Das Erbgut höherer Organismen liegt im Zellkern in Form von Chromosomen vor. Um das Erbgut, die DNA, zu untersuchen und zu charakterisieren muss es isoliert und vom Rest der Zelle getrennt werden. Exemplarisch soll aus einem pflanzlichen (Tomate) und einem tierischen ( Kalbsbries) Organismus die DNA isoliert und sichtbar gemacht werden. Das methodische Prinzip, das diesem Isolierungsverfahren zugrunde liegt, ist auf alle Organismen anwendbar.
Das entsprechende Gewebe wird im kalten Zustand gemörsert oder zerkleinert, bis es pulverisiert ist. Zum Aufschluss der Zelle wird das Gewebe einem bestimmtem Puffer zugesetzt. Dieser Puffer sollte zellwandzerstörende Detergenzien wie SDS, welches an Proteine bindet und diese denaturiert und zellwandverdauenden Enzyme wie z.B. die Proteinase K. enthalten. Im Praktikum hat unsere Gruppe Zahnpasta der Marke Ajona benutzt, um den Gewebeaufschluss herbeizuführen. Nach einer Inkubationszeit erfolgen Reinigungsschritte mit organischen Lösungsmitteln, um Zellwandreste, sowie zelluläre Proteine zu entfernen. Um dies zu realisieren benutzt man Salze, deren positiv geladenen Ionen die negativ geladenen Phosphatgruppen des DNA-Rückgrats sättigen und Alkohol wie z.B. Ethanol.
Ethanol fällt die DNA (Präzipitation). Ethanol macht die sehr langen, fadenförmigen DNA-Moleküle wasserunlöslich, indem es ihnen die umgebenden Wassermoleküle entzieht. Die DNA-Fäden lagern sich aneinander oder verknäulen sich und fallen als eine große, sichtbare Flocke aus. Die DNA befindet sich nun in einem festen Zustand und kann vom Rest der Lösung ( Zellbruchstücke, Proteine) getrennt werden. Die gefällte DNA kann darauf in Wasser resuspendiert werden und liegt nun konzentriert vor. Um Informationen über die DNA zu erlangen, wird diese einer Gelelektrophorese unterzogen. Aus den DNA-Fragmenten lassen sich dann Schlüsse ziehen, die in der Auswertung beschrieben werden.
Aus dem Inhalt:
1. Versuch Nr. 1: Tomaten- und Kalbsbries-DNA Präparation
2. Versuch Nr. 2: Bakterientransformation, Plasmid- DNA Minipräparation und Restriktionsanalyse
3. Versuch Nr. 3: Polymerase- Kettenreaktion (PCR)
4. Versuch Nr. 4 Restriktionsanalyse genomischer DAN
5. Protokoll zur Theorie der Gelelektrophorese
Inhaltsverzeichnis
1. Versuch Nr. 1: Tomaten- und Kalbsbries-DNA Präparation
2. Versuch Nr. 2: Bakterientransformation, Plasmid- DNA Minipräparation und Restriktionsanalyse
3. Versuch Nr. 3: Polymerase- Kettenreaktion (PCR)
4. Versuch Nr. 4 Restriktionsanalyse genomischer DAN
5. Protokoll zur Theorie der Gelelektrophorese
Zielsetzung & Themen
Die vorliegende Arbeit dient der Protokollierung und Auswertung verschiedener molekularbiologischer Praktikumsversuche, die das Ziel verfolgen, grundlegende Techniken der DNA-Isolierung, Klonierung und Analyse praktisch zu erlernen und zu verstehen.
- Methodische Grundlagen der DNA-Präparation aus pflanzlichem und tierischem Gewebe.
- Durchführung und theoretische Fundierung von Bakterientransformationen sowie der Blau-Weiß-Selektion.
- Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur DNA-Amplifikation und Geschlechtsbestimmung bei Parasiten.
- Analyse genomischer DNA mittels Restriktionsenzymen und Gelelektrophorese.
