Leseprobe
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis der Abkürzungen
1. Einleitung
1.1 Einführung
1.2 Die akuten lymphatischen Leukämien (ALL)
1.3 Prognosefaktoren und bedeutsame Untergruppen der ALL
1.4 Molekulare Prognosefaktoren der ALL
2. Epigenetische DNA-Veränderungen
2.1 DNA-Methylierung
2.2 Regulation der DNA-Methylierung
2.3 DNA-Metyhlierung und Tumorerkrankung
2.4 DNA-Methylierung bei der ALL
2.5 DNA-Methylierung als therapeutischer Ansatz
2.6 Methoden der Methylierungsanalyse
2.6.1 Methylierungsspezifische PCR (MSP)
2.6.2 Restriktionsenzyme
2.6.3 Immunpräzipitation durch spezifische Antikörper
2.6.4 Quantitative DNA-Methylierungsanalyse mittels Pyrosequenzierung
2.7 Primerdesign
2.8 Limitationen der Pyrosequenziertechnik
2.9 Auswahl der untersuchten Gene
3. Fragestellungen und Ziel der Arbeit
4. Material und Methoden
4.1 Probenmaterial
4.2 Material
4.2.1 Chemikalien/Reagenzien
4.2.2 Primer
4.2.3 Spezielle Verbrauchsmaterialien
4.2.4 Technische Geräte
4.3 Methoden
4.3.1. Zell-Isolierung
4.3.2 DNA-Extraktion
4.3.3 Bestimmung des DNA Gehaltes
4.3.4 Bisulfitkonvertierung
4.3.5 Erneute Bestimmung der DNA-Konzentration nach Bisulfidkonversion
4.3.6 Polymerase-Kettenreaktion
4.3.7 PCR-Produkt-Kontrolle mittels Gelagar-Elektrophorese
4.3.8 Template Präparation
4.3.9 Pyrosequenzierung
4.3.10 Oligonukleotid Micro-Array Analyse
4.3.11 Oligonukleotid Micro Array Daten-Analyse mittels Genespring
4.4. Statistische Tests
4.4.1 Korrelationskoeffizient
4.4.2 t-Test
4.4.3 Kruskal-Wallis Test und chi-Quadrat-Test
4.4.4 Kaplan-Meier Überlebenskurve
5. Ergebnisse
5.1. 14-3-3sigma (Stratifin)
5.1.1 Determinierung der CpG Region von 14-3-3sigma
5.1.2 Methlyierung von 14-3-3sigma
5.1.3 Expression von 14-3-3sigma
5.1.4 Korrelation der Genexpression und Methylierung von 14-3-3sigma mit klinischen Parametern
5.2 Heat shock protein 90 (Hsp90)
5.2.1 Determinierung der CpG Regionen von Hsp90
5.2.2 Methylierung von Hsp90
5.2.3 Expression von Hsp90
5.2.4 Korrelation der Genexpression und Methylierung von Hsp90 mit klinischen Parametern
5.3 METAP2
5.3.1 Determinierung der CpG Regionen von METAP2
5.3.2 Methylierung von METAP2
5.3.3 Expression von METAP2
5.3.4 Korrelation der Genexpression und Methylierung von METAP2 mit klinischen Parametern
5.4 Pax5
5.4.1 Determinierung der CpG Regionen von Pax5
5.4.2 Methylierung von Pax5
5.4.3 Expression von Pax5
5.4.4 Korrelation der Genexpression und Methylierung von Pax5 mit klinischen Parametern
5.5 Thioredoxin binding protein 2
5.5.1 Determinierung der CpG Region von Thioredoxin binding protein 2
5.5.2 Methylierung von Thioredoxin binding protein 2
5.5.3 Expression von Thioredoxin binding protein 2
5.6 Rho A
5.6.1 Determinierung der CpG Region von Rho A
5.6.2 Methylierung und Expression von Rho A
6. Diskussion
6.1 14-3-3sigma
6.1.1 Die Gruppe der 14-3-3-Proteine
6.1.2 Funktion der 14-3-3-Proteine
6.1.3 Einfluß der 14-3-3-Proteine auf den Zellzyklus
6.1.4 Chemoresistenz durch DNA-Reparatur und Zellzyklusarrest
6.1.5 Einfluß von 14-3-3-Proteinen auf die Apoptose mittels BAD
6.1.6 Einfluß der 14-3-3-Proteine auf die Apoptose
6.1.7 Genmetyhlierung von 14-3-3sigma
6.1.8 Ausblick: Inhibierung der 14-3-3-Proteine
6.2 Hsp90
6.2.1 Funktion von Hsp90
6.2.2 Hsp90 und KIT
6.2.3 Methylierung des Hsp90-Gens
6.3 METAP2
6.3.1 Funktion von METAP2
6.3.2 Die Rolle von METAP2 bei der ALL
6.3.3 Metyhlierung von METAP2
6.4 Pax5
6.4.1 Die Funktion von Pax5
6.4.2 Regulation und Dysregulation von Pax5
6.4.3 Rolle von Pax5 bei der ALL
6.4.4 Metyhlierung von Pax5
6.5 Thioredoxon binding protein 2
6.5.1 Zur Funktion von Thioredoxin und Thioredoxin binding protein 2
6.5.2 Überexpression von Thioredoxin
6.5.3 Methylierung von Thioredoxin binding protein 2
6.6 Rho A
6.6.1 Funktion von Rho A
6.6.2 Funktionelle Aspekte der GDI
6.6.3 Funktionelle Bedeutung der GDI-vermittelten Inhibierung des MAP-Signalwegs
6.6.4 Methylierung und Rho A
7. Zusammenfassung und Schlussfolgerung
