Die Bedeutung der Deubiquitinierung für den intrazellulären Transport von Membranproteinen und bei Signaltransduktionswegen

Inhaltsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung
1.1 Das Ubiquitin-System
1.1.1 Abbau im 26S-Proteasom
1.1.2 Formen der Ubiquitinierung
1.2 Deubiquitinierung
1.2.1 MechanismusderDeubiquitinierung
1.3 Funktionen der Deubiquitinierung
1.3.1 Histon-Deubiquitinierung
1.3.2 Endozytose
1.3.3Zellzyklusregulation und DNA-Reparatur
1.4 Regulation der Deubiquitinaseaktivität
1.5 Zielsetzung der Arbeit

2 Regulation von Signaltransduktionswegen
2.1 Regulationsmechanismen
2.2 Der"NuclearFactor kappa-B"-Signalweg
2.2.1 Kanonischer Signalweg
2.2.2 Nicht-kanonischerSignalweg
2.3 Einfluss der Deubiquitinasen auf den NF-KB-Signalweg
2.4 Nachweis der Regulation durch die Deubiquitinase CYLD
2.4.1 CYLD als negativer Regulator des NF-KB-Signalweges
2.4.2 Regulation derCYLD-Expression durch den NF-KB-Signalweg
2.4.3 CYLD wird durch NEMO-abhängige Phosphorylierung reguliert
2.4.4 Regulation des JNK-Signalweges und der TRAF2-Ubiquitinierung
2.4.5Auswirkungen derCYLD-Expression aufdie Genexpression
2.4.6 Deubiquitinierung des NF-KB-Aktivators CC2D1A
2.5 Nachweis der Regulation durch die Deubiquitinase A
2.5.1 Regulation der A20-Expression durch den NF-KB-Signalweg
2.5.2 Ubiquitin-Editing von RIP durch A
2.5.3 A20 fördert den Abbau der Ubiquitin-Konjugasen Ubc5 und Ubc
2.5.4 A20 benötigt Rnf11 zur Herunterregulation des NF-kB- Signalweges
2.5.5 A20 benötigt Abin-Ι für die Deubiquitinierung von NEMO
2.5.6 Kontrolle der zweiten Phase des NF-KB-Signalweges
2.5.7 A20 und kK-abhängige Phosphorylierung
2.6 Nachweis der Regulation durch die Deubiquitinase CEZANNE
2.6.1 Regulation der CEZANNE-Expression durch den NF-KB-Signalweg
2.6.2 Regulation des NF-KB-Signalweges durch CEZANNE
2.6.3 Auswirkungen der Deubiquitinierung von IkK und RIP

3 Diskussion
3.1 Deubiquitinierung von TRAF2 und TRAF6 durch CYLD
3.2 Physiologische Funktionen von CYLD
3.3 Phosphorylierung von CYLD durch IkK
3.4 Wechselseitige Regulation von CYLD und dem NF-KB-Signalweg
3.5 A20-Spezifität
3.6 A20 inhibiert die Rekrutierung von RIP und TRADD
3.7 Funktionen des A20-Komplexes
3.8 Funktionen des C-Terminus von CEZANNE
3.9 Interaktionen der Deubiquitinasen

4 Zusammenfassung

5 Regulation des intrazellulären Transportes von Membranproteinen
5.1 Plasmamembranproteine
5.2 Der epidermale Wachstumsfaktor(-rezeptor)
5.3 Der EGFR-Signalweg
5.4 Herunterregulation des EGF-Rezeptors
5.5 Kontrolle der Herunterregulation durch Deubiquitinasen
5.6 Regulation durch die Deubiquitinase AMSH
5.6.1 Nachweis der Assoziation von AMSH und ESCRT-III
5.6.2 Funktionen von AMSH bei der Herunterregulation des EGFR
5.7 Ubiquitin-spezifische Protease Y
5.7.1 Funktionen der Mit-Domäne
5.7.2 Funktionen der HRS-STAM-Bindung
5.7.3 Rolle von UBPY bei der Herunterregulation des EGFR

6 Diskussion
6.1 Funktionen der Mit-Domäne von UBPY und AMSH
6.2 Interaktionen zwischen AMSH und CHMP
6.3 Funktionen von AMSH bei der Herunterregulation des EGFR
6.4 Modifikationen von UBPY
6.5 Komplexbildung zwischen UBPY und dem EGFR
6.6 Deubiquitinierung des EGFR durch UBPY
6.7 Interaktionen von AMSH und UBPY

7 Zusammenfassung

Literaturverzeichnis

Anhang

Abbildungsverzeichnis

1: Schematische Darstellung des Mechanismus der Ubiquitinierung

2: Formen der Ubiquitinierung

3: Allgemeines Modell des NF-кВ Signalweges

4: Ubiquitin-Editing von RIP durch A20

5: Darstellung des negativen Feedbacks im TNF-Signalweg durch A20 und ΙκΒα

6: Allgemeines Modell des EGFR-Signalweges

7: Herunterregulation des EGF-Rezeptors

8: Interaktionen von AMSH mit verschiedenen Komponenten der ESCRT- Maschinerie und Clathrin

9: Mögliches Modell der AMSH-Funktionen bei der endosomalen Sortierung der Wachstumsfaktoren

