Leseprobe
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung
2 Bioverfügbarkeit von Flavanolen aus Kakao und Schokolade
2.1 Flavanole
2.1.1 Struktur der Flavanole
2.1.2 Flavanole in Kakao und Schokolade
2.1.3 Analytik von Flavanolen
2.1.3.1 Extraktion
2.1.3.2 HPLC
2.1.3.2.1 Säule
2.1.3.2.2 Detektion und Quantifizierung
2.1.3.3 Vergleichbarkeit der Ergebnisse von Ratten- und Humanproben
2.2 Bioverfügbarkeit
2.2.1 Begriffsdefinitionen
2.2.2 Präabsorptionsereignisse
2.2.2.1 Mundhöhle
2.2.2.2 Magen
2.2.2.3 Dünndarm
2.2.3 Absorption ins Plasma
2.2.3.1 Auftreten von freiem (Epi)Catechin nach hydrolytischer Spaltung
2.2.3.2 Flavanolabsorption und -Metabolisierung
2.2.3.3 Einfluss der Stereoisomerie
2.2.3.4 Gegenüberstellung der Absorption und Metabolisierung von (Epi)- Catechin nach separater oder kombinierter Aufnahme
2.2.3.5 Einfluss der Flavanoldosis
2.2.3.6 EinflussderNährstoffe
2.2.3.7 Rinfluss der Milch
2.2.3.8 Gegenüberstellung der Absorption von verschiedenen Schokoladen und Kakaogetränken unter Berücksichtigung ihrer Zusammensetzung
2.2.4 RenaleRxkretion
2.2.4.1 Gegenüberstellung der renalen (Rpi)Catechinexkretion nach separater oder kombinierter Aufnahme
2.2.4.2 Rinfluss der Flavanoldosis
2.2.4.3 Rinfluss der Milch
2.2.5 Metabolisierung der Flavanole im Dickdarm
2.2.5.1 Renale Rxkretion von Phenolsäuren
2.2.5.2 Rinfluss der Milch
3 Diskussion
4 Zusammenfassung
5 Literaturverzeichnis
6 Anhang
Abbildungsverzeichnis
Abb.2.1 Grundstruktur der Flavanole
Abb. 2.2 Dimerisierte Flavanole vom Typ A und Typ В
Abb. 2.3 Flavanolgehalt in Kakao und Schokolade
Abb. 2.4 Die in Kakao und Schokolade vorherrschenden Monomere (Epi)Catechin und Dimer В2
Abb. 2.5 Chromatogramme von Humanplasma (A) und Rattenplasma (В) nach Epicatechinadministration
Abb. 2.6 Chromatogramme von Humanurin (A) und Rattenurin (В) nach Epicatechinadministration
Abb. 2.7 Stabilität der Dimere В2 und В5 im simulierten Magensaft (pH 1,8) und die Bildung von Epicatechin und demjeweils anderen Dimer im Zeitverlauf
Abb. 2.8 Plasmakonzentration von (Epi)Catechin und Dimer В2 nach der Kakaoaufnahme mit 323 mg (Epi)Catechin und 256 mg Dimer В2
Abb. 2.9 Verlauf der Gesamtflavanolkonzentration nach Aufnahme eines flavanolreichen und eines flavanolarmen Kakaogetränks
Abb. 2.10 Plasmaprofil der Flavanolmetabolite nach Aufnahme eines flavanolreichen Kakaogetränks im Zeitverlauf
Abb. 2.11 Perfusionsmodell für die isolierten Darmabschnitte einer Ratte
Abb. 2.12 Kumulative Absorption von (Epi)Catechin und Metaboliten nach 90 minütiger Perfusion durch isolierte Dünndarmabschnitte einer Ratte
Abb. 2.13 Zeitverlauf der Plasmakonzentrationen von Epicatechinmetaboliten
Abb. 2.14 Prozentuale Verteilung von Glucuronidierung, Methylierung oder Sulfatierung der Metabolite im Zeitverlauf
Abb. 2.15 Verteilung und Aktivität der konjugierenden Enzyme, UGT, PST und COMT, im Gewebe von Ratten
Abb. 2.16 Effekte von Zucker auf die Plasma-(Epi)Catechinkonzentrationen
Abb. 2.17 Zusammenhang zwischen dem Kohlenhydratgehalt von Lebensmitteln und AUC-Werte für Flavanole im Plasma
Abb. 2.18 Verdauungsindex [%] der Procyanidine nach den Verdauungsstufen in Magen und Duodenum
Abb. 2.19 AUCs der Epicatechinkonzentration im Plasma nach Aufnahme dunkler Schokolade, Schokolade und Milch sowie Milchschokolade
Abb. 2.20 Plasmakonzentrationsverläufe für Catechin und Epicatechin in Ratten
Abb. 2.21 Korrelationsplot der AUC für die Lösungen mit Catechin und Epicatechin und dem Fettgehalt der Milchprodukte
Abb. 2.22 Plasmaprofile von Epicatechin und Metaboliten nach der Kakao- und Schokoladenaufnahme
Abb. 2.23 Serumkonzentrationen von Epicatechin nach dem Konsum von Kakaogetränken (A) und Schokoladen (B) mit unterschiedlicher Zusammensetzung
Abb. 2.24 Plasmakonzentrationsverläufe für Catechin (CAT) und Epicatechin (ECAT) in Ratten
Abb. 2.25 Pharmakokinetik der Flavanole (freie und Metabolite) im Plasma von Ratten nach der Schokoladenverabreichung unterschiedlicher Zusammensetzungen
Abb. 2.26 Summenexkretion (A) und Ausscheidungsprofil (B) von Epicatechin und Metaboliten im Zeitverlauf
Abb. 2.27 Gesamtausscheidung von (Epi)Catechinmetaboliten im 24h-Urin von Ratten nach Administration von separatem Catechin (CA), Epicatechin (EC) oder Mixtur der Monomere (MIX)
Abb. 2.28 Renale Phenolsäurenexkretion nach der Kakaoaufnahme mit Wasser oder Milch
Abb.6.1 Strukturen von Epicatechinmetaboliten
Abb. 6.2 Mikrobielle Degradation und weiterer Lebermetabolismus von Epicatechin und Dimer B2 zu Phenolsäuren
Tabellenverzeichnis
Tab. 2.1 Plasmakonzentrationen von (Epi)Catechin und Dimer B2 nach Flavanol- aufnahme
Tab. 2.2 Konzentrationen der auftretenden Metabolite im Rattenplasma nach in situ- Perfusion mit 30 und 100 pmol/l Catechin
Tab. 2.3 AUCs von nicht-methylierten und 3 '-O-methylierten Metaboliten von (Epi)Catechin im Rattenplasma nach Administration von Catechin, Epicatechin oder einer Mixtur der Monomere
Tab. 2.4 Nicht-methyliertes und 3 '-O-methyliertes Epicatechin im Plasma von Ratten nach Verabreichung von reinem Epicatechin und Kakaopulver
Tab. 2.5 Epicatechin-Plasmakonzentrationen nach dem Verzehr von unterschiedlichen Schokoladendosen
Tab. 2.6 Parameter nach Verabreichung von Kakao und unterschiedlichen Mengen Zucker
Tab. 2.7 Pharmakokinetische Parameter nach Verabreichung von Kakao und Brot und Grapefruitsaft
Tab. 2.8 Flavanolgehalte aus Kakaomasse und -Pulver in Chymus und Pellet nach Magen- und Duodenumpassage im Verdauungsmodell
Tab. 2.9 Pharmakokinetische Parameter nach Verabreichung von Kakao und Steak
Tab. 2.10 Pharmakokinetische Parameter für (Epi)Catechin in wässriger Lösung oder in Milchprodukten nach oraler Administration an Ratten
Tab. 2.11 Pharmakokinetische Parameter für Epicatechin im Serum nach Aufnahme flavanolhaltiger Lebensmittel
Tab. 2.12 Pharmakokinetische Parameter von (Epi)Catechin bei Ratten nach oraler Schokoladenadministration in Wasser oder Milch dispergiert
Tab. 2.13 Pharmakokinetische Parameter von Epicatechin und Metaboliten im Plasma von Ratten nach dem Verzehr verschiedener Schokoladen