8. Literaturverzeichnis
Verzeichnis der Abkürzungen
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
1. Einleitung
1.1 Einführung
Die Behandlung der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) hat sich in den vergangenen angenen Jahren durch die Kenntnis von prognostisch wichtigen molekularen Markern verändert. Mit diesen prognostischen Markern lässt sich das individuell Risiko eines Patienten mit dieser Erkrankung in Bezug auf das Therapieansprechen und den weiteren Verlauf bis zu einem bestimmten Grad vorhersagen. Allerdings sind im Gegensatz zu der ALL der B-Zellreihe (B-ALL) für die akute lymphatische Leukämie der T-Zellreihe (T-ALL) nur wenige molekularen genetischen Marker bekannt (Baldus, Martus et al. 2007). Neben der genetischen Veränderung der Leukämiezellen spielen allerdings auch epigenetische Veränderung in der Onkogenese und Progression der Erkrankung eine Rolle. Die wichtigste epigenetische Veränderung –als eine differenzielle Genexpression die nicht durch eine Änderung der Basensequenz der DNA bedingt ist- ist die DNA-Methylierung von Cytosinresten. Der DNA-Methylierung zellzyklusregulierender Gene kommt eine entscheidende Rolle in der Zelldifferenzierung, Wachstum und Apoptose zu. In der Vergangenheit konnte gezeigt werden, dass der Methylierungsstatus verschiedener Gene bei der ALL einen unabhängigen prognostischen Wert besitzt (Roman-Gomez, Cordeu et al. 2007). Die bisherigen Untersuchungen des Methylierungsstatus der DNA bei der T-ALL beruhten auf dem Verfahren der semiquantitativen methylierungsspezifischen PCR (MSP). Die Einführung der Pyrosequenzierung in die Untersuchung des Methylierungsstatus von DNA-Bereichen eröffnet die Möglichkeit der quantitativen Auswertung der Methylierung. Sie ist zum Teil automatisierbar und eignet sich zur hochparallelen Analyse von DNA-Proben. Ziel dieses Projektes war die Analyse der DNA-Methylierung relevanter Gene an Proben verschiedener lymphatischer Leukämien und insbesondere an Proben der T-ALL. Untersucht wurde die Korrelation von Genmethylierung und dem klinischen Ansprechen der Leukämiebehandlung.
1.2 Die akuten lymphatischen Leukämien (ALL)
Die akute lymphatische Leukämie (syn. akute lymphoblastische Leukämie, kurz ALL) ist eine akute Leukämie, die von Vorläuferzellen der Lymphozyten ausgeht. Die ALL ist eine seltene Erkrankung mit einer Inzidenz bezogen auf alle Altersgruppen von etwa 1,5 Neuerkrankungen/100.000 im Jahr. Am höchsten ist die Inzidenz der ALL im Kindesalter (5,3/100.000), fällt dann mit zunehmendem Alter kontinuierlich ab, um ab dem Alter von 35 Jahren erneut langsam anzusteigen. Ein zweiter Häufigkeitsgipfel liegt im Alter über 80 Jahren (2,3/100.000). Für Deutschland schätzt man etwa 500 Neuerkrankungen bei Erwachsenen und ebenfalls etwa 500 Neuerkrankungen bei Kindern pro Jahr (Hoelzer and Gökbuget 2007). Die Ätiologie der ALL ist weitgehend ungeklärt, und spezifische Umweltfaktoren sind nicht bekannt.
Für die weitere Subklassifikation der ALL spielt die Beurteilung der Zellmorphologie im Gegensatz zur AML nur eine untergeordnete Rolle. Entscheidend ist die Immunphänotypisierung der aus dem Blut oder mittels Knochenmarkpunktion gewonnenen Leukämiezellen, die mit dem FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) erfolgt (Bene, Castoldi et al. 1995). Das Expressionsmuster verschiedener lymphatischer, myeloischer und Vorläuferzell-Antigene ermöglicht die Zuordnung zur B- oder T-Zellreihe und die Festlegung des Differenzierungsstadiums. Man kann die ALL entsprechend dem Ergebnis der Immunphänotypisierung als B Linien-ALL (mit B-lymphozytärer Differenzierung, weiter unterteilbar in B-Vorläufer-ALL und reif(zellig)e B-ALL) oder T-Linien-ALL (mit T-lymphozytärer Differenzierung, weiter unterteilbar in T-Vorläufer-ALL und reife T-ALL) einordnen (s. Tabelle 1). Etwa 25% der akuten Lymphoblastenleukämie des Erwachsenalters gehören der T-Linie an.