10: 26S-Proteasom und mit ihm assoziierte Deubiquitinasen

11: Übersicht über den NF-KB-Signalweg

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1 Einleitung

1.1 DasUbiquitin-System

Posttranslationale Modifikationen von Proteinen geben Zellen die Möglichkeit auf intra- und extrazelluläre Stimuli zu reagieren, damit sie die Kontrolle über ihre zellulären Prozesse behalten. Eine wichtige Rolle innerhalb dieser Modifikations­systeme nimmt dabei das Ubiquitin (Ub)-System ein. Neben seiner klassischen Funktion als Abbausystem von Proteinen, verfügt es über diverse weiterführende Funktionen, die bisweilen noch nicht alle erforscht sind. Bekannt ist, dass das Ub- System von essentieller Bedeutung bei der Regulation von diversen Signal­transduktionswegen zur Aufrechterhaltung derzellulären Homöostase und der Translokation von zellulären Proteinen ist. Die kovalente und reversible Übertragung von Ub-Molekülen aufdie zu regulierenden Proteine wird als Ubiquitinierung be­zeichnet. Ub ist ein Polypeptid, welches aus 76 Aminosäuren (AS) besteht und ein Molekulargewicht von 8,5 kDa aufweist. Es besitzt eine globuläre Tertiärstruktur, wobei die vier C-terminalen AS herausragen. Das Ub der Hefe unterscheidet sich von dem des Menschen nur in drei der 76 AS, was es zu einem der höchst­konserviertesten Proteine überhaupt macht. Ubiquitiniert werden Membranproteine, cytosolische Proteine und Proteine aus dem Nukleus. Dabei bindet der carboxy­terminale Teil des Ubiquitins an die ε-Aminogruppen eines oder mehrerer Lysine des zum Abbau vorgesehenen Proteins. Die Energie für die Reaktion wird durch Hydro­lyse von Adenosintriphosphat (ATP) bereitgestellt. Die Reaktion läuft kaskadenartig ab und wird von drei Enzymen (E1-E3) katalysiert: Im ersten Schritt wird Ub durch die Reaktion mit ATP aktiviert. Dieser Reaktionsschritt wird vom Ubiquitin- aktivierendem Enzym (E1) durchgeführt. Das terminale Gly des Ub wird dabei unter Abspaltung von Pyrophosphat adenyliert und aktiviert. Anschließend wird der C- Terminus des Ub durch Ausbildung einer Thioesterbindung aufdie Sulfhydrylgruppe eines Cys im E1-Enzym übertragen. Das gebundene Adenosinmonophosphat (AMP) wird abgespalten. Es folgt die Übertragung aufdas Ubiquitin-konjugierende Enzym (E2), auch hier unter Ausbildung einer Thioesterbindung. Das E2-Enzym und das zu markierende Zielprotein werden nun von einer Ubiquitin-Protein-Ligase (E3) ge­bunden und das Ub auf eine Aminogruppe eines Lys des Zielproteins übertragen.

Bei Proteinen, die über kein Lysin verfügen, kann die Bindung auch über ein freies Cys erfolgen (CADWELL et al., 2005).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Mechanismus der Ubiquitinierung (nach HOCHSTRASSER, 2009)

Im ersten Schritt adenyliert das Ubiquitin-aktivierende Enzym E1 Ubiquitin und überträgt dieses auf eines seinerCysteine. Daraufhin wird Ubiquitin auf ein Cystein des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms E2 transferiert. Die Ubiquitin-Protein-Ligase E3 überträgt Ubiquitin anschliessend auf ein Lysin des abzubauenden Zielproteins. Letztlich findet in vielen Fällen noch eine Ubiquitin- Kettenverlängerung statt und eine Deubiquitinase spaltet Ubiquitin von seinem Substrat wieder ab.

Da insgesamt mindestens 60 verschiedene Ub-konjugierende Enzyme und über 600 verschiedene Ub-Protein-Ligasen existieren, ergibt sich eine große Substrat­spezifität. Die E3-Familie bildet damit eine der größten Genfamilien des Menschen. Bei ihr muss man zwischen zwei Enzymklassen unterscheiden: die HECTs (Homolog zum E6-AP Carboxyl-Terminus) sind katalytisch aktiv und können Ub direkt binden.

HECTs transferieren Ub selbst von der Ub-Konjugase aufdas Substrat. Demgegen­über besitzen die RING-Enzyme (Really Interesting New Gene) keine katalytische Aktivität und können Ub auch nicht binden. Ihre Bindung an die Ub-Konjugasen löst einen Mechanismus aus, der bewirkt, dass die Konjugasen Ub selbst aufdas Substrat übertragen (GLICKMAN et al., 2002). Bisher konnten acht funktionelle AS (die Lysine an den Stellen 6,11,27, 29, 33, 48 und 63 sowie das Glycin an der Stelle 76) identifiziert werden. Während die Substratbindung über Gly76 verläuft, entscheidet die AS, über die die Ubiquitine untereinander verbunden sind über das Schicksal des gebundenen Proteins. So werden Bindungen über Lys48 und Lys29 klassischerweise mit dem Abbau im 26-Proteasom in Verbindung gebracht. Dafür muss eine Kette aus mindestens vier Ub-Molekülen entstehen (THROWER et al., 2000). Die Kette entsteht durch Ausbildung von Isopeptidbindungen (die stabil gegen menschliche Peptidasen sind) zwischen den jeweiligen Lysinen.

1.1.1 Abbau im 26S-Proteasom

Das 26S-Proteasom (siehe Anhang) stellt einen großen Proteasekomplex dar, in dem die ubiquitinierten Proteine unter ATP-Verbrauch verdaut werden. Jede Zelle verfügt dabei im Schnitt über knapp 30.000 Proteasomen. Das 26S-Proteasom ist eine multikatalytische Protease, die aus einer 20S-Untereinheit (besitzt katalytische Funktion) und einer 19S-Untereinheit (besitzt regulatorische Funktion) besteht. Die katalytische Untereinheit besteht dabei aus zwei Kopien (a und ß) von je14 homologen Subeinheiten und weist ein Molekulargewicht von 700 kDa auf. Angeordnet sind diese in Form von vier Ringen zu je sieben Untereinheiten, die zu einer fassähnlichen Struktur übereinander gestapelt sind. Der Zugang zum 20S-Kern wird dabei von einer regulatorischen Einheit kontrolliert, die ein 700-kDa-Komplex aus 20 Untereinheiten darstellt. Die 19S-Untereinheit kann weiter in zwei Sub­komplexe unterteilt werden, den Deckel und das Fass. Während der Deckel verschiedene Ub-Rezeptoren beinhaltet und somit für die Erkennung der Substrate verantwortlich ist, stellt das Fass einen Proteinpartikel dar, welcher unter ATP- Verbrauch selektiv ubiquitinierte Proteine entfaltet und diese ins Innere des Proteasoms einfädelt. Jeweils ein 19S-Komplex bindet an die Enden des 20S- Proteasoms und bildet somit das komplette 26S-Proteasom.