Tab.2.14 Renale Epicatechinexkretion
Tab. 2.15 Metabolitkonzentrationen von Epicatechin im Urin nach dem Konsum von Kakao und Wasser
Tab. 2.16 Nicht-methylierte und 3 '-O-methylierte Metabolite von (Epi)Catechin im 24h- Urin von Ratten nach Administration von Catechin, Epicatechin oder einer Mixtur der Monomere
Tab. 2.17 Konzentrationen der Epicatechinmetabolite nach der Kakaoaufnahme mit Wasser oder Milch
Tab. 2.18 Renale Phenolsäurenexkretion nach Schokoladenverzehr mit 147 mg (Epi)Catechin und 439 mg Procyanidinen
Tab. 2.19 Konzentration von Epicatechin, Dimer B2 und Phenolsäuren im Humanurin nach der Aufnahme von 40 g Kakao und 250 ml Wasser
Tab. 2.20 Konzentration von Epicatechin, Dimer B2 und Phenolsäuren im Rattenurin nach der Kakaoaufnahme
Tab. 6.1 Benennung der Phenolsäuren, die aus dem Stoffwechsel aus Abb. 6.2 hervorgehen
Abkürzungsverzeichnis
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
1 Einleitung
CAOBISCO, die Association of chocolate, biscuit and confectionery industries of Europe, veröffentlichte 2008, dass Deutschland mit 9,29 kg Schokolade pro Kopf auf Platz fünf des weltweiten Schokoladenkonsums lag. Die Schweizer konsumierten mit 10,77 kg Schokolade pro Kopf die meiste Schokolade (CAOBISCO 2008). In Kakao und der daraus hergestellten Schokolade befinden sich hohe Flavan-3-olmengen (Hammerstone et al. 2000). Als Hauptlieferanten dieser Gruppe der sekundären Pflanzenstoffe gelten Schokolade, Tee, Äpfel, Birnen, Pflaumen und Rotwein. Die tägliche Aufnahme der Flavan-3-ole (nachfolgend Flavanole) Catechin und Epicatechin (nachfolgend (Epi)Catechin) und ihren Di- und Trimeren wurde auf 18 bis 50 mg/d geschätzt. (Manach et al. 2005). (Epi)Catechin und daraus entstehende Metabolite zeigen im menschlichen Körper vielfältiges Potential die Gesundheit positiv zu beeinflussen (Galleano et al. 2009).Vor dem Hintergrund des hohen Kakao- und Schokoladenkonsums und deren potentiellen Effekte auf den Körper durch die enthaltenen Flavanole, steigt das Interesse, ihre Bioverfügbarkeit zu verstehen.
Die vorliegende Studienarbeit widmet sich der Bioverfügbarkeit von Flavanolen aus Kakao und Schokolade und behandelt relevante Einflussfaktoren. Sie setzt sich zunächst mit den strukturellen Eigenschaften der Flavanole auseinander und wie sie sich in biologischen Proben analysieren lassen, um auf die Aufnahme zu schließen (Abschnitt 2.1). Neben dem Verhalten der Flavanole im Verdauungstrakt werden die Aufnahme ins Plasma und ihre Exkretionswege betrachtet sowie die Einflussnahme von Makronährstoffen und dem Lebensmittel Milch (Abschnitt 2.2). Da Flavanole auch in konjugierter Form wirksam sind (Mohsen et al. 2002, Schroeter et al. 2006, Spencer et al. 2001a), erfolgt die Darstellung der Biotransformation (Unter-Unterabschnitt 2.2.3.2). Flavanole, die den Dickdarm erreichen, werden von Mikroorganismen zu Phenolsäuren gespalten und absorbiert, weshalb auch ihre Bioverfügbarkeit in dieser Arbeit behandelt wird (Unterabschnitt 2.2.5).
2 Bioverfügbarkeit von Flavanolen aus Kakao und Schokolade
2.1 Flavanole
Flavanole sind sekundäre Pflanzenstoffe, die als nicht-polare Flavonoide der Gruppe der Polyphenole zugeordnet werden. Sie entstehen im pflanzlichen Metabolismus aus der Kondensation von Zimtsäure und drei Malonyl-CoA Molekülen (Shikimisäureweg) (Bloor 2001). Sekundäre Pflanzenstoffe beschreiben eine Gruppe zahlreicher und chemisch sehr unterschiedlicher Verbindungen. Anders als primäre Pflanzenstoffe wie Kohlenhydrate, Fette und Proteine, sind sie weder am Energiestoffwechsel noch am Zellaufbau beteiligt. Sie dienen dem pflanzlichen Organismus u.a. als Abwehrstoffe gegen Schädlinge und Krankheiten, als Wachstumsregulatoren oder als Farbstoffe (Watzl und Leitzmann 2005). Im menschlichen Körper zeigen (Epi)Catechin und daraus entstehende Metabolite ebenfalls vielfältige Funktionen, die positiv auf die Gesundheit des Menschen wirken (Galleano et al. 2009).
2.1.1 Struktur der Flavanole
Flavanole treten als Aglykone auf und bestehen aus einem C15(C6-C3-Cö)-Skelett, das aus zwei aromatischen Ringen (Ring A und B) besteht, die einen Pyranring (Ring C) umschließen. Demnach bilden sie ein Diphenylpropan (Lazarus et al. 2001, Milbury 2001). Abb. 2.1 zeigt die Grundstruktur der Monomere.
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Abb. 2.1 Grundstruktur der Flavanole (Aron und Kennedy 2008).
Flavanole besitzen Hydroxylgruppen an den Positionen C5 und C7 des A-Rings sowie an den Positionen C3, C4 und C5 des B-Rings, was zur Ausbildung der Catecholstruktur (Dihydroxylierung) führt, ihre Aktivität erhöht und besonders für die antioxidative Eigenschaft von Bedeutung ist (Lazarus et al. 2003, Middleton 2000). Die C3-Position des C- Rings ist am häufigsten mit Gallussäure verestert oder liegt in hydroxylierter Form vor. Das Präfix „Epi-“ kennzeichnet Isomere, die sich in ihrer räumlichen Anordnung an der C3- Position unterscheiden und am R4 des C3 ein Wasserstoffatom angelagert ist. Die Stereochemie am C2 wird für rechtsdrehende Enantiomere durch (+) und für linksdrehende mit (-) kenntlich gemacht. (Epi)Catechin, (Epi)Catechingallate, (Epi)Gallocatechin und (Epi)Gallocatechingallate bilden die Gruppe der monomeren Flavanole. Proanthocyanidine sind Oligomere, die sich aus den Monomereinheiten über Kohlenstoffbindungen zusammensetzen. Die Bindungen befinden sich beim Typ В entweder zwischen C4 und C6 oder zwischen C4 und C8. Proanthocyanidine werden in Procyanidine und Prodelphinidine klassifiziert. Procyanidine, die auch als kondensierte Tannine bezeichnet werden, setzen sich ausschließlich aus (Epi)Catechineinheiten zusammen, während Prodelphinidine aus (Epi)Gallocatechineinheiten bestehen. A-Typ Proanthocyanidine treten in Formation mit einer zweiten Interflavonoidbindung über eine Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindung auf und sind weniger häufig vorzufinden als der B-Typ (Lazarus et al. 2003).