Nach der Einführung intensiver Kombinationschemotherapien zu Beginn der 80er Jahre hat sich die Überlebensrate bei der ALL des Erwachsenen von weniger als 10% auf 35–40% verbessert (Annino, Vegna et al. 2002). Gleichzeitig wurden die diagnostischen Methoden erheblich verfeinert. Sie dienen zunächst der Identifikation der Subgruppen, die jede für sich eine unterschiedliche Prognose aufweisen. Bekannte Prognosefaktoren wie Alter, Leukozytenzahl, immunologischer Subtyp und zytogenetische oder molekulare Aberrationen gehen dabei mit ein. Sie werden ergänzt durch neuere Prognosefaktoren wie die minimale Resterkrankung und andere biologische Merkmale, wie molekulare Marker und schließlich potenzielle Zielstrukturen für therapeutische Ansätze wie Oberflächenantigene oder molekulare Aberrationen (Hoelzer and Gökbuget 2007).
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Tabelle 1
Einteilung der akuten lymphatischen Leukämie nach morphologischen, immunologischen und molekularen Kriterien an Hand von 946 Patienten (mod. n. (Ludwig, Raghavachar et al. 1994)) (s = surface; cy = intrazytoplasmatisch).
1.3 Prognosefaktoren und bedeutsame Untergruppen der ALL
Eine vollständige immunologische sowie zytogenetische und/oder molekulargenetische Charakterisierung ist bei der Diagnosestellung einer ALL zwingend erforderlich, um genauere Aussagen über Prognose und klinischen Verlauf zu treffen und entsprechend potenzielle Zielstrukturen für eine Antikörpertherapie zu identifizieren (Teitell and Pandolfi 2009).
Das leukämiefreie Überleben (LFS) bei erwachsenen ALL-Patienten zeigt in den einzelnen Subgruppen ein breites Spektrum zwischen <30% für Hoch- und Höchstrisikopatienten, wie etwa Patienten mit Ph/BCR-ABL-positiver ALL (Ph+ALL), und >50% für die Standardrisiko-B-Vorläufer-ALL, die reife B-ALL sowie die thymische T-ALL. Ein weiterer bekannter Prognosefaktor ist die initiale Leukozytenzahl von über 30.000 /μl bei der Diagnosestellung (Hoelzer, Thiel et al. 1988). Sie stellt bei B-Vorläufer-ALL derzeit den ungünstigsten Prognosefaktor dar. Bei der T-ALL ist eine hohe Leukozytenzahl zwar ebenfalls mit einer ungünstigeren Prognose assoziiert, hier fehlt allerdings ein klar definierter prognostischer Grenzwert. Die c- und Prä-B-ALL lassen sich ebenfalls in eine Niedrig- und Hochrisikogruppe unterteilen, wobei dort die klinischen Risikofaktoren – Alter, Leukozytenzahl und Zeit bis zum Erreichen einer CR die größte prognostische Bedeutung haben (s. Tabelle 2) (Hoelzer, Thiel et al. 1988).
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Tabelle 2
Bekannte und vermutete (?) Prognosefaktoren der akuten lymphatischen Leukämie mod. n. (Hoelzer and Gökbuget 2007).
1.4 Molekulare Prognosefaktoren der ALL
In der Vergangenheit konnten für den Verlauf und die Behandlung der ALL verschiedene Risikofaktoren gefunden werden, die das Ansprechen und der Erfolg einer chemotherapeutischen Behandlung mit beeinflussen können. Zu den etablierten Risikofaktoren gehören u.a. der genetisch Nachweis des BCR-ABL-Fusionsgens (Ribera, Ortega et al. 2002). Für die B-ALL konnten inzwischen weitere klinische und molekulare Prognosemarker identifiziert werden. Die Intensität einer Therapie richtet sich mittlerweile nach dem jeweils vorliegenden Risikoprofil.
Im Gegensatz dazu konnten bei der T-ALL bislang nur wenige für die Prognose relevante Marker und Risikofaktoren gefunden werden. Die Risikostratifizierung erfolgt daher bei der T-ALL bisher nur überwiegend nach klinischen Gesichtspunkten (Yanada, Jinnai et al. 2007). Die Suche nach neuen molekularen Prognosefaktoren bei der T-ALL ist ein wichtiger Schritt zur Risikostratifizierung in dieser Patientengruppe. Bezogen auf die T-ALL konnten erst kürzlich aus unserer Arbeitsgruppe mit den Genen ERG und BAALC zwei neue molekulare Prognosefaktoren gefunden werden, deren klinische Relevanz derzeit noch untersucht wird (Baldus, Martus et al. 2007).