Die 20S-Untereinheit bildet im Inneren einen Hohlzylinder, wobei die proteolytischen Domänen an den Innenseiten liegen und vom Cytosol wirkungsvoll abgeschirmt sind. Somit können sich andere Proteine nicht ins Innere des Proteasoms verirren und die zum Abbau bestimmten Substrate werden geschützt, bis sie ins Innere gelenkt werden. Durch die spezifische Bindung der 19S-Untereinheiten (mittels Ub- bindenden Proteinen) an die Ub-Ketten wird gewährleistet, dass nur die Proteine abgebaut werden, die auch zum Abbau markiert worden sind. Essentiell für die Reaktion ist die ATPaseaktivität der 19S-Untereinheiten. Sie verfügen über sechs verschiedene ATPasen der AAA (assoziiert mit verschiedenen zellulären Aktivitäten)- Klasse, die bei der Entfaltung des Substrats und der Konformationsänderung des Kerns hilft, sodass das Substrat ins Innere gelangen kann. Die ß-Subeinheiten des 20S-Komplexes verfügen über insgesamt drei Typen von aktiven Zentren mit unter­schiedlicherSpezifität, gemein haben sie jedoch das N-terminale Thr. Dessen OH- Gruppe wird in ein Nukleophil umgewandelt, welches die Carbonylgruppen der Peptidbindungen angreift, wodurch Acyl-Enzym-Zwischenstufen entstehen. Die Peptidbindungen werden aufgespalten bis das Protein nur noch aus einem 7-9 AS langem Peptidrest besteht, ohne dass dabei Zwischenstufen freigesetzt werden. Das Ub wird anschließend in der 19S-Untereinheit durch eine Ub-spezifische-Protease, eine Isopeptidase, vom Peptid abgespalten und recyclisiert. Es geht unverbraucht aus der Reaktion hervor. Die Peptidreste werden durch Proteasen in AS zerlegt (JOHNSON etal., 1995).

1.1.2 Formen der Ubiquitinierung

Ub-Bindungen via Lys63 haben nicht-proteolytische Funktionen. Sie stellen z.B. ein Signal zur Endozytose, zur Aktivierung von Proteinkinasen oder zur Einleitung von DNA-Reparaturwegen dar. Die Bedeutung der anderen Lysine ist bisher noch nicht hinreichend erforscht. Während Ub-Ketten über Lys48 verzweigt sind, sind die Ketten bei einer Lys63-Verknüpfung meistens linear (DATTAet al., 2009). Des Weiteren unterscheidet man nach Menge und Art der angehangenen Ub-Moleküle zwischen Mono-, Multi- und Polyubiquitinierungen, die verschiedene Funktionen haben (Abbildung 2).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Bei der Ubiquitinierung wird zwischen einer (A) Mono-, Multi- und einer (В-E) Polyubiquitinierung unterschieden, die jeweils verschiedene Funktionen besitzen. Bei der Polyubiquitinierung wird auch zwischen verschiedenen Formen, wie z.B. der linearen beiLys63 und derverzweigten, wie bei Lys48 differenziert.

Monoubiquitinierung ist beispielsweise an der Endozytose von Plasmamembran­proteinen, der Transkriptionsregulation und der DNA-Reparatur beteiligt, während Multiubiquitinierungen eine wichtige Rolle bei der Endozytose von Rezeptortyrosin­kinasen und dem nukleären Export des Transkriptionsfaktors und Tumorsuppressor­proteins p53 spielen. Es existieren eine Vielzahl von Signalen, die bestimmen, ob und wann sich Ub an ein Protein anlagert.

Am bekanntesten und einfachsten zu deuten ist die Tatsache, dass die Halbwertszeit (HWZ) eines Proteins u.a. durch seine aminoterminale AS bedingt ist (N-End-Rule). So verlängert ein N-terminales Ala die Lebensdauer eines Proteins, während ein Arg diese verkürzt. Dementsprechend oft sind Proteine mit kurzer HWZ die Ziele von Ub. Das Lesen der AS wird dabei von den E3-Enzymen übernommen. Nach TOBIAS et al. (1991) verhält sich die Abhängigkeit der HWZ in Bezug aufihre aminoterminale AS wie folgt:

1. stark stabilisierende AS (Halbwertszeit > 20 Stunden)

Ala, Cys, Gly, Met, Pro, Ser, Thr, Val

2. destabilisierende AS (Halbwertszeit 2-30 Minuten)

Arg, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Tyr, Trp

3. nach chemischerVeränderung destabilisierende AS (Halbwertszeit 3-30 Minuten) Asn, Asp, Glu, Gln

Eine destabilisierende AS begünstigt die Anlagerung des Proteins an Ub, während eine stabilisierende AS dies nicht tut. Eine posttranslationale Addition von u.a. Arg kann somit die Lebensdauer eines Proteins verkürzen.

1.2 Deubiquitinierung

Nachdem man entdeckt hatte, dass die Ubiquitinierung ein reversibler Prozess ist, wurde klar, dass neben den Ub-übertragenden Enzymen auch Enzyme existieren müssen, die Ub wieder vom Protein abspalten. Dies geht allein schon aus der Tat­sache hervor, dass das Ub beim Proteinabbau im 26S-Proteasom recycelt wird. Bisweilen sind knapp 100 solcher Enzyme, die Deubiquitinasen (auch: de- ubiquitinierende Enzyme und DUBs) genannt werden, identifiziert worden. Die DUBs in Säugetieren hat man in fünf große Gruppen unterteilt:

1. Ubiquitin-Carboxy-terminale Hydrolasen (UCHs)
2. Ubiquitin-spezifische prozessierende Peptidasen/Proteasen (USPs/UBPs)
3. Ovariale Tumorproteine (OTUs)
4. Josephin bzw. Machado-Joseph-Disease-Proteasen (MJDs)
5. Jab1/MPN-Domänen-assoziierte Metalloisopeptidasen (JAMMs)

Während es sich bei den ersten vier Gruppen um Cysteinproteasen handelt, stellen die JAMM Zink-Metalloisopeptidasen dar.

