwickelt werden, mit dessen Hilfe die experimentellen Daten (Bohr-Effekt-Kurven, Protonenfreisetzungskurven und Ratenkonstanten) der Insektenlarven-Hämoglobine erklärt werden können.

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