2. Epigenetische DNA-Veränderungen
2.1 DNA-Methylierung
Epigenetik beschreibt die Untersuchung von Modifikationen der Genfunktion, die dabei jedoch ohne eine Veränderung des genetischen Codes erfolgen. Hierbei stellt die Methylierung von bestimmten DNA-Abschnitten ein wichtiges epigenetisches Phänomen dar, mit dessen Hilfe die Expression von Genen unter physiologischen Bedingungen reguliert werden kann (Campanero, Armstrong et al. 2000; Eng, Herman et al. 2000). DNA-Methylierung erfolgt an Cytosin-Resten und insbesondere an Dinukleotiden von Cytosin und Guanin (CpG). Die Dinukleotide treten in manchen DNA-Abschnitten gehäuft auf und werden dort als CpG-Inseln (CpG-Islands) bezeichnet. Sie sind üblicherweise in den regulatorischen Gegenden von Genen lokalisiert and können deren Transkription entscheidend beeinflussen. Es konnte gezeigt werden, dass eine Methylierung dieser CpG-Islands häufig mit einer reduzierten Expression de nachfolgenden Genregion assoziiert ist. Der genaue Mechanismus, mit dem die Hypermethylierung von genomischer DNA die Transkription beeinflusst, ist noch nicht bekannt.
Hierzu werden derzeit zwei Hypothesen diskutiert:
1. Direkte Blockade der Bindung von Transkriptionsfaktoren an die DNA durch die Methylierung.
2. Veränderung der Chromatinstruktur durch die Methylierung wodurch die spezifische Bindung von Transkriptionsfaktoren verhindert wird.
Aktuelle Untersuchungen konzentrieren sich auf das Zusammenspiel von DNA-Methylierung und Histon-Deacetylierung zur Regulation von Transkriptionsfaktoren (Jones and Wolffe 1999).
Neben den Mutationen und Deletionen ist die DNA-Methylierung ein weiterer wichtiger Faktor für die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen. Eine Vielzahl von Untersuchungen hat gezeigt, dass die Promotorregion der CDK-Inhibitoren p14ARF, p15INK4b und p16INK4a in soliden Tumoren häufig methyliert ist (Eads, Lord et al. 2000; Kim, Nelson et al. 2001). Wird die Expression dieser Gene gehemmt, kommt es zu einem nachfolgenden Verlust der Kontrolle des Zellzyklus, was in Verbindung mit anderen Ereignissen das Wachstum von Tumorzellen fördern kann. Weiterhin wurde eine Methylierung von CpG-islands im Tumorsuppressorgen RB1 gefunden, was zum Verlust der Expression dieses Genes in Tumorzellen führte (Simpson, Hibberts et al. 2000). Eine weitere Gruppe von Genen, deren Expression und damit auch deren Funktion durch den Vorgang der Methylierung gestört werden, sind die sogenannten DNA-Mismatch-Repairgene und Checkpoint-Gene.
Die Inaktivierung von MGMT oder 14-3-3sigma kann eine erhöhte Fehlerrate bei der Mitose zur Folge haben, was sich in einer verstärkten Inzidenz von Mutationen in Schlüsselgenen wie KRAS oder p53 widerspiegelt (Esteller, Hamilton et al. 1999; Esteller, Garcia-Foncillas et al. 2000). Aus in vivo und in vitro Untersuchungen ist bekannt, dass die DNA-Hypermethylierung eine zelluläre Reaktion auf die Exposition durch zytotoxische Substanzen darstellt (Nyce 1997). Es wird vermutet, dass dieser Vorgang an der Ausprägung eines chemoresistenten Phänotyps mitverantwortlich ist (Sinha, Hütter et al. 1999; Segura-Pacheco, Perez-Cardenas et al. 2006).
2.2 Regulation der DNA-Methylierung
Die Regulation der DNA-Methylierung erfolgt postreplikativ über DNA-Methyltransferasen (DNMT) DNMT 1, 2, 3A, 3B und 3L (Li, Nagai et al. 2002). Dabei gilt die DNMT 1 als Erhaltungs-Methyltransferase, da sie die höchste Affinität zur hemimethylierten- im Gegensatz zur unmethylierten DNA hat (Galm, Yoshikawa et al. 2003). DNMT 3A und 3B gelten als de novo Methyltransferasen und sind ursächlich für gewebe- oder zelllinienspeziefische Methylierungsmuster (Lin, Yeh et al. 2004). Die Aufrechterhaltung eines vorgegebenen Methylierungsmusters ist von essentieller Bedeutung. Bei einem kompletten Knock-down der DNMT bei Versuchstieren konnte eine letale Entwicklungsstörung in der Embryogenese nachgewiesen werden (Chim, Wong et al. 2004).