Des Weiteren ist noch eine weitere Familie von DUBs bekannt, die Adenain-Familie, deren Spezifität für Ub jedoch sehr gering bzw. gar nicht vorhanden ist. Sie umfasst die ULPs (ubiquitin-like proteases) die spezifisch für z.B. SUMO (small ubiquitin-like modifier) sind (LI et al., 2000). DUBs hydrolysieren die Isopeptidbindungen zwischen Ubiquitin und dem Substrat. Die Cysteinproteasen verfügen über ein aktives Zentrum, welches aus einer katalytischen Triade aus Cys, His und einer dritten AS, zumeist Asp oder Asn besteht. Nachdem es gelungen war, die Gene für Ub und Ub- ähnliche Moleküle zu identifizieren wurde es offensichtlich, dass alle Mitglieder der Ub-Familie als Proproteine synthetisiert und dann prozessiert werden, um ihr C- terminales Dipeptid Glycylglycin, aber nicht Ub selbst, freizusetzen (JENTSCH et al., 2000). Daher werden DUBs als Proteasen definiert, die am C-Terminus von Ub oder Ub-ähnlichen Molekülen angreifen, um die Konjugation rückgängig zu machen oder um Proproteine zu prozessieren. NIJMAN et al. (2005) kamen in einer Studie zu dem Ergebnis, dass das menschliche Genom für ca. 95 DUBs codiert, darunter 58 USP's, je 14 OTU's und JAMM's, 4 UCH's und 5 MJD's. Die einzelnen DUB-Familien unterscheiden sich dabei in ihrer Substratspezifität und ihrer Lokalisation. So können UCHs, die erste DUB-Familie, die entdeckt wurde, beispielsweise die Isopeptid­bindungen zwischen den einzelnen Ubs innerhalb einer Polyubiquitinkette nicht spalten. UCHs sind aber sehr effektiv im Prozessieren von primären Genprodukten, wie den Vorläufer Proubiquitin, zwecks Freilegung des terminalen Gly-Gly-Motivs (DANG et al., 1998) und im Abspalten von kleinen Addukten vom C-Terminus des Ub. Alle UCHs verfügen über eine hochkonservierte katalytische Triade im aktiven Zentrum, die aus Cys, His sowie Asp besteht und die essentiell für ihre Funktionen ist. USPs wurden als zweite DUB-Familie entdeckt und stellen die größte Gruppe der Deubiquitinasen. Aufgrund dessen ist auch die Anzahl ihrer potentiellen Substrate wesentlich höher als die der UCHs. Des Weiteren sind sie im allgemeinen größer und variabler, was die Größe betrifft. Ihr Molekulargewicht schwankt zwischen 50 und 300 kDa, während UCHs für gewöhnlich nur aus einem katalytischen Kern bestehen, der ein Molekulargewicht von ca. 25 kDa aufweist und aus ca. 230 AS zusammen­gesetzt ist. USPs sind zudem in der Lage Polyubiquitinketten zu spalten (WING et al., 2003). Katalytisch gesehen ähneln sie den UCHs, denn auch sie nutzen eine katalytische Triade, die aus Cys im aktiven Zentrum sowie His und Asp besteht.

Die Faltung der USPs ähnelt einer Hand und besteht aus drei Untereinheiten: dem Finger, der Handfläche sowie dem Daumen. Einzige bekannte Ausnahme ist hierbei Cylindromatosis (CYLD), dem die Finger-Subeinheit fehlt (KOMANDER et al., 2008). Die OTUs wurden erst 2002 entdeckt und die OTU-Domäne ursprünglich in einem ovarialem Tumorprotein von Drosophila melanogaster identifiziert. Die katalytische Triade besteht hier aus hochkonservierten katalytischen Cys und His sowie wahr­scheinlich Asp (NIJMAN et al., 2005). Nicht alle OTU-Domänen besitzen Deubiquitinaseaktiviät, so das ovariale Tumorprotein selbst, das anstatt eines Cys ein katalytisch inaktives Ser im aktiven Zentrum hat.

Die JAMM-Isopeptidasen sind die erste DUB-Familie, die keine Cysteinproteasen darstellen. Ihre Aktivität bezieht sich auf ihr JAMM-Motiv innerhalb der JAMM- Domäne. Dabei binden zwei His und ein Asp an ein Zinkion, um anschliessend durch Polarisierung eines gebundenen Wassermoleküls katalytische Aktivität zu erlangen. Ein Glu dient zusätzlich als genereller Säuren/Basen-Katalysator.

Darüber hinaus haben auch Viren (SULEAet al., 2005) und Bakterien (CATIC et al., 2007) verschiedene DUBs entwickelt bzw. sich angeeignet, höchstwahrscheinlich um im Rahmen ihrerVirulenz in die zellulären Prozesse ihrer Wirtsorganismen einzu­greifen. Strukturell haben diese wenig mit den menschlichen DUBs gemeinsam.

1.2.1 Mechanismus der Deubiquitinierung

Alle DUBs haben gemein, dass sie den C-Terminus von Ub erkennen und an diesem angreifen. Die Erkennung verläuft über einen negativ geladenen Spalt in ihrer katalytischen Domäne. Ub und Ub-ähnliche Moleküle besitzen ein C-terminales Gly- Gly-Motiv und dessen Spaltung durch DUBs hinterlässt eine sogenannte Leaving Group, die an die Carboxylgruppe des C-terminalen Gly gebunden ist. Die Deubiquitinierungsreaktion beginnt mit einem nukleophilen Angriffaufdas katalytische Cys der Carboxylgruppe derzu spaltenden Bindung. Dies wird in eine Acyl-Enzym-Zwischenstufe umgewandelt und der Angriff eines Wassermoleküls führt zur Regeneration des freien Thiols am Cys und zur Freisetzung des Ub. Ub-Substrat- Komplexe, die kein C-terminales Gly-Gly-Motiv besitzen, werden nicht gespalten (JOHNSON et al., 1995). Wie in Kapitel 1.4 beschrieben, verfügen DUBs auch über Ub-bindende Domänen, die mit der hydrophoben Tasche des Ub interagieren.

