Die Umsatzrate der AMP-Desaminase im Meerschweinchenherzen

Inhalt

1 Einleitung
1.1 Allgemeines
1.2 Kardialer Adenosin- und Adenin-Nukleotid-Stoffwechsel
1.3 Enzyme im Adenosin- und Adenin-Nukleotid-Stoffwechsel
1.3.1 AMP-Desaminase (EC 3.5.4.6)
1.3.1.1 Enzymkinetik
1.3.1.2 Effektoren der AMP-Desaminase
1.3.1.3 Regulation der AMP-Desaminase-Aktivität
1.3.2 5´-Nukleotidase (EC 3.1.3.5)
1.3.3 Adenosin-Desaminase (EC 3.5.4.4)
1.3.4 Purin-Nukleosid-Phosphorylase (EC 2.4.2.1)
1.3.5 Xanthin-Oxidase (EC 1.3.2.3)
1.3.6 Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.8)
1.4 Inhibition der am Purin-Stoffwechsel beteiligten Enzyme
1.5 Fragestellung

2 Material und Methoden
2.1 Modelle
2.1.1 Isolierte Perfusion nach Langendorff
2.1.1.1 Präparation
2.1.1.2 Versuchsanlage
2.1.1.3 Generelle Versuchsdurchführung
2.1.2 Enzymaktivität im Gewebehomogenat
2.1.3 Isolierte Kardiomyozyten
2.2 Inhibitoren
2.2.1 Inhibition der Adenosin-Desaminase durch EHNA
2.2.2 Inhibition der Xanthin-Oxidase durch Allopurinol
2.2.3 Inhibition der AMP-Desaminase durch GP 3521 und GP 3449
2.2.4 Inhibition der Adenosin-Desaminase und AMP-Desaminase durch Coformycin
2.2.5 Methotrexat
2.3 Protokolle und Fragestellungen
2.3.1 Abschätzung der Umsatzrate der AMP-Desaminase unter verschiedenen Bedingungen
2.3.1.1 EHNA und Allopurinol
2.3.1.2 GP 3521
2.3.1.3 Effekte von GP 3521 unter hypoxischen Bedingungen
2.3.1.4 Purinfreisetzung unter GP 3449 und EHNA
2.3.1.5 Abschätzung der Umsatzrate der AMP-Desaminase unter Coformycin
2.3.2 Einfluss der Purin-de-novo-Synthese
2.3.3 Hemmbarkeit der AMP-Desaminase im myokardialen Gewebeextrakt
2.3.4 Myokardialer Nukleotid- und Nukleosidgehalt nach Ischämie
2.3.5 Zellpermeabilität von Kardiomyozyten
2.4 Analytische Methoden
2.4.1 Probenaufbereitung
2.4.1.1 Probenaufbereitung für die HPLC zur Bestimmung von Adenosin, Inosin, Hypoxanthin, Xanthin und Harnsäure
2.4.1.2 Gewebeextraktion
2.4.1.3 Probenaufbereitung der Kardiomyozyten
2.4.2 HPLC-Analyse
2.4.2.1 Bestimmung der Purine
2.4.2.2 Bestimmung der Nukleotide
2.4.2.3 Bestimmung von GP 3521 in isolierten Kardiomyozyten
2.5 Auswertung und Statistik

3 Ergebnisse
3.1 Inosin- und Hypoxanthin-Freisetzung in Normoxie und Hypoxie zur Bestimmung der Umsatzrate der AMP-Desaminase
3.2 Bedeutung der Purin-de-novo-Synthese
3.3 Direkte Inhibition der AMP-Desaminase zur Bestimmung der Umsatzrate
3.3.1 Effizienz der Inhibitoren
3.3.1.1 AMP-Desaminase-Kinetik unter Coformycin
3.3.1.2 Hemmung der isolierten AMP-Desaminase durch GP 3521
3.3.2 Effekte von Coformycin und GP 3521 auf die Purinfreisetzung
3.3.2.1 Purinfreisetzung in Normoxie unter Coformycin
3.3.2.2 Purinfreisetzung unter GP 3521
3.3.2.3 Purinfreisetzung in Hypoxie unter GP 3521 und EHNA
3.3.3 Wirkung von GP 3521 in globaler Ischämie
3.3.4 GP 3521 Permeabilität
3.3.5 Purinfreisetzung unter GP 3449
3.3.6 Wirkung von GP 3449 bei globaler Ischämie

4 Diskussion
4.1 Bedeutung der myokardialen AMP-Desaminase
4.2 Direkte Inhibition der AMP-Desaminase zur Bestimmung der Umsatzrate
4.3 Abschließende Betrachtung

5 Literaturverzeichnis

6 Zusammenfassung

7 Danksagung

1 Einleitung

1.1 Allgemeines

1963 stellten Berne und Gerlach et al. unabhängig voneinander die Adenosin-Hypothese auf, die besagt, dass Adenosin die Koronardurchblutung der kardialen Stoffwechselsituation anpasst (3;26). Bei abfallender kardiomyozytärer Sauerstoffspannung - so die Hypothese - wird Adenosin freigesetzt und gelangt durch das Interstitium an die Adenosin-Rezeptoren der glatten Muskulatur der Koronargefäße, um dort eine Vasodilatation zu bewirken. Die dadurch gesteigerte Koronardurchblutung führt zu einer Wiederherstellung der normalen Sauerstoffspannung.

Es konnte in mehreren Studien der koronardilatatorische Effekt von Adenosin gezeigt werden (31;57;62). Heute wissen wir, dass eine Vasodilatationüber A2-Rezeptoren der glatten Muskelzellen vermittelt wird. Es gibt allerdings auch Hinweise, dass der vasodilatatorische Effekt von Adenosin auchüber A2-Rezeptoren des Endothels vermittelt wird (57). Stepp und Mitarbeiter untersuchten die Dosis-Wirkungs-Beziehung von interstitiellem Adenosin zur Koronardurchblutung und stellten fest, dass bereits eine Erhöhung der interstitiellen Adenosin-Konzentration um 62 % zu einer halbmaximalen Erhöhung der Koronardurchblutung führte. Dabei wurde kein Hinweis für eine sekundäre Aktivierung eines möglichen Vasodilatators durch endotheliale Adenosin-Rezeptoren gefunden (75). Allerdings scheint Adenosin unter physiologischen Bedingungen keine Rolle bei der koronaren Flussregulation zu spielen. So führte ein um das 4-fache gesteigerter Sauerstoffverbrauch bei Hunden unter körperlicher Belastung zwar zu einem Anstieg der interstitiellen Adenosin- Konzentration, aber nicht in den Maßen, dass eine koronarvasodilatatorische Wirkung herbeigeführt werden könnte (84). Bei belastungsinduzierter O2-Mangelversorgung fällt der ATP-Gehalt kaum ab und die Adenosin-Konzentration steigt stark an, während es bei Okklusion und ATP-Katabolismus rasch zu einem ATP-Abfall und erheblichen Zunahmen von Adenosin kommt. Die Adenosin-Freisetzung scheint also nicht vom myokardialen Sauerstoffumsatz abhängig zu sein (49). Auch bei Inhibition der NO-Synthese kommt es nicht zu einer kompensatorischen koronaren Vasodilatation durch Adenosin. Die unter physiologischen Bedingungen gebildeten NO-Mengen haben nur eine moderate koronarvasodilatatorische Wirkung (83).