Abb. 2.2 stellt dimerisierte Flavanole von Typ A und В dar.
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Abb. 2.2 Dimerisierte Flavanole vom Typ A und Typ В (Aron und Kennedy 2008).
2.1.2 Flavanole in Kakao und Schokolade
Laut Online-Datenbank des United States Department of Agriculture (USDA) enthält die Kakaobohne durchschnittlich 156,67 mg (-)-Epigallocatechin, 99,18 mg (-)-Epicatechin (nachfolgend nur Epicatechin) und 88,45 mg (+)-Catechin (nachfolgend nur Catechin) pro 100 g (USDA 2007). Natürliches Kakaopulver besteht aus gereinigten, verarbeiteten und gerösteten Bohnen, das mindestens 20 % Kakaobutter in der Trockenmasse enthält. Schokolade setzt sich aus Kakaoerzeugnissen und Zuckerarten zusammen. Das Kakaoerzeugnis besteht insgesamt aus 35 % Kakaotrockenmasse mit mindestens 18 % Kakaobutter und 14 % entölter Kakaotrockenmasse. Eine Milchzugabe Milch ist bis zu einem Gehalt von 5 % der Schokoladentrockenmasse zulässig. Handelt es sich um ungesüßte Schokolade (Kuvertüre), muss das Erzeugnis mindestens 35 % Gesamtkakaotrockenmasse enthalten, davon mindestens 31 % Kakaobutter und mindestens 2,5 % entölte Kakaotrockenmasse. Milchschokolade besteht neben mindestens 25 % Kakaotrockenmasse und Zucker aus mindestens 14 % Milchtrockenmasse, die ihrerseits bestimmte Kriterien erfüllt. Weiße Schokolade stellt ein Erzeugnis aus Kakaobutter, Milch oder Milcherzeugnissen und Zuckerarten dar, das mindestens 20 % Kakaobutter und mindestens 14 % Milchtrockenmasse enthält (Richtlinie 2000/36/EC). Gu et al. (2006) analysierten natürliches Kakaopulver und verschiedene Schokoladen hinsichtlich ihres Flava- nol- und Procyanidingehalts. Dutched Powder wurde aus natürlichem Kakaopulver hergestellt, welches eine alkalische Behandlung erfuhr, um den natürlichen Säuregehalt zu neutralisieren. Die Ergebnisse ihrer Analyse zeigt Abb. 2.3.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 2.3 Flavanolgehalt in Kakao und Schokolade. Die Gehalte zeigen Mittelwerte (MW) (± Standardabweichung (SD)) (Gu et al. 2006).
Der (Epi)Catechingehalt war je nach Probe in natürlichem Kakaopulver oder ungesüßter Schokolade am höchsten. Bei allen Produkten lag der Epicatechingehalt über dem des Catechins. Im natürlichen Kakaopulver war der Catechingehalt 0,61 bis 0,9 mg/g und der Epicatechingehalt 1,58 bis 2,58 mg/g, während ungesüßte Schokolade 0,52 bis 1,17 mg/g Catechin und 1,76 bis 2,01 mg/g Epicatechin enthielt. In Milchschokolade fand die Arbeitsgruppe um Gu et al. (2006) 0,05 bis 0,12 mg/g Catechin und 0,18 bis 0,24 mg/g Epicatechin. Der Procyanidingehalt variierte zwischen dem Kakaopulver und den Schokoladen, auch innerhalb der Sorten. Er korrelierte positiv mit dem Gehalt der fettfreien Kakaomasse (r=0,99). Mit dem höchsten Anteil fettfreier Masse zeigte natürliches Kakaopulver die größte Menge Procyanidine. Milchschokolade wies den niedrigsten Anteil fettfreie Kakaomasse und somit auch den geringsten Procyanidingehalt auf.
Adamson et al. (1999) analysierten die Flavanolzusammensetzung in dunkler Schokolade (leicht gesüßt), Milchschokolade und Kakaomassen aus stark und leicht fermentierten Kakaobohnen. Neben Monomeren traten vor allem dimerisierte Procyanidine auf und der gesamte Flavanolgehalt nahm mit zunehmendem Verarbeitungsgrad ab (Kakaomasse aus leicht fermentierten Kakaobohnen>Kakaomasse aus stark fermentierten Kakaobohnen>dunkle Schokolade>Milchschokolade) (Adamson et al. 1999). Abb. 2.4 zeigt die vorherrschenden Flavanole in Kakao und Schokolade, (Epi)Catechin und Dimer B2 (Epicatechin-(4^8)- Epicatechin). Neben dem Verarbeitungsprozess beeinflussen auch Umwelt- und Lagerkonditionen den Flavanolgehalt sowie Sorte, Reifegrad, Fett-, Protein- und Kohlenhydratgehalt der Kakaobohne (Aron und Kennedy 2008).
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Dimer B2
Abb. 2.4 Die in Kakao und Schokolade vorherrschenden Monomere (Epi)Catechin und Dimer B2 (Baba et al. 2001a, Valls et al. 2009).
Kürzlich durchgeführte Interventionsstudien mit flavanolhaltigen Lebensmitteln bestätigten epidemiologische Daten, die einen inversen Zusammenhang zwischen der Aufnahme und dem Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen herstellten (Schroeter et al. 2006). Dieser Zusammenhang beruhte auf ihrer vasodilatativen (Fisher et al. 2003), antithrombotischen (Murphy et al. 2003) und blutdrucksenkenden (Taubert et al. 2003) Wirkung sowie ihrer Einflussnahme auf den Kohlenhydratstoffwechsel. Hier trugen Flavanole aus Schokolade zu einer verminderten Insulinresistenz und zu einer verbesserten Glucosetoleranz bei (Grassi et al. 2005). Weitere Untersuchungen zeigten eine gesteigerte Immunabwehr und ein verbessertes antioxidatives Schutzsystem (Keen et al. 2005, Sies et al. 2005). Middleton et al. (2000) und Scalbert et al. (2005) zeigten in vitro die Beeinflussung zellulärer Signalwege und Zellmembraneigenschaften sowie die Modulation von Rezeptorfunktionen durch Flavanole. Weiterhin veränderten sie den zellulären Redoxstatus und wirkten regulierend auf Genexpression, Proteinaktivität und metabolische Fähigkeiten verschiedener Zellarten (Middleton et al. 2000, Scalbert et al. 2005). Heinrich et al. (2006) belegten positive dermatologische Effekte nach langfristiger Schokoladenaufnahme. Diese bewirkte durch die nachgewiesene Photoprotektivität eine Verbesserung der Hautbeschaffenheit und schützte vor UV-induzierter Erythema (Heinrich et al. 2006). Neben den positiven Effekten von Kakao und Schokolade weist eine aktuelle Studie von Rose et al. (2010) auf einen signifikanten Zusammenhang zwischen dem Auftreten von Depressionen und dem Schokoladenverzehr hin (Rose et al. 2010).