1.3 Funktionen der Deubiquitinierung

Durch ihre Aktivität können DUBs Proteinsubstrate vor dem Abbau im Proteasom bewahren, durch Ub-Bindung verursachte Konformationsänderungen rückgängig machen oder auch einen Transport zum Ursprungsort bewirken. Hierbei fungieren sie als Antagonist der Proteinubiquitinierung und nehmen dabei eine vergleichbare Rolle ein, wie die Phosphatasen bei den Kinase/Phosphatase-Regulationswegen. Zellen nutzen eine Kombination aus Mono-, Poly,- und ubiquitinähnlichen Molekülen für eine Vielzahl von Prozessen und konjugieren diese zu Tausenden von Proteinen. DUBs helfen dabei diese Prozesse zu regulieren, indem sie den Vorläufer Pro- ubiquitin in seine aktive Form prozessieren. Ub wird in Zellen entweder als lineares Polyubiquitin exprimiert oder nach de novo Synthese N-terminal an bestimmte ribosomale Proteine gebunden (FINLEY et al., 1989). DUBs regenerieren Mono-Ub aus unverankerten Polyubiquitinketten, welches von seinen Zielsubstraten ab­gespalten wurde oder de novo synthetisiert wurde (WILKINSON et al., 1995). Die Akkumulation von freien Polyubiquitinketten ist insofern schädlich, da sie bei der Substratbindung als kompetitiver Inhibitor sowohl gegenüber dem Proteasom, als auch gegenüber anderen Ub-Rezeptoren fungieren und die Verfügbarkeit von Mono- Ub herabsenken. (PIOTROWSKI et al., 1997). Das Fehlen dieses Mechanismus würde höchstwahrscheinlich den Zelltod aufgrund Ub-Mangels nach sich ziehen. DUBs recyclisieren auch Ub-Moleküle, welche versehentlich durch eine Reaktion von zellulären Nukelophilen mit den Thiolester-Zwischenprodukten der Protein­ubiquitinierung festgehalten werden. Des Weiteren assistieren sie beim proteasomalen Abbau von Ub-Substraten und regulieren das Ubiquitinierungsniveau von Proteinen in zellulären Signalwegen. Interessanterweise führt die De­ubiquitinierung eines Substrates, wenn sie am Proteasom durchgeführtwird, nicht zu einer Inhibition der Proteolyse, sondern fördert diese sogar. Die Deubiquitinierung eines Ub-Protein-Konjugats erscheint zudem unerlässlich, da ein verzweigtes Poly­peptid, wie es ein Ub-Proteinkonjugat darstellt, kaum ins 20S-Proteasom passen würde, was wiederum den proteasomalen Abbau hemmen würde (YAO et al., 2002). In höheren Eukaryoten sind bisher drei Proteasom-gebundene DUBs (UCH37, USP14 und POH1) bekannt, die Polyubiquitin von den zum Abbau bestimmten Substraten entfernen.

POH1 und UCH37 stellen dabei Untereinheiten der 19S-Einheit dar, während USP14 über eine N-terminale Ub-ähnliche Domäne an den 19S-Komplex gebunden ist (YAO et al., 2006). Neuere Studien besagen, dass die Aktivität von UCH37 und USP14 die proteasomale Aktivität herabsetzt. UCH37 entfernt Ub vom distalen Ende der Poly- ubiquitinkette und inhibiert somit den Abbau des Substrates. Eine verminderte Verfügbarkeit, sowohl von UCH37 als auch von USP14, führt in menschlichen Zellen zu einem verstärkten proteolytischen Abbau und einer Abnahme von poly- ubiquitinierten zellulären Proteinen (KOULICH et al., 2008 & YAO et al., 2006). Demgegenüber führt eine Gen-Ausschaltung von POH1 zu einerZunahme von polyubiquitinierten Proteinen sowie fehlerhaftem proteasomalen Abbau (KOULICH et al., 2008). Dies zeigt, dass es für die Funktionalität und Integrität des Proteasoms notwendig ist. In den letzten Jahren haben verschiedene Studien aufgezeigt, dass DUBs eine essentielle Rolle in der Regulation des Ubiquitinierungsniveaus von Proteinen spielen, die nicht zum proteasomalen Abbau markiert sind. Einige DUBs regulieren dabei aktiv die Ub-Konjugation, während andere die Konjugation von verschiedenen Ub-Formen an einem einzelnen Substrat regulieren können. Gezeigt werden konnte dies anhand von UBP8 in Hefe. Im Schnitt sind 10% der Histon- oktamere ubiquitiniert und das Ub wird während der Mitose durch DUBs wieder entfernt. UBP8 reguliert die Ubiquitinierung des Histons H2B, welches für die transkriptionelle Aktivität in vielen Genen verantwortlich ist (DANIEL et al., 2004). Auch werden einige Zelloberflächenrezeptoren als Signal für die Internalisierung ubiquitiniert und das Ub anschliessend am Endosom wieder durch DUBs entfernt.

1.3.1 Histon-Deubiquitinierung

In höheren Eukaryoten spielt die Monoubiquitinierung der Histone H2A und H2B eine wichtige Rolle in der Regulation von diversen nukleären Prozessen wie Mitose, Transkription und RNA-Silencing (ZHAO et al., 2008). Es wurden DUBs identifiziert, die sowohl H2Aals auch H2B als Substrate haben sowie DUBs die spezifisch auf entweder H2A oder H2B einwirken (WYCE et al., 2004 & ZHANG et al., 2008). Die Monoubiquitinierung von H2B am Lys120 wird in Säugetierzellen von je einer spezifischen Konjugase und Ligase katalysiert. Die Ubiquitinierung ist Voraussetzung für die Di- und Trimethylierung der Lysine 4 und 79 des Histons H3.