Im Gegensatz zum Vorgang der DNA-Metyhlierung sind die exakten Mechanismen der DNA-Demethylierung weniger bekannt. Zum einen kann 5-Methylcytosin gegen Cytosin ausgetauscht werden. Hierbei wird 5-Methylcystein durch das Enzym 5-Methylicystein-DNA-Glykosylase abgespalten und bei der anschließenden DNA-Reparatur durch die Base Cytosin ersetzt (Aggerholm, Guldberg et al. 1999). Zum anderen kann durch Hydrolyse mittels des Enzyms 5-Methylcytosin-Demethylase die Methylgruppe abgespalten werden (Frommer, McDonald et al. 1992).
2.3 DNA-Metyhlierung und Tumorerkrankung
Die Entstehung von Tumorerkrankungen wird durch eine Akkumulation von spezifischen Proliferationsvorteilen begünstigt, die in Zusammenhang mit einem schrittweisen Anwachsen von genetischen Veränderungen stehen. Vereinfacht gesagt können diese Veränderung bei zwei unterschiedlichen Arten von Genen beobachtet werden: Zum einen bei Tumorsuppressorgenen, die das Zellwachstum behindern und zum anderen den Onkogenen, die das Wachstum stimulieren und das Überleben der Zelle begünstigen. Die Funktionen dieser Gene werden bei der Entstehung von malignen Erkrankungen durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst. In den letzten Jahren hat sich das Augenmerk auf die epigenetischen Veränderung wie z.B. die Genmethylierung gerichtet, da sie im Gegensatz zur somatischen Genmutation reversibel ist und somit einen einfacheren Angriffspunkt für therapeutische Maßnahmen darstellen kann (s. Tabelle 3).
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Tabelle 3
Bekannte Assoziationen tumorbegünstigender Gene und die Auswirkungen der Genmetyhlierung. (AML= akute myeloische Leukämie, MDS= myelodysplastisches Syndrom) mod. n. (Gronbaek, Hother et al. 2007).
2.4 DNA-Methylierung bei der ALL
Eine genauere Analyse von epigenetischen Veränderung der DNA bei ALL-Patienten ist seit vielen Jahren Gegenstand intensiver Untersuchungen (s. Tabelle 4). Vor einiger Zeit konnte gezeigt werden, dass die Hypermethylierung bestimmter Gene einen prognostischen Einfluß hat. So konnte in einer Gruppe von 105 Patienten mit Hilfe des Calcitonin-Genes (CALC1) gezeigt werden, dass es in 43% der Fälle in einem hypermethylierten Zustand vorlag und dieses Patientenkollektiv somit in zwei Gruppen unterteilte. Es bestanden allerdings keine weiteren klinischen, immunologischen oder molekulargenetischen Unterschiede innerhalb dieser beiden Gruppen mit hypo- und hypermethyliertem CALC1. In der Gruppe mit hypermethylierten CALC1-Gen fand sich jedoch ein signifikant erhöhtes Risiko für einen Rückfall der Erkrankung (68% versus 19%, p < 0,00001). In der Multivariantenanalyse konnte gezeigt werden, dass Hypermethylierung von CALC1 ein unabhängiger Prognosefaktor für das LFS ist (Roman, Castillejo et al. 2001).
Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten auch an anderen Genen in einigen größeren Studien bestätigt werden (Roman-Gomez, Jimenez-Velasco et al. 2004). So konnte gezeigt werden, dass die abnorme Methylierung des Wnt-Inhibitors (u.a. SFRP1, SFRP2) mit einem deutlich verminderten zehn-Jahre-krankheitsfreien Überlebens assoziiert war (25% vs. 66%) (s. Abbildung 1) (Roman-Gomez, Cordeu et al. 2007).
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Abbildung 1
Überlebensanalyse von zwei Patientenuntergruppen mit T-ALL. Der Methylierungsgrad von 28 verschieden Genen wurde untersucht. Aus den Ergebnissen der Methylierungsanalysen wurden zwei Gruppen gebildet. Die erste, in der bis zu 2 der untersuchten Gene methyliert waren, und eine zweite Gruppe, in der mehr als 2 Gene von den untersuchten 28 methyliert waren. Die zweite Gruppe hatte einen deutlich schlechteren klinischen Verlauf als die erste (mod. n. (Roman-Gomez, Jimenez-Velasco et al. 2004)).
In unserer Arbeitsgruppe wurde bislang der Methylierungsstatus bezüglich des ERG-Genes untersucht. Es stellte sich heraus, dass bei der T-ALL im Gegensatz zur akuten myeloischen Leukämie nur die Isoform 3 des ERG-Gens und nicht die Isoform 2 exprimiert wird. Die Methylieungsanalyse zeigte eine Hypermethylierung in der Promotoregion des ERG2-Gens, die zu einem Silencing der Expression geführt hatte (Bohne, Schlee et al. 2009).