Adenosin zeigt eine antiadrenerge Wirkung am oxygenierten Herzen (21). Dieser Effekt wird über inhibitorische A1-Rezeptor-Subtypen vermittelt. Dadurch wird der Phosphorylierungsstatus regulatorischer Proteine beeinflusst (58). Neuere Studien zeigen eine verstärkende Wirkung von A2a-Rezeptoren auf die von A1-Rezeptoren-vermittelten antiadrenergen Effekte (59). Adenosin spielt weiterhin bei der Präkonditionierung des Myokards eine Rolle. Präkonditionierung im Sinne der ischämischen Präkonditionierung bedeutet, dass eine reversible Schädigung des Myokards durch kurze ischämische Phasen zu einer Ausbildung einer Kardioprotektion bei einer späteren irreversiblen Schädigung, also einem Myokardinfarkt führt. Bei Kaninchen wird bei gleichzeitiger Infusion eines Adenosin- Antagonisten und eines Į1-Antagonisten der präkonditionierende Effekt aufgehoben (13).

1.2 Kardialer Adenosin- und Adenin-Nukleotid-Stoffwechsel

Unter physiologischen Bedingungen stehen mitochondriale ATP-Bildung und der zytosolische ATP-Verbrauch im Gleichgewicht. Substrate werden unter Sauerstoffverbrauch oxidiert, um die notwendige Energie für die Synthese von ATP aus ADP und Pi bereitzustellen. Bei der hydrolytischen Spaltung von ATP zu ADP und anorganischem Phosphat wird dann wiederum Energie frei, die fast alle energieabhängigen zellulären Prozesse treibt. Unter physiologischen Bedingungen werden die Konzentrationen von ATP (6-8 mM), Pi (1-2 mM), ADP (40 µM), AMP (200 nM) und Adenosin (ca. 50 nM) in etwa konstant gehalten. Übersteigt der Verbrauch das Angebot, oder kommt es bei einer plötzlichen Ischämie zu einem rapiden katabolen Abbau der energiereichen Phosphate, dann nimmt die ATP-Konzentration ab, und es kommt zu einem raschen und dramatischen Anstieg von ADP, AMP, Adenosin und weiteren Metaboliten des Purin-Stoffwechsels (15).

In Kardiomyozyten wurden für den weiteren Abbau zu den Purinen und deren Katabolite zwei Wege beschrieben: Zum einen der Abbau von AMPüber die AMP-spezifische 5´- Nukleotidase (EC 3.1.3.5, cN-I) zu Adenosin (Adenosin-Weg) und zum anderen der Abbauwegüber die AMP-Desaminase (EC 3.5.4.6) zu IMP und nachfolgendüber die IMPspezifische 5´-Nukleotidase (cN-II) zu Inosin (IMP-Weg) (Abb. 1.1).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.1: Adenosin- und Adenin-Nukleotid-Stoffwechsel und beteiligte Enzyme. ADA: Adenosin-Desaminase, AMPDA: AMP-Desaminase, AK: Adenosin-Kinase, 5´NT: 5´- Nukleotidase, XOD: Xanthin-Oxidase, HGPRT: Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl- Transferase

Die Nukleoside Adenosin und Inosin werdenüber membranständige Transportsysteme der Kardiomyozyten in das Interstitium freigesetzt. Von dort diffundieren sie in die myokardialen Kapillaren, um dann in die koronarvenösen Gefäße abtransportiert zu werden. In den Endothelzellen werden die Nukleoside auch zu ihren Kataboliten Hypoxanthin, Xanthin und Harnsäure (Urat) abgebaut. Da die Endothelzellen auch eine hohe Adenosin-Desaminase- Aktivität aufweisen, wird auch hier ein Teil des (extrazellulär von Kardiomyozyten gebildeten) Adenosin zu Inosin abgebaut. Die Katabolite gelangen dann ebenfalls in das koronarvenöse System (71).

Unter normoxischen Bedingungen ist die AMP-Hydrolyse der Hauptstoffwechselweg für die Produktion des kardialen Adenosins. Daneben spielt die SAH-Hydrolase (47) und die zytosolische 5´-Nukleotidase (9;33) eine geringe Bedeutung bei der Bildung von Adenosin.

Mehr als 90% des kardial produzierten Adenosins werdenüber die Adenosin-Kinase zu rephosphoryliert (sogenannter Adenosine Salvage) (47).

Die globale kardiale Adenosin-Bildungsrate beträgt z.B. im Meerschweinchenherzen etwa 2.3 nmol - min-[1] - g-[1], dabei werden etwa 8% des Adenosins extrazellulär gebildet. Unter physiologischen Bedingungen wird weniger Adenosin koronarvenös freigesetzt als extrazellulär gebildet, und dementsprechend liegt ein Konzentrationsgradient in Richtung Zytosol vor. Das Endothel trägt 5% zum global gebildeten Adenosin bei. Deussen et al. postulieren, dass dennoch die vaskuläre Adenosin-Konzentrationüber einen großen Bereich vom Endothel reguliert wird (19;20).

Sinkt das myokardiale O2-Angebot, so wurde ein gleichzeitiger Anstieg der Adenosin- Freisetzung und des freien AMP beobachtet (35). Dies ist bedingt durch die eingeschränkte und unterbrochene oxidative Phosphorylierung, die bei fortbestehendem ATP-Abbau einen Anstieg der ADP- und AMP-Konzentration zwangsläufig zur Folge hat. Dabei ist die Konzentration von AMP, dem unmittelbaren Vorläufer des Adenosins, von entscheidender Bedeutung für den Umsatz sowohl der AMP-Desaminase als auch der AMP-spezifischen 5´- Nukleotidase. Bisher wurde angenommen, dass die 5´-Nukleotidase in Hypoxie aktiviert wird und es zu einer vermehrten Adenosin-Bildung kommt (29;33). Die Aktivität der 5´- Nukleotidase wird wahrscheinlich durch ADP und vor allem durch Mg[2]+ reguliert (14;53;72).