Diese Modifikation korreliert positiv mit transkriptioneil aktivem Chromatin und wirkt bei einigen Chromatinmodifikationsaktivitäten unterstützend (HENRY et al., 2003). Die Deubiquitinierung des Histons H2B ist innerhalb bestimmter Promoterregionen für optimale Transkriptionsaktivität sowie das Gene-Silencing notwendig. So führt das Ausschalten der DUB UBP10, welche H2B deubiquitiniert, zu einer Über­expression verschiedener Proteine (GARDNER et al., 2005). Die Ubiquitinierung von H2Awird in höheren Eukaryoten mit dem Silencing von Entwicklungsgenen, X- Chromosom-Inaktivierung und transkriptioneller Initiation sowie Elongation in Verbindung gebracht. Stattfinden tut sie am Lys119 des C-terminalen Endes des H2A. Im Schnitt sind ca. 10% der Lys119 monoubiquitiniert, während das Lys120 des H2B in knapp 1% der Fälle monoubiquitiniert ist (SHILATIFARD et al., 2006). Obwohl noch keine Einigkeit bzgl. der genauen Funktionen von ubiquitiniertem H2A besteht, scheint es sicher, dass es in einigen Genen die Transkriptionsinitiation inhibiert indem es die Methylierung des Lys4 am Histons H3 verhindert (CLAGUE et al., 2008 & VISSERS et al., 2008), während in anderen Genen die Elongation gehemmt wird. Bisher wurden fünf DUBs identifiziert, die spezifisch H2A deubiquitinieren, darunter USP16, USP21 und die JAMM 2A-DUB. Letztere deubiquitiniert H2A besonders in hyperacetylierten Nukleosomen, was nahelegt, dass diese Histonacetylierung eine Deubiquitinierung begünstigt (ZHU et al., 2007). USP16 fungiert sowohl in der Zell­zyklusprogression, als auch in der Regulation der Genexpression, indem es mit den Chromosomen während der Mitose reagiert. Eine in vitro induzierte Überexpression von USP16 führte zu einer verringerten Menge von ubiquitiniertem H2A (CAI et al., 1999), während ein Knockdown von USP16 zum umgekehrten Ergebnis, einher­gehend mit einer verringerten Mitoseaktivität, führte. Das dritte Enzym, USP21, reguliert die Transkription in der Leber während der Regeneration der Hepatozyten. Es wurde gezeigt, dass es nach einer Hepatektomie zu einer Hochregulierung von USP21 kommt. Da eine Leberregeneration mit einem vermindertem Niveau von monoubiquitiniertem H2A einhergeht, ist die Schlussfolgerung naheliegend, dass USP21 für die Deubiquitinierung in diesem Falle verantwortlich ist. Diese Vermutung konnte sowohl in vitro als auch in vivo bestätigt werden. Des Weiteren unterstützt es die durch Ubiquitinierung von H2A vermittelte Repression der Methylierung von H3 und initiiert dabei die Transkription verschiedener Gene (NAKAGAWA et al., 2008).

1.3.2 Endozytose

Monoubiquitinierung sowie die Übertragung von Lys63-Ketten spielen eine wichtige Rolle in der Endozytose von Rezeptoren und der Prozessierung von endozytosierten Proteinen (HAGLUND et al., 2003). DUBs sind an vielen Stellen der endozytosierten Signalwege wirksam und zudem an zellulären Proteintransporten beteiligt. So reguliert die DUB CYLD nicht nur die Kinaseaktivität von diversen NF-kB- assoziierten Kinasen, sondern kontrolliert auch zelluläre Prozesse, die Lys63- Ubiquitinierung beinhalten, darunterdie Endozytose eines Rezeptors der Nervenwachstumsfaktor (NGF)-Familie (COURTOIS et al., 2008). Die DUB AMSH (assoziiertes Molekül mit der SH3-Domäne von STAM) hydrolysiert spezifisch Lys63- Ketten. An den Endosomen deubiquitiniert sie Proteine, die in Membranvesikeln transportiert werden. Die Ausschaltung von AMSH führt zu einem verstärkten Abbau des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR), was eine antagonistische Rolle zum Ub-abhängigem Sortieren und Weiterleiten der transportierten Fracht zu den Lysosomen nahelegt (MCCULLOUGH et al., 2006). Wachstumsfaktoraktivierte Rezeptortyrosinkinasen werden nach Ligandenbindung ubiquitiniert, endozytiert und in den Lysosomen abgebaut. Diese Herunterregulation der Rezeptoren wird auch durch Deubqiuitinierung reguliert (KOMADAet al., 2008). Durch die Kontrolle der Endozytose und des lysosomalen Abbaus derWachstumsfaktoren stellen die DUBs eine wichtige Verbindung zwischen Proliferation und der Zellzyklusregulation her.

1.3.3Zellzyklusregulation und DNA-Reparatur

Die Regulation des Zellzykluses erfordert den zeitlich festgelegten Abbau von verschiedenen Signalmolekülen um einen geordneten Ablaufvon Replikation, Mitose und Wachstum zu gewährleisten. Wie die Ub-Ligasen sind auch die DUBs in praktisch jedem Schritt des Zellzykluses involviert und nehmen beispielsweise eine Hauptrolle in der Regulation der Ub-Homöostase und der Transkriptionsregulation ein. Die DUB USP3 interagiert im Nukleus mit dem Chromatin und besitzt eine Zink­fingerdomäne in ihrem N-Terminus, mit der sie an Ub und somit auch an ubiquitiniertes H2Aund H2B binden kann. Sie ist zudem in der Lage sowohl H2A, als auch H2B zu deubiquitinieren. Ein Knockdown von USP3 mittels RNA-Interferenz führte in vivo zu einer verstärkten Ubiquitinierung der Histone.