2.1.3 Analytik von Flavanolen
2.1.3.1 Extraktion
Bei der Flavanolextraktion aus Geweben oder Körperflüssigkeiten wurde die Flüssigextraktion am häufigsten eingesetzt (Donovan et al. 2001, Engler et al. 2004, Keogh et al. 2007, Okushio et al. 1999, Piskula und Terao 1998, Richelle et al. 1999). Nur wenige Arbeitsgruppen kombinierten die Flüssig- mit der Festphasenextraktion (auch SPE für solidphase-extraction) (Natsume et al. 2003, Neilson et al. 2010, Roura et al. 2008). Diese Probenvorbereitung dient der Entfernung von Proteinen und Matrixbestandteilen, die die chromatographische Flavanolanalyse in biologischen Flüssigkeiten beeinflussen können (Serra et al. 2009).
In den vorgestellten Studien wurde zur Flüssigextraktion überwiegend Acetonitril als Lösungsmittel verwendet (Engler et al. 2004, Keogh et al. 2007, Neilson et al. 2009, Richelle et al. 1999), weitere nutzten auch Methanol (Donovan et al. 2001, Piskula und Terao 1998) oder Ethylacetat (Okushio et al. 1999). Das Prinzip beruht auf der unterschiedlichen Verteilung der Stoffe, hier der Flavanole, zwischen zwei nicht mischbaren Phasen. Die Stoffe reichern sich im organischen Lösungsmittel an und können so separiert werden. Durch Abdampfen des Lösungsmittels liegen die interessierenden Substanzen in einem geringeren Flüssigkeitsvolumen für weitere Analyseschritte gelöst vor (Schwedt 2007). Für die Epicatechinextraktion erreichten Richelle et al. (1999) mit Acetonitril in Gegenwart von Säure eine Extraktionsausbeute von 65 %, während diese bei Neilson et al. (2009) 106 % betrug. Donovan et al. (2001) extrahierten mit einer sauren Methanollösung mehr als 90 % des Catechins und Schroeter et al. (2006) erreichten mit dieser durchschnittlich 85 % für Epicatechin und Metabolite.
Die SPE ermöglicht mithilfe spezieller Adsorbentien -Polymermaterialien, Silicagel und vor allem chemisch gebundene Phasen wie Alkyl- oder Phenyl-Gruppen an Silicagel- aufgrund der Selektivität der Adsorption und der anschließenden Elution mit meist organischen Lösungsmitteln eine Abtrennung der Matrixbestandteile. Die Arbeitsgruppen, die eine SPE nutzten, verwendeten als Adsorbent ein Polymermaterial und für die Elution eine (angesäuerte) Methanollösung (Natsume et al. 2003, Roura et al. 2005). Es gelten die Prinzipien der Chromatographie. Die Adsorbensauswahl wird durch die Polarität der zu extrahierenden Stoffe und durch die Matrixart bestimmt. Durch verschiedene Waschschritte werden störende Begleitstoffe selektiv entfernt. Das Eluat wird zur Analyse verwendet (Schwedt 2007). Roura et al. (2005) ermittelten bei Verwendung einer angesäuerten Methanollösung eine Ausbeute von weniger als 50 % des Epicatechins, während der Einsatz einer angesäuerten Acetonitrillösung eine Ausbeute von mehr als 80 % erreichte.
Zur weiteren Aufreinigung nach der Extraktion von Epicatechin und Metaboliten kann die Analyselösung vor Eingabe in den HPLC (high performance liquid chromatography) filtriert (Holt et al. 2002, Rein et al. 2000, Rios et al. 2002, Spadafranca et al. 2010, Tomas-Barberan et al. 2007) oder chromatographisch mittels (semi-)präparativer HPLC aufgetrennt werden (Natsume et al. 2003, Okushio et al. 1999).
2.1.3.2 HPLC
In der Flavanolanalytik wurde die Flüssigchromatographie (auch LC für liquid chromatography), zum Teil mit Massenspektrometrie (MS)-Kopplung (LC-MS, HPLC-MS), eingesetzt (Baba et al. 2001a, Okushio et al. 1999, Roura et al. 2007a). Die Flüssigchromatographie trennt Substanzen auf und dient der Quantifizierung. Die Massenspektrometrie fungiert als Identifikations- und Quantifizierungstechnik, die vor allem bei der Strukturaufklärung der Flavanole verwendet wird (Valls et al. 2009).
Bei der HPLC handelt es sich um eine Säulen-Flüssigkeits-Chromatographie. Das Gerät besteht aus Pumpe, Einspritzsystem, Trennsäule und Detektor mit Auswertsystem. Die Probe wird in dem Trennverfahren mit der mobilen Phase (Eluent) unter hohem Druck über die stationäre Phase (Trennsäule) transportiert, die die Analyte je nach Affinität unterschiedlich lang sorbiert (Schwedt 2007).
2.1.3.2.1 Säule
Die reversed-phase HPLC (auch RP für Umkehrphase) wurde zur Separierung von Mono-, Di- und Trimeren eingesetzt (Valls et al. 2009). Bei dieser Vorgehensweise wird im Gegensatz zur Normalphase eine unpolare (hydrophobe) stationäre Phase hergestellt und eine polare (hydrophile) mobile Phase verwendet. Bei der stationären Phase handelt es sich um ein chemisch modifiziertes Silicagel, auf dessen Oberfläche Kohlenstoffketten angelagert sind. In den vorgestellten Studien wird meist eine C18-Säule eingesetzt, die eine Länge von 100 bis 300 mm und einen Durchmesser von ungefähr 4,6 mm aufweist. Zwei Mechanismen führen zur Trennung. In dem System verteilen sich die Analyte aufgrund ihrer Polarität unterschiedlich zwischen mobiler und stationärer Phase. Letztere hält die Stoffe zurück, je unpolarer sie sind bzw. je weniger wasserlöslich sie sind (Schwedt 2007). In den präsentierten Studien wurde zum Herauslösen aus der Säule überwiegend die Gradientenelution angewendet. Die mobile Phase wird während des Trennvorgangs in ihrer Zusammensetzung variiert und die Fließmittelstärke erhöht. Die mobile Phase ist polarer als die stationäre und besteht zunächst aus einer wässrigen Phase. Im Verlauf der Elution nimmt die Konzentration eines organischen Lösungsmittels wie Acetonitril (Keogh et al. 2007, Mullen et al. 2009) oder Methanol (Rein et al. 2000) zu. Da die Flavanole ionisierbar sind, erfolgte die Zugabe von Säure wie Essig- oder Ameisensäure um den pH-Wert zu kontrollieren (Bloor 2001). Die Elutionsreihenfolge hängt von der Polarität des Stoffes ab. Da die Anzahl der Hydroxylgruppen und damit auch die Polarität mit steigendem Polymerisierungsgrad zunehmen, verweilen (Epi)Catechine länger in der stationären Phase als Di- und Trimere. Nachdem sie die Säule mit dem Fließmittel passiert haben, werden sie detektiert und anhand der Retentionszeiten identifiziert (Pietta und Mauri 2001).