In unserem Labor konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass bei moderater Hypoxie (40% O2) das freie AMP und die Adenosin-Bildung um das 4-fache, die koronarvenöse AdenosinFreisetzung hingegen um das 15-20-fache anstieg. Weitere Versuche zeigten eine Hemmung der Adenosin-Kinase in Hypoxie, deren Ausmaß mit Hilfe eines mathematischen Modells abgeschätzt werden konnte. Vermehrte Adenosin-Bildung bei reduzierter Rephosphorylierung führte dann zu einer deutlich gesteigerten Adenosin-Freisetzung. Da die Metabolisierung von AMP zu Adenosin einem hohen Umsatz unterliegt, führen bereits kleine Änderungen des freien AMP rasch zu einer verstärkten Freisetzung von Adenosin (18).

1.3 Enzyme im Adenosin- und Adenin-Nukleotid-Stoffwechsel

Im Adenosin- und Adenin-Nukleotid-Stoffwechsel haben die nachfolgenden Enzyme eine Bedeutung:

AMP-Desaminase (EC 3.5.4.6): AMP →

AMP-spezifische 5´-Nukleotidase (EC 3.1.3.5): AMP → Adenosin

SAH-Hydrolase (EC 3.3.1.1): S-Adenosyl-L-Homocystein → Adenosin Adenosin-Desaminase (EC 3.5.4.4): Adenosin → Inosin Adenosin-Kinase (EC 2.7.1.2): Adenosin →

Purin-Nukleosid-Phosphorylase (EC 2.4.2.1): Inosin → Hypoxanthin

Xanthin-Oxidase (EC 1.3.2.3): Hypoxanthin → Xanthin → Urat

Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.8): Hypoxanthin →

1.3.1 AMP-Desaminase (EC 3.5.4.6)

Die AMP-Desaminase spielt eine zentrale Rolle bei der Umwandlung von Adenosin- Nukleotiden zu Inosin und Guanin-Nukleotiden, bei der Stabilisierung des Adenylat- Energiehaushalts und bei Reaktionen des Purin-Nukleotid-Kreislaufs. Sie katalysiert die irreversible hydrolytische Desaminierung von 5´-AMP zu eqimolaren Anteilen von 5`-IMP und Ammoniak (88).

Die AMP-Desaminase ist durch eine Multigenfamilie bei Nagern und Mensch charakterisiert. Im menschlichen Gewebe konnten vier Isoenzyme der AMP-Desaminase isoliert werden. Die Benennung richtet sich nach den Geweben, aus denen sie ursprünglich isoliert wurden: M (Muskel), L (Leber), E1 und E2 (Erythrozyten) (61). Mit Ausnahme der E-Isoformen bestehen nur schwache oder gar keine Kreuzreaktivitäten zwischen den AMPD-Isoenzymen. Das Isoenzym E2 konnte zwar mittels Chromatographie und Elektrophorese vom Isoenzym E1 getrennt werden, es konnte jedoch später gezeigt werden, dass 3 Isoformen auf das AMPD3-Gen, dass die Erythrozyten-AMP-Desaminase kodiert, durch alternatives Spleißen zurückzuführen sind (52). In der Skelettmuskulatur verschiedener Spezies konnten immunologisch drei verschiedene Isoenzyme isoliert werden (23). Es sind bei Ratten drei verschiedene Isoenzyme (A, B, C) der AMP-Desaminase bekannt. Diese wurden in Muskulatur (A), Leber, Niere (B) und Herz (C) gefunden und zeichnen sich durch unterschiedliche kinetische, physikalische und immunologische Eigenschaften aus (60). Die Proteinprodukte des AMPD1- und AMPD2-Gens von Ratte und Mensch zeigen eine Kreuzreaktivität. Das AMPD1-Gen produziert Transkripte, die für die Ratten-Isoform A und die humane Isoform M kodieren, das AMPD2-Gen produziert Transkripte, die die Ratten- Isoform B und die humane Isoform M kodieren (56). Die cDNA für das AMP-Desaminase Gen der Herzisoform bei Mäusen ähnelt in der kodierenden Region der Erythrozytenisoform des humanen AMP-Desaminase-Gens und ist bei Mäusen auf Chromosom 7 lokalisiert (87).

Beim Menschen geht ein Mangel an muskulärer AMP-Desaminase mit Muskelschwäche und Krämpfen einher. So beschrieben Fishbein et al. 1978 in fünf Fällen ein isoliertes vererbbares AMPD-Mangel-Syndrom (22). Bei Herzinsuffizienz wurde eine Assoziation zwischen der Existenz einer AMPD1-Mutation und einer erhöhten Wahrscheinlichkeit eines Überlebens ohne Herztransplantation festgestellt, wobei der Mechanismus unbekannt ist, der hier offenbar zu einer Kardioprotektion führt (50).

1.3.1.1 Enzymkinetik

Die Enzymkinetik der AMP-Desaminase wurde bereits eingehend bei verschiedenen Spezies untersucht. Das pH-Optimum für die AMP-Desaminase von Rattenherzen liegt bei pH=6.8, die Molekularmasse beträgt 81 kDa. Strukturell gesehen ist die AMP-Desaminase ein Tetramer. In Gegenwart von 100 mM KCl zeigt das Enzym eine sigmoidale Substrat- Sättigungskurve. Die Michaelis-Konstante liegt bei KM=5.8 mM (AMP) und die Maximalgeschwindigkeit beträgt Vmax = 11.1 µmol - min-[1] - mg protein-[1] (81).

Vergleichende Studien der Kinetik der kardialen AMP-Desaminase von Ratte und Mensch zeigen, dass die Maximalgeschwindigkeit (Vmax) bei Ratten etwa doppelt so hoch und die Michaelis-Konstante (KM) bei Menschen etwa 2.5-fach höher ist (79). In einer anderen Studie wurde die Aktivität der kardialen AMP-Desaminase bei der Ratte 9-fach höher als die der AMP-Desaminase beim Menschen angegeben (46).

1.3.1.2 Effektoren der AMP-Desaminase

In bisherigen Studien wurden in vitro mögliche Effektoren der AMP-Desaminase untersucht, die die Aktivität des Enzyms modulieren könnten. Ob diese Effektoren tatsächlich in vivo eine Rolle spielen, oder ob die Umsatzrate der AMP-Desaminase durch andere Mechanismen reguliert wird, wurde bisher nicht abschließend geklärt.

Thakkar et al. untersuchten an gereinigter AMP-Desaminase von Kaninchenherzen die Protein-Kinase-C-vermittelte Phosphorylierung. Unter diesen Bedingungen zeigten sie, dass eine Phosphorylierung der AMP-Desaminase zu einer deutlichen Reduzierung des KM-Werts von 5.6 mM auf 1.2 mM ohne Einfluss auf Vmax führte. Sie zogen daraus den Schluss, dass die Umsatzrate der AMP-Desaminase von einem Phosphorylierungs- Dephosphorylierungsmechanismus abhängig sein muss (82). Unter phosphatfreien Bedingungen beim Kaninchenherzen zeigt die AMP-Desaminase eine irreversible Konvertierung in ein Pseudoisoenzym mit anderen kinetischen, regulatorischen und stabilisierenden Eigenschaften. Die Michaelis-Konstante ist dabeiüberraschenderweise um das 10-fache kleiner (KM=0.54 mM AMP) als mit Phosphat, die maximale Aktivität beträgt Vmax=1.4 µmol - min-[1] - mg protein-[1] (80).