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Tabelle 4
Übersicht über die Methylieungsanalysen verschiedener Gene bei der akuten T-lymphoblasten Leukämie. MSP= methylierungsspezifische PCR, T-ALL (zl) = Zelllinie, T-ALL (ch) = kindliche T-ALL
2.5 DNA-Methylierung als therapeutischer Ansatz
Die Vielzahl von Einzeldaten zur DNA-Methylierung in Tumorzellen von hämatopoetischen Neoplasien hat zur Etablierung von Therapieverfahren mit demethylierenden Substanzen wie Azacitidine (5-Aza-Cytidine) und Decitabine (5-Deoxy-2-Cytidine) geführt. Allerdings sind über die genaueren Mechanismen der fehlerhaften Methylierung und insbesondere über die Änderung von Methylierungsmustern während der hämatopoetischen Proliferation und Differenzierung bisher wenig bekannt.
DNA (Cytosin-5) – Methyltransferasen 1, 3A und 3B (DNMT) sind Enzyme, die sich im Zytoplasma von humanen hämatopoetischen Zellen befinden. Die Aktivität dieser Enzyme führt zur Methylierung von DNA-Abschnitten, was einen direkten Einfuß auf die Bindung von Transkriptionsfaktoren hat und damit entscheidend die Regulation der Transkription beeinflusst und in der weiteren Folge auch die Genexpression (Mortusewicz, Schermelleh et al. 2005). Dieses Phänomen ist auf der einen Seite für die physiologische Steuerung der Transkription von großer Bedeutung (Anpassung der Genexpression an die verschiedenen Wachstumsphasen von humanen Zellen, Aktivierung bzw. Deaktivierung von Stoffwechselwegen in Abhängigkeit von äußeren Einflüssen etc.), auf der anderen Seite kann die fehlerhafte Expression der Methyltransferasen selbst zu abnormaler Methylierung und damit zur Störung der Transkription, zum Beispiel von Tumorsuppressorgenen, führen.
Durch den erfolgreichen Einsatz der demetyhlierenden Substanzen wie Azacitidine und Decitabine bei der Behandlung des myelodysplastischen Syndroms hat die Entwicklung weiterer Therapieansätze zur Beeinflussung des Metyhlierungsstatus von Neoplasien neuen Aufschwung erhalten (Issa and Kantarjian 2009).
2.6 Methoden der Methylierungsanalyse
2.6.1 Methylierungsspezifische PCR (MSP)
Ein etabliertes Verfahren zu Bestimmung der DNA-Methylierung ist die methylierungsspezifische PCR (MSP). Die MSP ist ein Verfahren, bei dem unmethylierte Cytosine in der DNA durch die Zugabe von Natriumbisulfit zu Uracil deaminiert werden. Durch sequenzspezifische Primer kann anschließend eine bestimmte Region durch eine PCR auf ihren Methylierungsgrad hin untersucht werden. Die Primerpaare unterscheiden sich –trotz der gleichen Bindungsregion- hierbei in ihrer Sequenz. Die Revers-Primer, welche an unmethylierte DNA binden, haben in ihrer Sequenz statt dem ursprünglichen Guanin generell ein Adenin, da dieses mit Uracil, dem durch Natriumbisulfit deaminierten Cytosin, ein Basenpaar ausbilden kann. Die Forward-Primer für eine unmethylierte Promotorsequenz weisen statt eines Cytosins ein Thymin in ihrer Sequenz auf. Bei den Reverse-Primern, mit deren Hilfe methylierte DNA amplifiziert wird, bleiben die Guanine, die komplementär zum Cytosin der CpG-Sequenzen, in der Primersequenz erhalten, da die 5-Methyl-Cytosine in der DNA nicht durch Natriumbisulfit deaminiert werden. Das Verfahren liefert ein semiquantitatives Ergebnis bezüglich der untersuchten Region (Coffee 2009).
2.6.2 Restriktionsenzyme
Neben den „klassischen“, auf der Bisulfidkonvertierung basierenden Methylierungsanalysetechniken, existieren weitere Verfahren zur Quantifizierung der DNA-Genmethylierung. Diese nutzen die Funktion von Restriktionsenzymen, die die DNA insbesondere an den unmethylierten Stellen schneidet. Die Fragmente werden anschließend in einer Multiplex-PCR amplifiziert und können mittels mittels eines Streptavidin – Fluoreszenzfarbstoff-Konjugats mit einer CHIP-Technik detektiert werden. Begrenzt wird der Einsatz der robusten Methode durch das Profil der Bindungsstellen der Restriktionsenzyme (Bird and Southern 1978).