Während die RP-Separierung für (Epi)Catechin und kleinere Oligomere eingesetzt wurde, erfolgte bei höherem Polymerisierungsgrad die Auswahl der normal-phase HPLC (auch NP für Normalphase) (Rios et al. 2002, Spencer et al. 2000). Diese separiert polare Procyanidine mit Silicagel als stationäre Phase und ein organisches Lösungsmittel als mobile Phase. Länge und Durchmesser unterscheiden sich nicht von der eingesetzten Säule bei der RP-HPLC. Die stationäre Phase ist dabei polarer als die mobile Phase. Die polaren Oligomere werden demnach länger auf der Säule festgehalten. Bei der Gradientenelution mit einer Dichlormethan-Methanollösung werden Oligomere bis zu zehn Einheiten separiert, während größere Moleküle als ein Peak am Ende des Chromatogramms erscheinen. Beim Einsatz von Aceton-Hexan erfolgt die Elution bis zu Pentameren, wobei höhere Oligomere im Silicagel verbleiben. Kakao besteht hauptsächlich aus dem Monomer Epicatechin. Beim Auftreten von Procyanidinen vom Typ A und B ist die Auftrennung erschwert. Als stationäre Phase wurde auch Diol und als mobile Phase eine angesäuerte Acetonitril-Methanollösung verwendet. Diese Säule zeigt im Vergleich zum Silicagel eine stärkere Retention, die zu längeren Separationszeiten, aber gleichzeitig auch zu einer Spezifikation der Monomere führt (Valls et al. 2009).
(Semi)Präparative Säulen können zur Peakisolierung der Oligomere eingesetzt werden. Durch die Depolymerisierungsreaktionen mit Nukleophilen ermöglicht dies die Analyse der Monomereinheiten. Für Aussagen über die Art der Monomerverbindungen und ihrer Reihenfolge wurde die Kernspinresonanzspektroskopie (auch NMR für nuclear magnetic resonance) eingesetzt (Natsume et al. 2003, Okushio et al. 1999, Valls et al. 2009). Ortega et al. (2009) verwendeten zur Analyse von Procyanidinen aus in vitro hergestellten Chymus- Proben ein UPLC (ultra performance liquid chromatography) (Ortega et al. 2009). Die UPLC arbeitet ebenfalls mit einer C18-Säule. Bei dieser Methode werden Säulen mit einem geringeren Durchmesser (ca. 2,1 mm) verwendet. Dadurch kommt es zu einer Verbesserung der Genauigkeit und der Geschwindigkeit der Separation und zu einer Reduktion der Säulenlänge (ca. 100 mm) (Valls et al. 2009).
2.1.3.2.2 Detektion und Quantifizierung
Als HPLC-Detektoren wurden unterschiedliche Geräte gewählt. Kriterien zur Bewertung der Qualität analytischer Messverfahren sind die Wiederfindungsrate und die Detektionsgrenze (LOD für limit of detection). Letztere beschreibt die Konzentration des Epicatechins, die eine Peakfläche generiert, die mindestens dreifach höher ist als die Nullmessung. Die Wiederfindung gibt den Substanzverlust während der Analyse an und wird anhand interner Standards wie Taxifolin bestimmt. Die Verluste können in komplexen Matrizen entstehen wenn Epicatechin oder Metabolite ionisieren bzw. während der Extraktion mit Plasmakomponenten interagieren (Roura et al. 2005). Der Einsatz eines elektrochemischen Detektors (ECD) erlangte eine Wiederfindung von 70 bis 90 % für (Epi)Catechin (Rein et al. 2000) und 103 % für Dimer B2 (Holt et al. 2002). Die LOD lag bei 20 pg Epicatechin und 100 ng Catechin, was Konzentrationsmessungen um 1 nmol/l und 5 nmol/l ermöglichte (Rein et al. 2000). Für Dimer B2 und B5 betrug die LOD 290 pg und 723 pg, sodass Plasmakonzentrationsmessungen von 10 und 25 nmol/l möglich waren (Holt et al. 2001). Diese ECD arbeiten nach dem coulometrischem Prinzip. Piskula und Terao (1998) erzielten mit dem amperometrischen ECD eine Ausbeute von mindestens 95 % ihrer Analyte (LOD=20 pmol/l). Für Diodenarrydetektoren (DAD) wurden LODs von 6 ng/ml (ca. 20 nmol/l) für Epicatechin ermittelt (Spadafranca et al. 2010). Richelle et al. (1999) schalteten einen Fluoreszenzdetektor (FD) nach und reduzierten die Nachweisgrenze auf 2 ng/ml (ca. 7 nmol/l). Letzterer erreichte ein LOD von 3 ng für (Epi)Catechin und Metabolite. In der Studie von Donovan et al. (1999) detektierte der ECD ein LOD von 4 bis 5 ng für (Epi)Catechin und 10 bis 20 ng für Metabolite. Der UV-Detektor zeigte ein LOD von 20 ng für (Epi)Catechin. Eine weitere Möglichkeit bietet die Kopplung an ein Massenspektrometer (MS) oder ein Tandem-MS (MS/MS) (Valls et al. 2009).
Bei der MS werden Molekülionen durch chemische Zerfallsreaktionen zur Strukturaufklärung von Stoffen herangezogen. Die gebildeten Ionen werden entsprechend ihrem MasseLadungsverhältnis (m/z) in einem Analysator aufgetrennt. Im Einlasssystem wird die Probe verdampft und in die Zonenquelle eingeführt, in der die Ionisierung stattfindet. Durch eine angelegte elektrische Spannung werden die Ionen in Richtung eines Spalts beschleunigt und gelangen in das Analysatorrohr. Mithilfe eines magnetischen Felds im Analysatorrohr ergeben sich,je nach Verhältnis von Ladung zu Masse, unterschiedlich gekrümmte Flugbahnen für die Ionen, die so aufgetrennt werden. Nur Ionen mit gleichem Masse-Ladungsverhältnis fliegen auf einer Kreisbahn und können den Austrittsspalt passieren. Durch Variation der magnetischen Feldstärke können auch andere Ionen zum Austrittsspalt geführt werden, um auf den Detektor zu treffen. Dieser misst die Ionenstrahlintensität, die von der relativen Menge des zugehörigen Ions in der Probe abhängt. Weitere Einheiten wie Empfänger, Verstärker, Schreiber oder EDV-System dienen der Erstellung eines Massenspektrums, das Ionen nach Massenzahl und Häufigkeit aufzeigt (Mortimer 2001, Schwedt 2007).