Hu et al. zeigten ebenfalls, dass in adulten Rattenkardiomyozyten die Aktivität der AMP- Desaminase durch Protein Kinase C erhöht wird. Der gleiche Effekt wurde auch durch alpha- adrenerge Stimulation und cAMP hervorgerufen (38). Die gleiche Arbeitsgruppe postulierte, dass intrazelluläres Adenosin durch einen unbekannten Mechanismus die IMP-Produktion von adulten, isolierten Rattenmyozyten um das 2-fache erhöht, wobei ein direkter Effekt von Adenosin auf die AMP-Desaminase, eineüber Adenosin-Rezeptoren vermittelte Modulation und ein Einfluss des Transmethylierungsweges ausgeschlossen wurden (39).

Die AMP-Desaminase von Kaninchenherzen wird durch ATP und ADP allosterisch aktiviert. Der KM-Wert sinkt dann auf 1.7 mM. Das Enzym wird durch GTP, Coformycin, Coformycin- 5´-Phosphat, Palmitoyl-CoA, inorganische Phosphatverbindungen und dem Metall-Chelator o-Phenantrolin inhibiert. Es wurde keine Inhibition durch IMP oder Nikotinamid-Nukleotiden festgestellt (81).

1.3.1.3 Regulation der AMP-Desaminase-Aktivität

Auch wenn bisher kein umfassendes Modell der Regulation der AMP-Desaminase entwickelt wurde, so gibt es doch zahlreiche Einzelbefunde: Auf zellulärer Ebene wurden verschiedene Modelle verwendet, um den Einfluss von oxidativem Stress auf die molekularen, kinetischen und regulatorischen Eigenschaften der AMP-Desaminase zu untersuchen. So wurde ein Oxidationssystem bei der kardialen AMP-Desaminase von Kaninchen verwendet. Wenn die AMP-Desaminase oxidativem Stress ausgesetzt wird, sinkt die Enzymaktivität innerhalb von 5 Minuten um das 7-fache, nach 15 Minuten kommt es zu einer irreversiblen Inaktivierung. Durch den oxidativen Stress kommt es zu keiner Veränderung der molekularen Masse, tetrameren Struktur, des KM-Wertes, der Immunreaktivität und trypsinolytischer Muster. Die Autoren vermuten, dass es zu einer Konversion der Thiol-Bindungsstellen in einen stabilen höher oxidativen Zustand kommt, da die AMP-Desaminase sensibel auf die S-Thiolierung und Thiol-Alkylierung reagiert (41).

Ein anderes Modell untersuchte die Aktivität der AMP-Desaminase adulter Rattenkardiomyozyten, indem eine rasche ATP-Depletion herbeigeführt wird (rapid deenergization). Die Befunde lassen den Schluss zu, dass die AMP-Desaminase durch Produkte der anaeroben Glykolyse reguliert wird. Die IMP-Produktion in Zellen, deren Zellatmung vor der ATP-Depletion nicht inhibiert worden war, lag 4-fach höher als in Zellen, deren ATP-Gehalt erhalten blieb, aber einer anaeroben Glykolyse unterlagen. Weiterhin führte eine alpha-adrenerge Stimulation, wie in anderen Studien auch, zu einer Stimulation der AMP-Desaminase (37).

Die gleiche Arbeitsgruppe zeigte in dem gleichen Modell an Kardiomyozyten von neugeborenen Schweinen, dass die Aktivität der AMP-Desaminase vom hormonellen und metabolischen Status der Zellen vor der ATP-Depletion abhängt. Die Vorbehandlung der Zellen mit Adenosin führt zu einem höheren Umsatz von AMP zu IMP. Dies könnte laut Autoren bei der Präkonditionierung eine Rolle spielen. Weiterhin konnte in dieser Studie eine gesteigerte IMP-Produktion durch den Protein-Kinase-C-Inhibitor Staurosporin zu 90% inhibiert werden, der beta-adrenerge Agonist Isoproterenol stimulierte die AMP-Desaminase und der cAMP-Spiegel korrelierte mit der IMP-Bildung (36).

Bei retrograd perfundierten, isolierten Kaninchenherzen führte eine Mangelperfusion zu einer Abnahme der AMP-Hydrolyse. Dies wurde auf eine geringere Aktivität der zytosolischen 5´- Nukleotidase zurückgeführt, die auch nicht durch eine zusätzliche hypoxische Minderperfusion reaktiviert wurde. Im venösen Effluat wurden 30% weniger Purine als erwartet gefunden. Daraus schlossen die Autoren, dass die AMP-Hydrolyse zu Adenosin bei früher Ischämie führend ist, in einer zweiten Ischämiephase kommt es dann zu einer Inhibition der AMP-Hydrolyse, anscheinend - so die Interpretation - durch die Akkumulation von IMP (28).

In einem Rattenherz-Modell mit 2-Deoxy-D-Glucose-Perfusion mit einem niedrigen Gehalt an Pi wurde eine hohe Freisetzung von Inosin und eine niedrige Freisetzung von Adenosin festgestellt. Der Beitrag des IMP-Abbauweges liegt bei 97%. Im Gegensatz dazu steht das anoxische Modell, das sich durch einen hohen Gehalt an Pi auszeichnet. Hier werden gleich hohe Anteile von Adenosin und Inosin gefunden. Der IMP-Abbauweg hat dabei einen Anteil von 23% und der Adenosin-Abbauweg einen Anteil von 77%. Daraus wurde gefolgert, dass Pi die AMP-Desaminase im anoxischen Herzen inhibiert (11;12). Die genannten Studien lassen aber offen, welchen Beitrag die AMP-Desaminase zum AMP-Stoffwechsel in vivo leistet, und welche Bedeutung sie bei moderater Einschränkung des O2-Angebotes hat.

1.3.2 5 ´ -Nukleotidase (EC 3.1.3.5)

Im Myokard von Säugetieren existieren zwei unterschiedliche 5´-Nukleotidase-Systeme, von denen eine Isoform membranständig (ekto) und die andere löslich zytosolisch aktiv ist (53). Es konnten in einer Studie bei verschiedenen Spezies (Ventrikelmyokard vom Menschen, Kaninchen, Meerschweinchen, Tauben, Ratten und Schildkröten) erhebliche Unterschiede in den Aktivitäten sowie Verteilungen der 5´-Nukleotidase festgestellt werden (55).