2.6.3 Immunpräzipitation durch spezifische Antikörper
Dieser Ansatz basiert auf dem Gehalt an Methylcystein einer DNA-Region und ist besonders effizient bei einer hohen Dichte an CpG-Dinulkleotiden. Nach DNA-Fragmentierung und Bindung des Antikörpers an methylierte Cytosinreste können die so entstandenen Immunpräzipitate durch sich anschließende Techniken wie Micro-Array quantifiziert werden (Weber, Davies et al. 2005).
2.6.4 Quantitative DNA-Methylierungsanalyse mittels Pyrosequenzierung
Die Quantifizierung von Methylcytosin im menschlichen Genom ist für viele Standardmethoden der DNA-Analyse, wie z.B. der Sanger-Didesoxy-Sequenzierung oder der konventionellen PCR nicht durchführbar. Allerdings lässt sich Methylcytosin sehr einfach durch die Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit nachweisen. Die Inkubation der Ziel-DNA mit Natrium-Bisulfid führt zu einer Konversion der unmethylierten Cytosinreste zu Uracil, währen die bereits methlyierten Cytosin-Reste unverändert bleiben. Die epigenetische Modifikation der Methylgruppe am C-5-Atom des Cytosins wird durch diese Behandlung in einen Primärsequenzunterschied übersetzt (Frommer, McDonald et al. 1992). Damit wird ein C/T-Polymorphismus kreiert, dessen Quantifizierung ein Maß für den ursprünglichen Methylierungsgrad an dieser Position ist. Lange Zeit konnten nur kurze Sequenzen mit wenigen Methylierungsstellen analysiert werden. Erst die neusten Entwicklung ermöglichen die Sequenzierung von über 100 Basenpaaren mit beliebig vielen Methylierungsstellen (Brakensiek, Wingen et al. 2007).
Die Pyrosequenzierung ist eine gut etablierte Technologie, die auf dem Prinzip der Sequenzierung durch Synthese basiert. Mit Hilfe dieser Technologie ist es möglich schnell und kostengünstig Mutationsanalysen durchzuführen und Polymorphismen und epigenetischen Veränderung der DNA-Methylierung zu identifizieren und diese zu quantifizieren.
Die Technologie der Pyrosequenzierung nutzt die Fähigkeit der DNA-Polymerase zum Ablesen der DNA. Dabei wird die DNA-Polymerase gewissermaßen "in Aktion" beobachtet. Die einzelnen Schritte beinhalten:
1. Amplifikation der DNA in einer konventionellen PCR.
2. Anlagerung eines speziellen Sequenzprimers an die amplifizierte DNA im anschließenden Pyrosequenzierungs-Assay.
3. Hinzugabe von DNA-Polymerase, ATP-Sulfurylase, Luciferase and Apyrase, Nukleosidtriphosphate (dNTPs) als Substrate, Adenosin-5´-Phosphosulfat (APS) sowie Luciferin neben den o.g. Sequenzierprimern.
4. Hinzufügen der dNTPsIst eines komplementär zu einer Base in der Ziel-DNA, katalysiert die DNA-Polymerase dessen Einbau in den neusynthetisierten Strang.
5. Freisetzung von Pyrophosphat (PPi). Die Quantität des freigesetzten PPi ist äquimolar zur Menge des eingebauten Nukleotids.
6. Quantitative Umsetzung des freigesetzten PPi durch die ATP-Sulfurylase zu ATP in Gegenwart von APS.
7. ATP bewirkt die durch die Luciferase angetriebene Umwandlung von Luciferin zu Oxyluciferin. Oxyluciferin generiert sichtbares Licht, dessen Intensität proportional zur Menge des neu-synthesierten ATP ist.
8. Detektion des entstehenden Lichtes durch eine CCD-Kamera detektiert (Pyrogram), wobei die Signalstärke proportional zur Anzahl der eingebauten Nukleotide ist.
9. Nicht eingebaute dNTPs und überschüssiges ATP werden kontinuierlich durch die Apyrase degradiert. Ein weiteres dNTP wird erst zur Reaktion gegeben, wenn die Degradierung vollständig ist.
10. Schrittweise Synthetisierung des neuen DNA-Stranges und Ermittlung der Nucleotidsequenz mit Hilfe der Signale aus dem Pyrogramm.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abbildung 2
Pyrogramm einer prä B-ALL-Probe. Die Sequenz am oberen Abbildungsrand spiegelt die zu untersuchende DNA-Sequenz wieder. Unten sind die vom Gerät eingespritzen Nukelotide und die daraus resultierenden Lichtemissionen als sog. Peaks angegeben. Die analysierten CpG Region sind grau unterlegt. Die über dem Balken dargestellten Zahlen zeigen den gemessenen Anteil an methylierten Cytosin-Resten der CpG-Stellen an.
2.7 Primerdesign
Die allgemein akzeptierte Definition von CpG-Inseln beinhaltet einen CpG-Anteil von mehr als 50% auf einem 200 bp langen DNA-Teilstück (Gardiner-Garden and Frommer 1987). Entsprechende Suchalgorithmen sind verfügbar, die an ausgewählten DNA-Sequenzen die Verteilung von CpG-Insel auswerten und graphisch darstellen können (http://cpgislands.usc.edu/).