Für die Flavanolanalyse erfolgte die Produktion negativer Ionen durch Elektrospray- Ionisation (ESI) (Valls et al. 2009). In den vorgestellten Studien nutzten nur Okushio et al. (1999) das Fast Atom Bombardment (FAB). LC-MS/MS wurde zur Identifizierung und Quantifizierung der Flavanole eingesetzt (Rios et al. 2003, Roura et al. 2008). Dies bedeutet eine zweistufige Massenanalyse. Zunächst wird eine Ionensorte aus der Probe ausgewählt und in der zweiten Stufe wird die Fragmentierung induziert sowie die entstandenen Fragmente analysiert. In der quantifizierenden Analytik wurde häufig ein Triple-Quadrupol-MS eingesetzt (Roura et al. 2008, Valls et al. 2009). In Kombination mit SPE wurde für Epicatechin mit einem Triple-Quadrupol-MS/MS eine Wiederfindung von 71 bis 87 % und eine Nachweisgrenze von 0,49 bis 4 ng/ml (ca. 1,7-13 nmol/l) analysiert (Roura et al. 2005, Urpi-Sarda et al. 2009a). Bei der Analytik von Phenolsäuren wurde das gleiche Messverfahren angewandt und es kam zu Wiederfindungen von 86 bis 109 % und zu LODs von 0,03 bis 44,4 ng/ml (Urpi-Sarda et al. 2009a). Bei Verwendung eines UPLCs erreichten Serra et al. (2009b) bei gleichen Bedingungen eine Wiederfindung für Epicatechin von 96 %, für Catechin von 102 % (LOD jeweils 4 nmol/l), für Dimere von 84 % (LOD=5 nmol/l) und für Trimere von 65 % (LOD=800 nmol/l). In einem RP-HPLC-DAD-MS-System mit Ionenfallen-MS ermittelten Mullen et al. (2009) eine Wiederfindung des Epicatechinstandards von 55 %. In den Studien wurde überwiegend Triple-Quadrupol-MS eingesetzt (Holt et al. 2001, Rios et al. 2003, Roura et al. 2005, Urpi-Sarda et al. 2009a). Das time-of-flight (TOF)- MS bietet in der qualitativen Analytik die genaue Identifikation des molekularen Aufbaus und die Bestätigung oder Ablehnung einer vorgeschlagenen Struktur. ESI-MS/MS Analysen erreichten für Flavanole LODs im ng/ml-Bereich (Valls et al. 2009).
Die Darstellung des Ergebnisses der Flavanolauftrennung im HPLC erfolgt in Form eines Chromatogramms, einer Elutionskurve. Sie stellt die Menge der eluierten Substanzen in Abhängigkeit von der Zeit dar. Die einzelnen Komponenten der Probe weisen unterschiedliche Retentionszeiten auf. Da die Peakfläche proportional der Konzentration in der gemessenen Probe ist, konnten die Flavanole anhand interner Standards wie Taxifolin (Donovan et al. 2001, Rios et al. 2002, Roura et al. 2007a) oder Acetylsalicylsäure (Gossai und Lau-Cam 2009) sowie angefertigter Eichkurven mit erworbenem oder selbst extrahiertem Epicatechin identifiziert und quantifiziert werden (Engler 2004, Keogh et al. 2007, Kuhnle et al. 2000, Neukam et al. 2007, Okushio et al. 1999, Piskula und Terao 1998, Richelle et al. 1999, Spadafranca et al. 2010). Piskula und Terao (1998) berechneten anhand der Catechol-O- Transferaseaktivität (COMT, siehe unten) einen Korrekturfaktor, um von Epicatechin auf die methylierte Fraktion zu schließen.
In Geweben und Flüssigkeiten von Säugetieren treten Flavanole vor allem als konjugierte Metabolite auf, sie sind beispielsweise glucuronidiert oder sulfatiert. Demnach erfolgten in den Studien enzymatische Hydrolysen der Metabolite zur Bestimmung der nicht konjugierten Form. Je nach Fragestellung wurden die Enzyme ß-Glucuronidase und Sulfatase kombiniert oder separat eingesetzt. Bei einzelner Verwendung bestand die Gefahr der Kontamination durch das zweite Enzym. So ist separierte Sulfatase häufig mit ß-Glucuronidase kontaminiert und umgekehrt. Piskula und Terao (1998) und Donovan et al. (2001) setzten bei der Sulfatbestimmung D-Saccharinsäure-1,4-Lacton zur Inhibierung der ß-Glucuronidase- Aktivität ein. Mithilfe der Hydrolyse konnten strukturelle Eigenschaften konstatiert werden. Zur Analyse der Konjugatfraktionen wurde der totale Flavanolgehalt vor und nach der Hydrolyse verglichen und die Konzentrationen indirekt bestimmt. Das „Verschwinden“ eines Peaks im Chromatogramm nach der Sulfatasezugabe weist somit auf die Identität eines Sulfat-Metaboliten hin (Day und Morgan 2003).
Aufgrund des Mangels kommerzieller Standards für polymerisierte Monomere wurde für die Procyanidinquantifizierung (Epi)Catechin als externer Standard eingesetzt und die Oligomere anhand dieser als Catechinäquivalente geschätzt. Für die Herstellung von Standards wurden Synthese- und aufwendige Aufreinigungstechniken entwickelt. Bei der Aufreinigung aus Kakaobohnen erfolgten Extraktionsvorgänge und chromatographische Auftrennungen. Dazu gehörten auch die Gelpermeationschromatographie, die eine Auftrennung nach Molekülgröße vornimmt sowie die präparative NP-HPLC, die nach dem gleichen Prinzip wie oben beschrieben arbeitet, jedoch eine Säule mit größerem Durchmesser (20 mm) verwendet (Schwedt2007, Adamson 1999).
2.1.3.3 Vergleichbarkeit der Ergebnisse von Ratten- und Humanproben
Da aufgrund invasiver Forschung neben Humanstudien auch Studien an Ratten aufgeführt werden, stellt die Studie von Natsume et al. (2003) in diesem Zusammenhang die Auswertung von Human- und Rattenproben gegenüber.
Vier Personen wurde nach zwölfstündigem Fasten vor sowie eine Stunde nach der Administration von Epicatechin und Wasser (1 g Epicatechin/Person) venöses Blut entnommen. Die Ratten (Stichprobenumfang n=13) erhielten eine Dosis von 20 mg Epicatechin und 10 ml Wasser. Von der Lösung wurde ihnen nach nächtlichem Fasten 20 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Die Blutentnahme erfolgte aus der Abdominalvene. Das aufbereitete Plasma wurde im RP-HPLC-MS bestimmt. Durch die Zugabe von Sulfatase Typ H-5, welches Sulfatase- und ß-Glucuronidase-Aktivität aufzeigte, wurden die Metabolite des Epicatechins identifiziert. Zur genauen Strukturbestimmung wurde die NMR-Spektroskopie herangezogen. Abb. 2.5 stellt die Chromatogramme der Analyse von Mensch und Ratte gegenüber. Sieben Peaks erwiesen sich als Hauptpeaks. Jedes Plasmaextrakt wurde nach enzymatischer Hydrolyse erneut bestimmt.
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Abb. 2.5 Chromatogramme von Humanplasma (A) und Rattenplasma (B) nach Epicatechinadministration. Das [M-H] Ionen Chromatogramm selektierte bei m/z 289, 303, 465 und 479 Plasmakomponenten mit gleicher Molekülmasse wie Epicatechin, O-Methyl-Epicatechin, Epicatechin-O-Glucuronide und O-Methyl-Epicatechin-O-Glucuronide (Natsume et al. 2003).
In diesen Chromatogrammen verschwanden Peak 2, 3, 6 und 7, während Peak 4 und 5 sowie ein neuer Peak (Retentionszeit 14,5 und 16 min, m/z 303) größer sichtbar wurden als vor der Hydrolyse. Peak 2 im menschlichen Plasma und Peak 6 aus dem der Ratten zeigten gleiche Molekulargewichte im MS und wurden als Epicatechin-3'-O-Glucuronide (Peak 2) bzw. Epicatechin-7-O-Glucuronide (Peak 6) identifiziert. Ihre Retentionszeiten unterschieden sich.