Die globale kardiale Adenosin-Bildungsrate liegt, wie bereits oben erwähnt, in Meerschweinchenherzen bei 2.3 nmol - min-[1] - g-[1], davon werden etwa 8% des Adenosins extrazellulär durch die 5´-Nukleotidase gebildet und 70% werden in die zellulären Regionen aufgenommen. Neuere Studien unseres Labors konnten an intakten Meerschweinchenherzen mittels [31]P-NMR-Messung zeigen, dass die Umsatzrate der 5´-Nukleotidaseüber die freie zytosolische AMP-Konzentration reguliert wird (18). Frühere Studien anderer Gruppen interpretierten den massiven Anstieg der Purinnukleosidfreisetzung in Hypoxie oder Ischämie dahingehend, dass die Aktivität der 5´-Nukleotidase durch diese Stoffwechselsituationen reguliert wird (30;34). Es konnte jedoch in unserem Labor gezeigt werden, dass eine Hemmung der Adenosin-Kinase durch Hypoxie letztlich zu einem Anstieg der Purinfreisetzung führt (18). Desweiteren gilt Magnesium als ein allosterischer Effektor der 5´- Nukleotidase und verstärkt die Adenosin-Bildung. In Inhibitorstudien am isoliert perfundierten Meerschweinchenherzen wurde gezeigt, dass die durch Magnesium aktivierte Purinfreisetzung hauptsächlichüber die Ekto-5´-Nukleotidase katalysiert wird (53). Durch Inhibition der 5´-Nukleotidase mit alpha,beta-Methylen-Adenosin-5'-diphosphat (AOPCP, 50 µM) wurde die Purinnukleosidfreisetzung im venösen Effluat in Ischämie um 41% gesenkt (25). Dagegen konnte in unserem Labor mit Inhibition der 5´-Nukleotidase durch AOPCP ein etwa 10-facher Anstieg der Adenosin-Nukleotide unter basalen Bedingungen gesehen werden, während die Adenosin-Freisetzung unverändert blieb. In Hypoxie kam es zu einem 3-fachen Anstieg der Adeninnuklotidfreisetzung, aber zu einem 40-fachen Anstieg der Adenosin- Freisetzung (9).

1.3.3 Adenosin-Desaminase (EC 3.5.4.4)

Adenosin wird durch die Adenosin-Desaminase zu Inosin desaminiert. Decking und Mitarbeiter konnten zeigen, dass die Blockade der Adenosin-Desaminase am Meerschweinchenherzen durch EHNA zu einem 2.5-fachen Anstieg der Adenosin- Freisetzung in Normoxie führte. In Hypoxie wurde ein 3-facher Anstieg der Adenosin- Freisetzung beobachtet. Anhand eines mathematischen Modells wurde abgeschätzt, dass etwa 15% des gebildeten Adenosins (0.3 - 0.5 nmol - min-[1] - g-[1]) durch die Adenosin-Desaminase zu Inosin metabolisiert wird (18). Die Enzymaktivität liegt im Homogenat von Meerschweinchenherzen bei 2.7 µmol - min-[1] - g-[1].

1.3.4 Purin-Nukleosid-Phosphorylase (EC 2.4.2.1)

Die Purin-Nukleosid-Phosphorylase baut Inosin zu Hypoxanthin ab. Histochemische Untersuchungen haben eine hauptsächlich endotheliale Aktivität der Purin-Nukleosid- Phosphorylase gezeigt (8). Durch die Blockade des Enzyms mit 8-Aminoguanosin in Kardiomyozytenkulturen wird der Anteil von Inosin, der in die Nukleotide eingebaut wird, deutlich reduziert (90). Inosin wird also nach Ansicht der Autoren erst nach dem Abbau zu Hypoxanthin in IMP eingebaut.

1.3.5 Xanthin-Oxidase (EC 1.3.2.3)

Die Xanthin-Oxidase - ein Eisensulfat-Molybdän-Flavoprotein - vermittelt unter Oxidation die Metabolisierung von Hypoxanthin zu Xanthin und von Xanthin zu Harnsäure. Bei diesem Vorgang entstehen auch Superoxidradikale. Das Enzym wurde durch immunhistochemische Untersuchungen ausschließlich im Endothel von Kapillaren nachgewiesen (42).

Bei einem autosomal-rezessiv vererbten Defekt der Xanthin-Oxidase sinken beim Menschen die Harnsäurespiegel, während die Xanthin- und Hypoxanthinwerte im Blut und Harn ansteigen. Dadurch kann es zur Ausbildung von Xanthinnierensteinen kommen.

Das Endothel im mikrovaskulären Gefäßbett ist der Hauptort für die Entstehung von Harnsäure, da sich hier die Xanthin-Oxidase finden lässt. Das makrovaskuläre Endothel enthält hingegen keine Xanthin-Oxidase, so dass die Purine hier lediglich bis zu Hypoxanthin abgebaut werden. Das Enzym spielt eine bedeutende Rolle bei der Bildung von Sauerstoffradikalen nach der postischämischen Reperfusion im Myokard. Sauerstoffradikale tragen zur kontraktilen Dysfunktion nach Ischämie bei (27).

Diese Annahme konnte durch Inhibition der Xanthin-Oxidase bestätigt werden, da es bei Inhibition nach globaler Ischämie zu einer deutlichen Verbesserung der myokardialen Kontraktilität kam (32).

1.3.6 Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.8)

Die Purin-Basen Hypoxanthin und Guanin werden durch die HGPRT zu GMP oder IMP unter Freisetzung von Pyrophosphat wiederverwertet. Bei einem Defekt oder bei völliger Inaktivität des X-chromosomal kodierten Enzyms kommt es zu einer massiven PurinsyntheseSteigerung. Der Grund liegt imWegfall der allosterischen Hemmwirkung von IMP und GMP auf die Glutamin-PRPP-Amidotransferase, dem Schlüsselenzym der Purin-Biosynthese. Dieses als Lesch-Nyhan-Syndrom bekannte Krankheitsbild führt zu schweren zentralnervösen Störungen, Hyperurikämie und Nierensteinleiden.

In Kulturen schlagender Kardiomyozyten wurde eine hohe Aktivität der HGPRT beobachtet, wodurch der Anteil des Hypoxanthin, der zu IMP wiederverwertet wird, denjenigen Anteil der zu Xanthin und Harnsäure abgebaut wird, sogarübersteigt (90). Dieser Befund widerspricht allerdings einer früheren Studie der gleichen Arbeitsgruppe, bei der eine langsame Wiederverwertung von Hypoxanthin zu IMP beobachtet wurde (91).