Dies hatte eine Verlangsamung der S-Phase während der Mitose, eine Akkumulation von DNA-Strangbrüchen und Defekte in der Replikation zur Folge (NICASSIO et al., 2008). In einer Studie über DNA-Schäden-induzierte Apoptose wurde gezeigt, dass die DUB USP28 in dem CheckpointKinase 2 (CHK2)-p53-Signalweg zum Einsatz kommt. Dieser Signalweg wird durch DNA-Doppelstrangbrüche ausgelöst. In vivo konnte bestätigt werden, dass USP28 mit drei Mediatoren interagiert, die in diesen Signalweg involviert sind und deren Funktionalität reguliert (ZHANG et al., 2006). Die Abstinenz von USP28 führte, aufgrund eines daraus resultierenden verstärkten Ab­baus seiner Bindungspartner, zu einer Abschwächung des Signalweges, was einen Rückgang von apoptotischen Prozessen zur Folge hatte. Dagegen ist es in Kolon- und Brusttumoren oft überexprimiert, was seine Funktion als Proliferationspromotor bestätigt (POPOV et al., 2007). Interessanterweise liegen DUBs oft im Komplex mit Ub-Ligasen vor, wie z.B. Mdm2 (murine double minute oncogene) und Brcal (breast cancer 1, earlyonset), deren Fehlregulation oft zu unphysiologischer Proliferation und Krebs führen. So kontrollieren DUBs die Zellzyklusprogression in erster Linie durch die Aktivitätsregulierung der E3-Enzyme. Die Co-Regulation von USP7 und seinem Bindungspartner Mdm2 ist ein besonders gut untersuchtes Beispiel um dieses Zusammenwirken zu erläutern. Ursprünglich wurde USP7 als der zelluläre Bindungspartner des Herpesvirus-Proteins ICP0 (infected cell polypeptide 0) identifiziert. Später fand man heraus, dass es durch seine aminoterminale Domäne mit Mdm2 und seinem Substrat p53 interagiert (SHENG et al., 2006). In Abwesenheit von Substraten bewirkt Mdm2 seine eigene Ubiquitinierung und damit den Abbau im 26S-Proteasom. Durch dieses negative Feedback wird die Aktivität einiger E3- Enzyme durch die Substratverfügbarkeit reguliert (LAHAV et al., 2003). USP7 kann eine solche Autoubiquitinierung rückgängig machen (siehe Kapitel 1.4) und so führt eine geringe Verfügbarkeit an USP7 zu einer verstärkten Autoubiquitinierung von Mdm2, selbst wenn ausreichend Substrat vorhanden ist. Dies hat eine Anreicherung von p53 zur Folge, welches den Stopp des Zellzykluses in der G-Phase induziert. Da es Mdm2 vor dem proteasomalen Abbau schützt, übt USP7 seine Kontrolle über den Zellzyklus aus. USP7 ist auch für die Deubiquitinierung des Transkriptionsfaktors Foxo4 (Forkhead box protein 04) verantwortlich. Als Antwort auf zellulären Stress wird Foxo4 monoubiquitiniert, was seine Translokation in den Nukleus zur Folge hat.

Dies erhöht seine Affinität für transkriptioneile Co-Faktoren und Polymerasen. Foxo4 stimuliert die Transkription des Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitors p27, was wiederum zu einem Stopp des Zellzykluses führt. Wenn sich die zellulären Bedingungen gebessert haben, deubiquitiniert USP7 Foxo4 und der Zellzyklus läuft weiter. Die Deubiquitinierung stellt so sicher, dass der Stress-induzierte Stopp nur von vorübergehender Natur ist (VAN DER HORST et al., 2006).

1.4 Regulation der Deubiquitinaseaktivität

Aufgrund ihrer proteolytischen Fähigkeiten, ist es von immenser Wichtigkeit die katalytische Aktivität der DUBs zu regulieren, da es sonst zur Spaltung von Nicht­Substrat-Proteinen kommen kann, die ebenfalls über ein Gly-Gly-Motiv verfügen. In den letzten Jahren wurden so viele Mechanismen entdeckt, die an der Regulation der DUB-Aktivität beteiligt sind, dass es unmöglich wäre, sie an dieser Stelle alle auf­zuzählen. Deswegen bleibt es hier auf eine kleine Auswahl der am besten unter­suchten Mechanismen beschränkt. Sicher scheint mittlerweile, dass alle DUBs die Ub-Faltung bzw. Ub-spezifische Domänen erkennen können, was ihre Spezifität sicherstellt (WILKINSON et al., 1999). Dies kann u.a. durch sogenannte Ub- assoziierte Domänen geschehen, welche in DUBs vorhanden sind und mit einer Polyubiquitinkette bis zu 1000x besser reagieren als mit Monoubiquitin (MUELLER et al., 2004). Es existieren aber auch andere Domänen wie das Ub-interagierende Motiv und die CUE (coupling ofubiquitin conjugation to ER degradation), die stärker an ein Ub-Monomer binden. Diese Domänen kommen besonders in endozytotischen Signalwegen zutrage (KANG et al., 2003). Bekannt ist, dass Polyubiquitin-bindende Proteine einen bestimmten Abschnitt der Ub-Oberfläche erkennen, an den sie binden können. Es handelt sich hier um eine Gruppe von drei AS (Leu8, Ile44 und Val70), welche im Ub-Molekül so ausgerichtet sind, dass sie eine hydrophobe Tasche er­geben und von DUBs erkannt werden (BEAL et al., 1998).

Die Struktur von jeweils mindestens einem Vertreter einerjeden DUB-Familie konnte mittlerweile identifiziert werden und es gelang in zahlreichen Studien diesen in vitro und in vivo an Ub zu binden. Diese Studien ergaben, dass die Bindung an Ub zu einer Konformationsänderung im aktiven Zentrums führt und diese Änderungen wiederum notwendig für die Substratbindung bzw. für hydrolytische Spaltungen sind.