Nach enzymatischer Hydrolyse verschwanden diese Peaks. Das Gleiche geschah mit Peak 3 (Mensch) und 7 (Ratte), welche als 4'-0-Methyl-Epicatechin-3'-0-Glucuronide und 4'-0- Methyl-Epicatechin-5- oder 7-0-Glucuronide (Peak 3) bzw. 3'-0-Methyl-Epicatechin-7-0- Glucuronide (Peak 7) bestimmt wurden. Peak 4 nach Hinzufügen der Sulfatase und das gekaufte Epicatechin zeigten gleiche Retentionszeiten. Peak 1 und 5 und jeder Peak mit der Retentionszeit 14,5 und 16 Minuten zeigten nach der enzymatischen Behandlung das gleiche deprotonierte molekulare Ion (m/z 303), dessen Molekulargewicht dem des 0-Methyl- Epicatechins glich. Peak 5 wurde als 3 '-0-Methyl-Epicatechin identifiziert.
Natsume et al. (2003) verglichen ebenfalls den Urin hinsichtlich des Epicatechins und der Metabolite. Die gleichen Personen sammelten über acht Stunden nach der Administration Urin. Die Ratten erhielten eine höhere Dosis Epicatechin (500 mg Epicatechin/kg Körpergewicht). Ihr Urin wurde über einen Zeitraum von 18 Stunden aufgefangen. Abb. 2.6 stellt die Chromatogramme der Urinproben von Mensch und Ratte gegenüber. Zur genaueren Probenbestimmung wurde die NMR-Spektroskopie herangezogen. Bei den Analyten im Humanurin handelte es sich um Epicatechin-3'-0-Glucuronide, 4'-0-Methyl-Epicatechin-3'- 0-Glucuronide und um 4'-0-Methyl-Epicatechin-5'- oder 7^-0-Glucuronide. Für die Proben der Ratte erfolgte die gleiche Prozedur. Bei den Metaboliten handelte es sich um 3'-0- Methyl-Epicatechin, Epicatechin-7'-0-Glucuronide und um 3'-0-Methyl-Epicatechin-7-0- Glucuronide.
Natsume et al. (2003) belegten mit ihrer Untersuchung unterschiedliche Konjugatstrukturen zwischen den Spezien im Plasma und Urin (Natsume et al. 2003).
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Abb. 2.6 Chromatogramme von Humanurin (A) und Rattenurin (B) nach Epicatechinadministration. Das [M-H] Ionen Chromatogramm selektierte bei m/z 289, 303, 465 und 479 Urinkomponenten mit gleicher Molekülmasse wie Epicatechin, O-Methyl-Epicatechin, Epicatechin-O-Glucuronide und O- Methyl-Epicatechin-O-Glucuronide (Natsume et al. 2003).
2.2 Bioverfügbarkeit
2.2.1 Begriffsdefinitionen
Unter Pharmakokinetik wird der zeitliche Konzentrationsverlauf einer Darreichungsform im Organismus verstanden. Im folgenden Abschnitt werden pharmakokinetische Begriffe, die für das Verständnis der aufgeführten Studienergebnisse relevant sind, erklärt.
Bioverfügbarkeit wird definiert als Geschwindigkeit und Ausmaß, mit denen der Arzneistoff oder der wirksame Bestandteil aus einer Darreichungsform im systemischen Kreislauf vorliegt (CPMP 1998). Die Konzentration des wirksamen Bestandteils an seinem Wirkort hängt einerseits von der Dosis und andererseits von den pharmakokinetischen Eigenschaften des Stoffes bei dem betreffenden Individuum ab. Die Konzentration am Wirkort lässt sich vor allem bei emährungswissenschaftlichen Studien nicht direkt messen, sodass zur Analyse auf Konzentrationsmessungen im Plasma oder im Urin zurückgegriffen wird. Da es für viele Stoffe eine Beziehung zwischen ihrer Plasmakonzentration und ihrer Wirkung gibt, beschreibt diese eine wichtige Zielgröße. Der zeitliche Konzentrationsverlauf im Organismus wird durch den Eintritt, die Verteilung und die Elimination bestimmt. Zur Beschreibung dieser Vorgänge sind die Bioverfügbarkeit, das Verteilungsvolumen, die Clearance und die Eliminationshalbwertszeit von Bedeutung (Eichelbaum und Schwab 2005).
Zur Berechnung der bioverfügbaren Menge stellte Kwan (1997) eine Formel aus vier Hauptkomponenten auf. Jede Komponente steht für ein mögliches „Hindernis“ auf dem Weg zum systemischen Kreislauf. Die erste Komponente bildet den Teil, der im Darm absorbiert wird (Fx). Die Zweite beschreibt die Fraktion, die nicht in der Darmwand metabolisiert wird und in die Pfortader gelangt (Fg). Der first-pass-Effekt der Leber bildet die dritte Komponente. Es ist die Fraktion, die von der Leber weder gespeichert oder metabolisiert noch ausgeschieden wird (FH). Die letzte Fraktion steht für den Teil, der nach der Leberpassage nicht eliminiert wird (FS). Diese wird aufgrund von Messschwierigkeiten vernachlässigt, soll aber zur Vollständigkeit aufgeführt werden. Nachfolgend ist die Formel der Bioverfügbarkeit einer oral verabreichten Dosis (F') dargestellt (Kwan 1997).
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Es ist zu beachten, dass sich diese Definition auf Arzneistoffe bezieht. Da Flavanole auch in metabolisierter Form, also nach dem first-pass der Leber, als Wirkstoff relevant sind (Mohsen et al. 2002, Schroeter et al. 2006), muss die Definition hierfür erweitert werden, um die Konjugate einzuschließen.