1.4 Inhibition der am Purin-Stoffwechsel beteiligten Enzyme

Wie bereits zuvor in Kap. 1.2, Abb. 1.1 dargestellt, wird AMP einerseitsüber die AMP- Desaminase zu IMP und anschließendüber die IMP-spezifische Isoform der 5´-Nukleotidase (cN-II) zu Inosin metabolisiert. Andererseits wird AMPüber die AMP-spezifische 5´- Nukleotidase (cN-I) zu Adenosin und daraufhinüber die Adenosin-Desaminase ebenfalls zu Inosin abgebaut. Die Bedeutung dieser beiden Metabolisierungswege kann durch die effektive Blockade der beteiligten Enzyme bestimmt werden. Bei Blockade der ADA wird Inosin nicht mehr aus Adenosin, sondern ausschließlich aus IMP gebildet. Zwar hat die Blockade der ADA einen Anstieg der Adenosin-Konzentration, und damit sowohl der Adenosin- Freisetzung als auch der Adenosin-Rephosphorylierung zur Folge. Aber angesichts der hohen Umsatzrate der Myokinase-Reaktion dürfte die AMP-Konzentration nur wenig verändert werden, und die Umsatzrate der AMP-Desaminase ebenfalls. Die Freisetzungsrate von Inosin ist somit direkt von der Umsatzrate der AMP-Desaminase abhängig. Inosin wird im Regelfall weiter zu Hypoxanthin, Xanthin und Harnsäure abgebaut, wobei Xanthin aber auch aus Guanin gebildet werden kann. Blockiert man nun den Umsatz von Hypoxanthin und Xanthin, also die Xanthin-Oxidase, so sollte die Freisetzung von Inosin und Hypoxanthin ausschließlich von dem Abbau von IMP zu Inosin abhängen, und somit ein quantitativ verlässliches Maß für die Umsatzrate der AMP-Desaminase sein. Um die Umsatzrate der AMP-Desaminaseüber die koronarvenöse Inosin- und Hypoxanthin-Freisetzung bestimmen zu können, wurde die Adenosin-Desaminase mit EHNA und die Xanthin-Oxidase mit Allopurinol blockiert. Die Versuche erfolgten in Normoxie und Hypoxie (40% O2). Eine spezifische Blockade der AMP-Desaminase wurde mit Coformycin und den Coformycin- Analoga GP 3521 und GP 3449 durchgeführt. Um den Einfluss der Purin-de-novo-Synthese zuüberprüfen, wurde Methotrexat, das die Aktivität der Dihydrofolatreduktase und damit die Bildung von Tetrahydrofolat hemmt, eingesetzt. Tetrahydrofolat spielt eine wichtige Rolle bei der Purin-Biosynthese.

1.5 Fragestellung

Der Anteil des IMP-Weges und die damit verbundene Bedeutung der AMP-Desaminase in Normoxie und Hypoxie ist bisher Gegenstand der Diskussion und wurde nicht abschließend geklärt. Um diesen Stoffwechselweg zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Arbeit am isolierten, retrograd perfundierten Meerschweinchenherzen Inhibitoren der im Adenin- Nukleotid-Stoffwechsel beteiligten Enzyme sowie direkte Inhibitoren der AMP-Desaminase verwendet und die Purine und deren Metabolite im koronarvenösen Effluat mittels HPLC bestimmt.

Da die Bildung von IMP aus AMP die Adenosin-Bildung tendenziell beeinträchtigt, aber zu keinem funktionell aktiven Metaboliten führt, ist diese Frage auch pharmakologisch von Bedeutung. Hemmung der AMP-Desaminase könnte in Hypoxie/Ischämie die Bildung von Adenosin mit seinen kardioprotektiven Wirkungen potenzieren und so ein attraktives therapeutisches Prinzip sein. Die quantitative Bedeutung der AMP-Desaminase soll daher in der vorliegenden Arbeit untersucht werden.

2 Material und Methoden

2.1 Modelle

2.1.1 Isolierte Perfusion nach Langendorff

2.1.1.1 Präparation

Meerschweinchen (300 - 400 g) wurden mit einem Schlag auf das Genick getötet und auf einem OP-Tisch fixiert. Nach dem Bauchschnitt wurde der Brustkorb eröffnet und das Herz freipräpariert. Das schlagende Herz wurde sofort mit einer eisgekühlten physiologischen Kochsalzlösung stillgestellt, die Aorta ascendens unter Sicht aufgesucht und distal der Abgänge der Herzkranzgefäße durchtrennt. Durch leichte Massage des Herzens wurden restliche Luftblasen aus der Aorta entfernt. Die Aorta wurde dann kanüliert, an die Versuchsanlage gehängt und retrograd mit einem Krebs-Henseleit-Medium (NaCl 116, KCl 4.63, KH2PO4 1.18, Mg2SO4 1.1, NaHCO3 24.9, Glukose Monohydrat 8.32, Pyruvat 2.0, CaCl2 2.52 mmol/l, 37°C, pH 7.4, >30 Minuten mit Carbogen begast) bei einem Perfusionsdruck von 70 cm H2O perfundiert. Das Perikard wurde anschließend entfernt und die Mitralklappe eingeschnitten, umüber den linken Vorhof einen Latexballon (Größe 5) in den linken Ventrikel einzuführen. Darüber wurde mit einem Druckaufnehmer der linksventrikuläre Druck aufgezeichnet. Das Herz wurdeüber je eine Nadelelektrode im linken Herzohr und im linken Ventrikelmyokard mit einer Frequenz von 300 - min-[1] stimuliert. Der Perfusionsdruck wurde unmittelbar oberhalb der Aorta abgeleitet. Der koronare Fluss wurde mit einem Flowmeter (T 208 Transonic Volume Flowmeter, Transonic Systems Inc.), der linksventrikuläre Druck (mmHg), die hieraus abgeleitete Herzfrequenz (min-[1]) und der Perfusionsdruck (mmHg)über einen Schreiber (WK-821-AR, Wekagraph) kontinuierlich graphisch registriert. Eine Gasmischpumpe diente der Kontrolle der Begasung des hypoxischen Mediums.

2.1.1.2 Versuchsanlage

Wie in Abbildung 2.1 zu sehen, war das Herz mit der Aorta an der Kanüle der Langendorff- Anlage fixiert und wurde mit Medium perfundiert. Das Medium befand sich in einem Perfusionsrohr, das mit einer Vorratsflasche verbunden war. Um das Herz ständig mit einem Perfusionsdruck von 70 cm H2O zu perfundieren, wurde der Perfusionsdruck in der dicht abgeschlossenen Vorratsflasche durch Begasung aufgebaut, die Höhe des Drucks wurde durch ein Steigrohr eingestellt. Um eine konstante Temperatur von 37° C zu gewährleisten, war das Herz selbst von einem temperierten Glasmantel umschlossen, die mit Medium gefüllte Vorratsflasche und das Perfusionsrohr befanden sich in einem temperierten Wärmebad. Das Medium wurde im Perfusionsrohr und in der Vorratsflasche mit einem normoxischen Gasgemisch (95 % O2, 5% CO2) äquilibriert. Um während der Versuche von normoxischen auf hypoxische Bedingungen umschalten zu können, wurde ein zweites Perfusionsrohr und eine zweite Vorratsflasche installiert, die mit einem hypoxisch äquilibrierten Medium (40% O2, 55% N2 und 5% CO2) gefüllt waren. Durch einen Umschalthebel konnte die Aortenkanüle mit diesem Perfusionsrohr verbunden werden. Mit einer Gasmischpumpe wurde das Gasgemisch des hypoxischen Mediums kontrolliert. Um von einer druckkonstanten zu einer flusskonstanten Perfusion wechseln zu können, wurde eine Rollerpumpe (Minipuls 3, Abimed Gilson) zwischen Aortenkanüle und Perfusionsrohr geschaltet.