Dies erhöht die Spezifität der DUBs und verhindert zudem unwillkürliche Spaltungen (JOHNSTON et al., 1997, 1999). Erklären lässt sich dies am Beispiel der USP5, besser bekannt als Isopeptidase T. Es konnte sowohl in vitro, als auch in vivo gezeigt werden, dass USP5 freie Polyubiquitinketten hydrolysiert (AMERIK et al., 1997). Dafür bindet es an den C-Terminus am Ende der Kette, wo auch das Substrat binden könnte. In Versuchen mit dem Ub-Analoga Ubiquitin-7-amido-4-methylcoumarin (Ub- AMC) wurde aufgezeigt, dass USP5 dieses spaltet und eine Zugabe von Ub die Reaktionsgeschwindigkeit deutlich erhöht. Ub besetzt das aktive Zentrum von USP5 und simuliert diesem das proximale Ende einer Polyubiquitinkette (DANG et al., 1998). Diese Aktivierung findet nur dann statt, wenn das stimulierende Ub über einen freien C-Terminus verfügt. Die Konformationsänderung ist somit unerlässlich für die Aktivierung. USP5 liest also den C-Terminus von Polyubiquitinketten und hydrolysiert sie erst dann, wenn sie ungebunden vorliegen (REYES-TURCU et al., 2006), d.h. zum Abbau bestimmte Proteine können nicht vorzeitig deubiquitiniertwerden. Die Dissoziation des Bindungspartners führt dann zur Inaktivierung der DUB. Vergleiche von Ub-UCH-Komplexen mit ungebundenen UCHs konnten zwei signifikante Konformationsänderungen aufzeigen, die zwischen inkativem und aktivem Zustand entscheiden. Die Ub-Bindung führt zu einer Neuordnung der blockierenden Schleife, die im inaktiven Zustand den Zugang zum aktiven Zentrum blockiert und funktionelle Wichtigkeit bei der Substratbindung besitzt (JOHNSTON et al., 1999). Zweitens konnte am Beispiel der UCH-L3 gezeigt werden, dass eine Seitenkette des Leu9 in die Substratbindungsstelle eindringt und somit die Bindung von Peptidsubstraten verhindert. Durch Interaktion mit Ub positioniert sich diese Seitenkette neu und die Bindungsstelle wird freigesetzt. Andererseits kann die Spaltung der katalytischen Domäne, wie es am Beispiel der USP1 gezeigt werden konnte, zu einer Inhibition ihrer Deubiquitinaseaktivität führen (HUANG et al., 2006). Ein weiterer Aktivierungs­mechanismus verläuft über die Bindung an Adaptoren bzw. Scaffolds. Bei einigen DUBs ist es bekannt, dass sie erst durch Proteasombindung aktiviert werden (CROSAS et al., 2006), während bei anderen zwar gute katalytische Fähigkeiten, aber schwache Affinität zu Ub festgestellt wurden. Eine große Anzahl dieser DUBs interagiert mit Scaffold-Proteinen, die sicherstellen, dass die DUBs zu ihren jeweiligen Substraten geleitet werden.

Die Bindung an Adaptoren schliesst die Lücke zwischen DUB und Substrat, indem der Adaptor an beide bindet. Es gilt als sicher, dass die Polyubiquitinketten, abhängig davon überwelches Lys sie verbunden sind, unterschiedliche Strukturen aufweisen und dass die DUBs zwischen diesen unterscheiden können. Eine Anzahl von Proteinen des Ub-Systems verfügen über multiple Bindungsdomänen, über die sie die Erkennung vornehmen (WINBORN et al., 2008). So verfügt die Isopeptidase T über mindestens vier Ub-Bindungsstellen, sowohl für lineare als auch für Lys48- verzweigte Ub-Ketten. Diese Bindungszentren werden durch vier Bindungsdomänen geformt: einer ZnF-Domäne, einer USP-Domäne sowie zwei UBA-Domänen. Durch Ub-Kontakt wird in der ZnF-Domäne eine Konformationsänderung ausgelöst, die zur Aktivierung des Enzyms führt. Voraussetzung dafür ist erneut, dass das Ub einen freien C-Terminus besitzt. Die Substrat-induzierte Konformationsänderung hindert die Isopeptidase T daran, Polyubiquitinketten zu spalten, bevor sie nicht von einer anderen DUB vom Zielsubstrat abgespalten wurde (REYES-TURCU et al., 2006). Darüber hinaus kann die Aktivität noch durch die zeitliche Kontrolle ihrer Akkumulation reguliert werden. Das wohl am besten untersuchte Beispiel ist das der Cytokin-induzierbaren DUBs der Murinlymphozyten. Deren Transkription kann durch verschiedene Cytokine, v.a. Interleukine induziert werden, da ihre Gentranskription unter der Kontrolle von Cytokin-responsiven Elementen innerhalb der DUB-Gene steht. Eine Unterbrechung der Cytokin-Gabe führt zu ihrem Abbau, wahrscheinlich aufgrund von Polyubiquitinierung und anschliessendem Abbau im 26S-Proteasom. Diese temporäre Regulation lässt die Vermutung zu, dass die DUBs eine Rolle in der Herunterregulation der Cytokinantwort spielen (BAEK et al., 2001). Ein weiteres Bei­spiel dafür ist die Induktion der Transkription von CYLD durch den NuclearFactor kappa-light-chain-enhancerofactivated B-cells-Signalweg (siehe Kapitel 2.5).

Auch die Lokalisation der DUBs spielt eine Rolle in der Regulation ihrer Spezifität. ULP1 z.B. besitzt eine N-terminale Domäne, die das Enzym zur Kernhülle lotst, wo es mit spezifischen Kernhüllensubstraten reagiert. Dies schränkt die Isopeptidase- aktivität von ULP1 ein, sodass ULP1 nicht unspezifisch cytoplasmatische Substrate angreift. Weiterhin wurden einige DUBs identifiziert, die mit Membranen interagieren und Membran-assoziierte zelluläre Prozesse regulieren, obwohl sie selbst nicht in der Membran verankert sind (KINNER et al., 2003).

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