Als Parameter zur Quantifizierung der Bioverfügbarkeit dient die area under the curve (AUC), die Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve. Diese ist der Dosis (D) proportional, die in den systemischen Kreislauf gelangt. Zudem ist die AUC unabhängig von der Applikationsart. Zur AUC-Charakterisierung dienen die maximale Plasmakonzentration (Cmax) und der zugehörige Zeitpunkt (tmax). Die AUC berechnet sich wie folgt:
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Die Clearance (CL) beschreibt die Elimination einer verabreichten Dosis und gibt die Plasmamenge an, die pro Zeiteinheit von dem Stoff geklärt wird. Sie dient der Berechnung der Eliminationsgeschwindigkeit eines Stoffes und steht im direkten Zusammenhang zur AUC. Die pro Zeiteinheit eliminierte Menge ist der jeweiligen Plasmakonzentration proportional. Durch Umformung der oben aufgeführten Formel ergibt sich für die Berechnung:
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An der Elimination sind in erster Linie die Nieren und die Leber beteiligt. Unter der Eliminationshalbwertszeit (t1/2) wird die Zeit verstanden, in der die Stoffkonzentration im Blut bzw. im Organismus nach Abschluss einer Verteilungsphase um 50 % abnimmt. Somit besteht ein Zusammenhang zum Verteilungsvolumen (V), also der Größe des Volumens aus der der Stoff entfernt wird, und der Eliminationsfähigkeit (CL) des Stoffes. Für die Abhängigkeit besteht folgende Beziehung (Aktories et al. 2005):
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2.2.2 Präabsorptionsereignisse
2.2.2.1 Mundhöhle
De Freitas und Nuno Mateus (2001) überprüften den Einfluss struktureller Eigenschaften wie Stereochemie und Interflavonoidbindungen von (Epi)Catechin, Dimer B1 bis B8 und Trimer C1 (Epicatechin-(4^8)-Epicatechin-(4^-8)-Epicatechin) auf die Bindungsaffinität von Speichelproteinen. Speichel erhielten die Wissenschaftler von einem Probanden. Der Speichel wurde mittels Sodium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) in zwei Fraktionen separiert, um in einem Versuch den getrennten Einfluss des Enzyms a- Amylase und des prolinreichen Proteins (PRP) zu konstatieren. Das (Epi)Catechin und die Procyanidine wurden jeweils mit den separierten Proteinen versetzt. Die Nephelometrie1 diente als Methode zur Feststellung der Protein-Polyphenol-Interaktion. Als Einheit für die tanninspezifische Aktivität der Proteine wurde der Nephelometrische Trübungswert (auch NTU für nephelometric turbidity unit) pro mg Flavanol verwendet. Mono- und Dimere sowie Trimer C1 zeigten eine höhere Affinität zu PRP als zu a-Amylase. Catechin (1,45 NTU/mg Flavanol) zeigte im Speichel eine höhere Affinität zu PRP als Epicatechin (0,65 NTU/mg Flavanol). Dimer B3 (Catechin-(4^8)-Catechin) (2,75 NTU/mg Flavanol) wies eine zweifach höhere Bindungsaffinität als Catechin (1,45 NTU/mg Flavanol) auf. Bei Procyanidinen mit Epicatechin als dominierendes Monomer traf dies nicht zu. Die tanninspezifische Aktivität des Epicatechins stieg vergleichsweise langsam mit zunehmendem Polymerisierungsgrad. Für das Monomer betrug der Wert 0,65 NTU/mg, für das Dimer B2 0,85 NTU/mg und das Trimer C1 1,05 NTU/mg Flavanol. Der proportionale Anstieg der Ausfällung mit zunehmenden Epicatechineinheiten blieb im Vergleich zu Catechin aus. Dimere, die über eine C4-C8 Bindung verknüpft waren wie B3 und B4 (Catechin-(4^8)- Epicatechin) (2,75 und 1,75 NTU/mg Flavanol), wiesen eine höhere Affinität zu PRP auf als Dimere B6 (Catechin-(4^6)-Catechin) und B8 (Catechin-(4^6)-Epicatechin) mit C4-C6 Bindung (2,30 und 0,85 NTU/mg Flavanol). Zusätzlich erhöhte Catechin die Bindungskapazität für PRP der Dimere dieser Interflavonoidbindung. Die tanninspezifische Aktivität für PRP von Dimer B6 und B7 (Epicatechin-(4^6)-Catechin) war identisch und höher als von Dimer B8 (de Freitas und Mateus 2001).
2.2.22 Magen
Rios et al. (2002) untersuchten das Verhalten von Dimer B2 und B5 (Epicatechin-(4^-6)- Epicatechin) sowie von Trimer CI aus einem Kakaogetränk im sauren pH-Bereich des Magens. Sechs Testpersonen verzehrten morgens im nüchternen Zustand 500 ml des Kakaogetränks, bestehend aus Kakaopulver und Wasser. Das Getränk enthielt 351 mg (Epi)Catechine und 733 mg Procyanidine. Nach vollständigem Verzehr erfolgten in zehnminütigen Abständen bis zur Magenleerung die Probenentnahmen aus dem Magen mithilfe einer nasogastralen Verweilsonde. Die Zeit betrug ungefähr 50 Minuten. Die Monomerseparierung erfolgte mit einem RP-HPLC-DAD. Oligomere aus den Proben wurden mithilfe eines NP-HPLC-FD bestimmt. Beim Vergleich der Chromatogramme von Kakaogetränk und Probe aus dem Magen zeigten sich keine Abweichungen der Profile. Die Procyanidine blieben im sauren pH-Bereich stabil und wiesen keine Veränderungen auf (Rios et al. 2002).
Zhu et al. (2002) untersuchten die Stabilität der Kakaomonomere sowie die der Dimere B2 und B5 in simulierten Verdauungssäften. Die Stammlösungen wurden zu simuliertem Magensaft (pH 1,8) und Natriumcitratpuffer (pH 2,0; 3,0; 4,0) gegeben und bei 37 °C inkubiert. In regelmäßigen Abständen erfolgte die Aliquotentnahme zur Analyse im RP- HPLC-FD. Zur Identifizierung und Quantifizierung im Chromatogramm dienten externe Standards.
Im Magensaft zeigten die Monomere keine Veränderungen. Die Dimere B2 und B5 hingegen zerfielen oder bildeten Isomere. Nach 30 minütiger Inkubation im sauren pH-Bereich degradierte Dimer B2 zu Epicatechin und Dimer B5. Analog dazu bildete Dimer B5 im Magensaft die Produkte Epicatechin und Dimer B2. Abb. 2.7 zeigt den stärkeren Zerfall von Dimer B5 im Vergleich zu B2 in 60 Minuten.
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Abb. 2.7 Stabilität der Dimere B2 (A) und В5 (В) im simulierten Magensaft (pH 1,8) und die Bildung von Epicatechin und dem jeweils anderen Dimer im Zeitverlauf. Die Daten entsprechen MW (± SD, n=5) (Zhu et al. 2002).
Während der Inkubation im Natriumcitratpuffer mit variierenden pH-Werten von 2,0 bis 4,0 zeigten die Monomere keine Veränderungen. Die Dimere wiesen pH-abhängige Stabilität auf. Bei niedrigen pH-Werten zerfielen sie zu Epicatechin oder isomerierten zum anderen Dimer (Zhu et al. 2002). In einem Versuch von Spencer et al. (2000) waren Dimere wenig säureanfällig. Nach 2,5 Stunden zerfielen 15 % ihres ursprünglichen Gehalts. Als simulierter Magensaft diente Natriumphosphatpuffer (pH 2,0) (Spencer et al. 2000).
Bei gleicher Verfahrensweise analysierten Spencer et al. (2000) den Effekt des sauren pH- Wertes auf Procyanidine (Trimere bis Hexamere). Für die Separierung und Bestimmung der Monomere nutzten sie ein RP-HPLC-DAD und für die Oligomere ein NP-HPLC-FD. Sie zeigten im Natriumphosphatpuffer (pH 2,0) als simulierten Magensaft eine zeitabhängige Degradation, was zu einem vermehrten Auftreten von Dimeren, aber auch von Monomeren führte. Innerhalb der ersten 90 Minuten zerfielen 60 bis 80 % der Oligomere und waren nach 3,5 Stunden nicht mehr detektierbar. Während ihres Zerfalls bildeten sich kleinere Mengen anderer oligomerer Komponenten, die in ihren Konzentrationen variierten (Spencer et al. 2000).
[...]
1 Nephelometrie misst das entstehende Streulicht, wenn ein Lichtstrahl in einem Medium auf Partikel wie Protein-Polyphenolkomplexe stößt. Die Streulichtintensität ist abhängig von der Teilchenzahl, ihrer Größe und Form, der eingestrahlten Wellenlänge, der Differenz der Brechungsindices der Partikel und des Mediums (Hallbach 2006).