Auszug aus dem Buch
Die Eier von Schistosoma mansoni
In den Eiern von Schistosoma mansoni entwickeln sich innerhalb einiger Tage die Miracidien, die im folgenden Schritt des Zyklus Schnecken infizieren. Das im Ei liegende, vollständig entwickelte Miracidium ist nur einige Tage lebensfähig und muss innerhalb dieser Zeit in das Außenmedium gelangen. Die von den Weibchen in den Venen des Abdomens abgelegten Eier stehen somit vor dem Problem in das Lumen des Darms zu gelangen, um mit dem Faeces ausgeschieden zu werden. Die Eier verankern sich mit Hilfe ihres seitlichen Stachels im Gewebe und wirken entzündungserregend auf das Wirtsgewebe. An der betroffenen Stelle kommt es zur Geschwürbildung. Anschließend ulzeriert das Ei in das Lumen des Darms und gelangt über den Faeces in die Außenwelt. Eier, denen dies nicht gelingt, können mit dem Blutstrom im gesamten Körper verschleppt werden. Die durch die Eier hervorgerufenen pathogenen Veränderungen betroffener Organe rufen das mitunter schwere Krankheitsbild der Bilharziose hervor.
Zusammenfassung der Kapitel
1. Versuch Nr. 1: Tomaten- und Kalbsbries-DNA Präparation: In diesem Kapitel wird die Isolierung von DNA aus pflanzlichem und tierischem Gewebe beschrieben, wobei Zellaufschluss und Präzipitation im Fokus stehen.
2. Versuch Nr. 2: Bakterientransformation, Plasmid- DNA Minipräparation und Restriktionsanalyse: Hier werden die Grundlagen der Klonierung, der Einsatz von Plasmiden als Vektoren sowie die Blau-Weiß-Selektion zur Identifikation transformierter Bakterien erläutert.
3. Versuch Nr. 3: Polymerase- Kettenreaktion (PCR): Dieses Kapitel behandelt das Prinzip der exponentiellen DNA-Vervielfältigung durch PCR und deren Anwendung zur Geschlechtsbestimmung beim Parasiten Schistosoma mansoni.
4. Versuch Nr. 4 Restriktionsanalyse genomischer DAN: Hier wird die Anwendung von Restriktionsenzymen zur Analyse genomischer DNA untersucht, um repetitive Sequenzen und Bandenmuster besser zu verstehen.
5. Protokoll zur Theorie der Gelelektrophorese: Das abschließende Kapitel erklärt die theoretischen und praktischen Grundlagen der Gelelektrophorese als Methode zur Größentrennung von DNA-Fragmenten.
Schlüsselwörter
DNA-Isolierung, Plasmide, Klonierung, Restriktionsenzyme, Polymerase-Kettenreaktion, PCR, Gelelektrophorese, Schistosoma mansoni, Bilharziose, Blau-Weiß-Selektion, Genbanken, Transformation, repetitive Sequenzen, Ethidiumbromid, Amplifikation.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in diesen Praktikumsprotokollen grundlegend?
Die Arbeit umfasst eine Reihe von Protokollen zu molekularbiologischen Experimenten, die im Rahmen eines Praktikums für das Lehramt durchgeführt wurden.
Was sind die zentralen Themenfelder der Versuche?
Die Arbeit deckt die DNA-Isolierung, Klonierungstechniken, die PCR-Technologie sowie die Restriktionsanalyse und Gelelektrophorese ab.
Welches primäre Ziel verfolgen die Arbeiten?
Das Ziel ist die praktische Anwendung molekularbiologischer Methoden und das Verständnis der zugrundeliegenden theoretischen Konzepte bei der Untersuchung genetischen Materials.
Welche wissenschaftlichen Methoden werden angewendet?
Es kommen Standardmethoden wie die DNA-Präzipitation, Transformation von E. coli, PCR-Amplifikation und der Southern-Blot-Ansatz zum Einsatz.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in vier Versuchsreihen, von der DNA-Extraktion aus verschiedenen Organismen bis zur spezifischen Geschlechtsbestimmung von Parasiten mittels DNA-Analytik.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren diese Arbeit?
Wichtige Begriffe sind DNA-Isolierung, Plasmide, PCR, Restriktionsanalyse, Gelelektrophorese und Schistosoma mansoni.
Welche Rolle spielt die Blau-Weiß-Selektion in diesem Kontext?
Sie dient zur Identifizierung von Bakterienkolonien, die erfolgreich ein rekombinantes Plasmid aufgenommen haben, basierend auf der Aktivität der Beta-Galaktosidase.
Warum ist die Gelelektrophorese für die Auswertung so wichtig?
Sie ermöglicht die visuelle Auftrennung und Identifizierung von DNA-Fragmenten basierend auf ihrer Größe, was für die Bestätigung erfolgreicher Experimente essenziell ist.
- Quote paper
- Sabrina Engels (Author), 2002, Bakterientransformation, Minipräparation, Restriktionsanalyse und PCR. Protokolle zum Genetik-Praktikum für Lehramt der Sekundarstufe II, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/20569