Inhibitoren wurden mit einer Perfusorpumpe (Precidor, Infors AG, Basel) seitenständig infundiert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2.1: Versuchsaufbau: a) Perfusionsrohr, b) Vorratsflasche, c) Gasmischpumpe, d) Steigrohr, e) Perfusorpumpe, f) Rollerpumpe, g) perfundiertes Herz

2.1.1.3 Generelle Versuchsdurchführung

In der Einschlagphase mit druckkonstanter Perfusion erreichte der koronare Fluss innerhalb von 20 Minuten ein konstantes Niveau (Abb. 2.2). Die Herzen wurden darauf im Abstand von 5 Minuten zwei Ischämienüber jeweils 20 Sekunden ausgesetzt, um bei der sich anschließenden reaktiven Hyperämie die Reaktivität der Koronargefäße zuüberprüfen. Anschließend wurde auf eine flusskonstante Perfusion umgestellt, bei der das zuvor erreichte Flussniveau beibehalten wurde. Zu Beginn der Versuchsphase wurde die basale Purinfreisetzung in Normoxie bestimmt. Zu festgesetzten Zeitpunkten wurden die koronarvenösen Effluate aufgefangen. Die Sammelgefäße fassten circa 20 ml. Die Sammelzeit wurde protokolliert. Anschließend wurden wie unten beschrieben (s. 2.3.1, 2.3.2) einzelne Enzyme selektiv gehemmt, oder nach einer Ischämie definierter Dauer (s. 2.3.4) die Akkumulation von Adenosin-Nukleotiden und ihren Abbauprodukten im Myokard bestimmt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2.2: Allgemeiner Versuchsablauf, RH=reaktive Hyperämie nach 20 Sekunden Ischämie (schwarze Balken), B=basale Purinfreisetzung, ̣=Probennahme, PPconst=druckkontrollierte Perfusion, Flussconst=flusskontrollierte Perfusion

2.1.2 Enzymaktivität im Gewebehomogenat

Es wurde Meerschweinchenherzen wie unter 2.1.1.1 beschrieben präpariert. Die Herzen wurden fünf Minuten retrograd mit normoxischem Krebs-Henseleit-Puffer gespült. Darauf wurden die Herzen in jeweils 9 ml kalten Inkubationspuffer (20 mmol/l TrisHCl, pH 7.0, 150 mmol/l KCl, 1 mmol/l Dithiothreitol) mit einem Mixer (Ultra Thurrax) homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 8000 U/min bei 4° C 20 min. zentrifugiert. Vom Überstand (8 - 10 ml) wurden 2.5 ml auf eine Sephadex PD-10 Chromatographie-Säule gegeben und eluiert. Das Volumen betrug anschließend 3.5 - 6.5 ml. Davon wurden pro Testansatz 50 µl entnommen. Der Testansatz bestand aus 50 µl der gereinigten Proteine, 400 µl Inkubationspuffer sowie 50 µl AMP in unterschiedlichen Konzentrationen. Die Testansätze wurden für 15 Minuten bei 37 °C inkubiert und das Enzym im Testansatz anschließend mit einem Säureextrakt (500 µl 2 mol/l HClO4) ausgefällt. Nach Zentrifugation wurde der Überstand neutralisiert (400 µl 2 mol/l K3PO4).

2.1.3 Isolierte Kardiomyozyten

Rattenkardiomyozyten wurden nach dem Protokoll von Stumpe und Schrader (1997) isoliert. Dazu wurden zwei Wistar-Ratten (250 - 350 g) mit Ether narkotisiert, die Herzen entnommen und retrograd mit einem modifizierten, Ca[2]+-freien Krebs-Henseleit-Puffer (NaCl 110, KCl 2.6, KH2PO4 1.2, Mg2SO4 1.2, NaHCO3 25, Glukose 11 mmol/l, Carbogen gesättigt) von Blut freigespült. Nach Zugabe von 0.025% Kollagenase und 13 µl 100 mmol/l Ca[2]+ wurden die Herzen bei 37°C für 40 Minuten rezirkulierend mit einem Volumen von ca. 100 ml perfundiert. Anschließend wurde das Herzgewebe mit einem Gewebehacker (Bachofer GmbH, Reutlingen) zerlegt und im kollagenasehaltigen Perfusat, dem 1% BSA (Fr. V, ICN- Flow, Meckenheim) zugegeben wurde, für 15 Minuten inkubiert. Vorsichtiges Pipettieren der Inkubationslösung (Ausüben von schwachen Scherkräften) unterstützte die Dissoziation der Zellen aus dem Gewebeverband. Die nachfolgenden Aufreinigungsschritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach Filtration der Zellsuspension durch Nylongaze (Maschenweite 200 µm) wurde das Filtrat 3 Minuten bei 20 g zentrifugiert, das Pellet mit den Kardiomyozyten in KHB mit 0.2 mmol/l Ca[2]+ resuspendiert und erneut zentrifugiert (3 Minuten, 20 g). Dieses Pellet wurde in KHB mit 0.5 mmol/l Ca[2]+ aufgenommen und auf KHB mit 1 mmol/l Ca[2]+ und 4% BSA aufgeschichtet. Nach erneuter Zentrifugation für 2 Minuten bei 10 g wurde der Bodensatz mit den Kardiomyozyten in 5 ml Inkubationspuffer (NaCl 137, KCl 5.4, NaH2PO4 1.0, Glukose 5.5, TRIS 5.0, MgSO4 0.8, CaCl2 2 mmol/l, pH 7.4) aufgenommen. Anschließend wurden die Kardiomyozyten mit dem Inhibitor inkubiert.

2.2 Inhibitoren

2.2.1 Inhibition der Adenosin-Desaminase durch EHNA

Erythro-9-(2-Hydroxy-3-nonyl)adenin (EHNA) ist ein potenter Inhibitor der AdenosinDesaminase. EHNA ist ebenfalls ein Inhibitor der cGMP-stimulierten Phosphodiesterase im Myokard von Schweinen und Mensch (64).

Der Inhibitor hat keinen Einfluss auf den kardialen Energiehaushalt und auf kardiale Adenosin-Rezeptoren (47). Bei Meerschweinchenherzen wurde eine effektive Blockade der Adenosin-Desaminase mit 5 µmol/L beobachtet (18;20;47).

Durch die Hemmung der Adenosin-Desaminase wird ein Anstieg der AdenosinFreisetzungsrate erwartet. Dies wurde auch schon in der Literatur in zahlreichen Studien bei unterschiedlichen Spezies beschrieben (11;12).

2.2.2 Inhibition der Xanthin-Oxidase durch Allopurinol

Allopurinol (Research Biochemicals International, Natick, MA, USA) ist ein potenter Inhibitor der Xanthin-Oxidase. Es findet seine medizinische Indikation als Urikostatikum bei der Therapie der Hyperurikämie.

Bei Blockade der Xanthin-Oxidase werden die Adenosin-Nukleotide und IMP nur bis Hypoxanthin abgebaut, und die Abbauprodukte der Guanin-Nukleotide als Xanthin freigesetzt. Damit ist eine Abschätzung des Einflusses des GMP-Abbaus auf die Gesamtpurinfreisetzungsrate möglich. Bei kombinierter Blockade der Adenosin-Desaminase und der Xanthin-Oxidase können wie schon oben beschrieben die koronarvenöse Inosin- und Hypoxanthin-Freisetzung als Maß für die Umsatzrate der AMP-Desaminase verwendet werden.

Zahlreiche Untersuchungen belegen die kardioprotektive Wirkung der Xanthin-Oxidase- Hemmung durch Allopurinol bei Ischämie und Reperfusion. Sie stützen die Hypothese, dass bei Reperfusion durch die Xanthin-Oxidase gebildete freie Radikale zum Reperfusionsschaden beitragen. So zeigte sich, dass Allopurinol die postischämische myokardiale Funktion verbessert, den myokardialen Schaden nach Ischämie und Reperfusion verringert (74) und gleichzeitig antiarrhythmische Effekte hat, ohne Einfluss auf den kardialen Energiestatus zu nehmen (29;32). Diese Effekte wurden bei eingesetzten Konzentrationen von 10-100 µmol/l gefunden, wobei eine spezifische Inhibition der Xanthin-Oxidase beim Meerschweinchenherzen bei einer Konzentration von 10 µmol/l zu erwarten ist (54).

2.2.3 Inhibition der AMP-Desaminase durch GP 3521 und

Bei GP 3521, das freundlicherweise von der Firma Gensia Pharmaceuticals, San Diego, USA, zur Verfügung gestellt wurde, handelt es sich um ein 3-Carboxy-Tetrahydronaphthylethyl- Coformycin-Aglycon-Analogon.

In verschiedenen Studien konnte an isolierten Zellen (Kaninchen-Erythozyten, Endothelzellen) gezeigt werden, dass GP 3521 rasch die Zellmembran permeiert und intrazellulär Konzentrationen erreicht, die ausreichen, um die AMP-Desaminase spezifisch und effektiv zu hemmen (Ki=15 nM). In Erythrozyten betrug die intrazelluläre Konzentration des Inhibitors nach 5 Minuten Inkubationszeit 65% der extrazellulären Konzentration (43).

Bei GP 3449 (308.15 g/mol), das ebenfalls von der Firma Gensia zur Verfügung gestellt wurde, handelt es sich um ein Derivat von GP 3521. Es zeichnet sich durch eine höhere Membrangängigkeit im Vergleich zu GP 3521 aus. Die inhibitorische Potenz ist mit Ki=200 nM niedriger als die von GP 3521 (Ito, B., Gensia).

Durch den Einsatz von GP 3521 und GP 3449 ist aufgrund der spezifischen und effektiven Hemmung der AMP-Desaminase eine Reduktion der IMP-Bildung und damit auch der Inosinund Hypoxanthin-Freisetzung im koronarvenösen Effluat zu erwarten.

2.2.4 Inhibition der Adenosin-Desaminase und AMP-Desaminase durch Coformycin

Coformycin (3-β-d-ribofuranosyl-6, 7, 8-trihydroimidazo 3,4-d diazepin-8(R)-ol) ist ein Inhibitor der Adenosin-Desaminase (17;69;77), bei mikromolaren Konzentrationen von Coformycin wurde aber auch eine inhibitorische Wirkung auf die AMP-Desaminase mit 5 mmol/l AMP gezeigt (80;81).

Coformycin in einer Konzentration von 7 µmol/l verstärkt die depressorische Wirkung von Adenosin auf die elektrische und mechanische Aktivität des Vorhofmyokards von Meerschweinchen in Hypoxie durch eine nahezu vollständige Inhibition der Adenosin- Desaminase (77).

Weiterhin besteht ein kardioprotektiver Effekt bezüglich der kardialen kontraktilen und metabolischen Erholung bei Ischämie-Reperfusions-Ereignissen. Dieser Effekt wird durch den Erhalt des ATP-Spiegels und erhöhte Adenosin-Konzentrationen vermittelt. In der Reperfusionsphase kommt es zu einer verstärkten Freisetzung von Adenosin (69).

2.2.5 Methotrexat

IMP dient in der Purin-de-novo-Synthese als Vorstufe von AMP und GMP. Für den Syntheseprozess ist Tetrahydrofolsäure essentiell. Methotrexat verdrängt als Antimetabolit Dihydrofolsäure kompetitiv von der Dihydrofolatreduktase und hemmt das Enzym. Dadurch steht Tetrahydrofolsäure für die Purinnukleotidsynthese nicht mehr zur Verfügung. Durch die Hemmung mit Methotrexat lässt sich folglich der Einfluss der Purin-de-novo-Synthese auf die Purinbildung abschätzen, und in den hier beschriebenen Versuchen auf die Purinmetabolit- Freisetzung.

2.3 Protokolle und Fragestellungen

2.3.1 Abschätzung der Umsatzrate der AMP-Desaminase unter verschiedenen Bedingungen

Für die Abschätzung der Umsatzraten der AMP-Desaminase wurde das isoliert perfundierte Meerschweinchenherz nach Langendorff verwendet. Es wurden pharmakologische Interventionen mit Inhibitoren (s.u.) bei unterschiedlicher Oxygenierung des Mediums (Normoxie mit 95% O2, 5% CO2, Hypoxie mit 40% O2,, 55% N2, 5% CO2) durchgeführt.

2.3.1.1 EHNA und Allopurinol

Eine 1 mmol/l EHNA-Stammlösung und eine 1 mmol/l Allopurinol-Stammlösung wurden seitenständig so infundiert, dass die Endkonzentration für EHNA bei 5 µmol/l und für Allopurinol bei 10 µmol/l lag. Nach 5 Minuten wurde das koronarvenöse Effluat in 2 Proben aufgefangen. Anschließend wurde für die restliche Versuchsdauer die Perfusion auf das hypoxische Medium (40% O2) umgeschaltet. Nach fünf Minuten hypoxischer Perfusion wurden 2 weitere Proben gesammelt (Abb. 2.3, n=6).

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