Die Sequenz der Primer sollte möglichst spezifisch für das gewünschte Amplifika-tionsprodukt sein, damit der Primer an der gewünschten Stelle binden kann. Auf der einen Seite sollten sich am 3`Ende ein bis zwei Basen Guanin oder Cytosin befinden, damit eine bessere Bindung und Elongation erzielt werden kann. Auf der anderen Seite sollten sich am 3`Ende höchstens drei Basen Guanin oder Cytosin befinden, da es sonst zur Stabilisierung fehlhybridisierende Primer und in Folge zu unspezifischen Amplifikationsprodukten kommt. Die Primer sollten keine internen Sekundärstrukturen wie Haarnadeln bilden, weil diese die Wahrscheinlichkeit des Hybridisierens mit der Template-DNA reduzieren. Weiterhin dürfen die Primer nicht miteinander hybridisieren und sollten eine möglichst geringe Komplementarität an ihrem 3`Ende besitzen, um die Bildung von Primerdimeren zu verhindern. Die Schmelzpunkttemperatur beider Primer (forward und reverse) sollte in etwa gleich sein, um ein gleichmäßiges Annealing zu ermöglichen (Roche Molecular Biochemicals 2000).
2.8 Limitationen der Pyrosequenziertechnik
Die derzeit noch geringe Leseweite (maximal 150 bp für einen Sequenzierprimer) ist gerade für die Methylierungsanalytik ein Nachteil, da für die Erfassung einer ganzen CpG-Insel oftmals mehrere PCR-Produkte sowie eine ganze Reihe gestaffelt angeordneter Primer erforderlich sind. Die strikte Korrelation zwischen Menge an eingebautem Nukleotid und emittierter Lichtintensität ist nur für drei oder vier gleiche Nukleotide in Folge gegeben. Poly(dT)-Abschnitte, die in Bisulfit-behandelter DNA häufig auftreten und nicht selten vor einer potenziellen Methylierungsstelle liegen, können ab einer Länge von fünf Thymidinen eine zuverlässige Quantifizierung der nachfolgenden Methylierungsstelle verhindern. Die zu beobachtenden schwachen Hintergrundsignale erschweren zudem den Einsatz der Pyrosequenziertechnik für die Analyse kleinster Mengen aberrant methylierter DNA in leicht zugänglichen Körperflüssigkeiten wie Blut oder Urin.
Trotz dieser abschließend aufgezählten Nachteile bzw. Limitationen ist die Pyrosequenziertechnik für sehr viele Fragestellungen, insbesondere in der molekularen Diagnostik, die momentan effektivste und zuverlässigste technische Lösung für die Analyse der DNA-Methylierung.
2.9 Auswahl der untersuchten Gene
Die Auswahl der untersuchten Gene erfolgte im Hinblick auf verschiedene Kriterien. Am Anfang erfolgte eine ausgedehnte Literatursuche bezüglich bereits untersuchter Gene, die bei der T-ALL eine wichtige Rolle spielen um etwaige Redundanz zu vermeiden. Anschließend erfolgte eine weitere Literatursuche im Hinblick auf zuvor bei anderen Tumorentitäten vorbeschriebener Gene, bei denen der Methylierungstatus einen Effekt auf die Funktion und Expression des Genes gezeigt hatten, bei den lymphatischen Leukämien allerdings noch nicht hinreichend untersucht war (14-3-3sigma, Thioredoxin binding protein 2). Darüberhinaus erfolgte eine Auswahl an Genen, die im Zusammenhang mit den hämatologischen Neoplasien stehen, über deren Methylierungsverhalten jedoch nichts bekannt ist (Hsp90, Pax5, Rho A). Schließlich wurden bereits zuvor erhobenen Daten und Ergebnisse an Untersuchen bei der prä-B-ALL herangezogen und die dort gefundene differentielle Genexpresssion in determinierten Riskiogruppen mit in die Untersuchungen einbezogen (METAP2).
3. Fragestellungen und Ziel der Arbeit
Die Diagnostik und die Therapie der akuten Lymphoblastenleukämie hat in den vergangenen 30 Jahren bedeutende Fortschritte erfahren. Ein wesentlicher Beitrag entstand durch die Riskiostratifizierung von Patienten anhand genetischer bzw. epigenetischer Marker. Hierdurch konnte die Intensität einer Behandlung an den individuellen Fall angepasst werden. Eindrücklich zeigt sich dies am Beispiel der Ph+/BCR-ABL positiven B-ALL. Allerdings sind etwa ein Viertel aller akuten lymphatischen Leukämien der T-Zellreihe zugeordnet, für die bisher vor allem klinische und nur wenige verlässliche molekulare oder epigenetische Prognosemarker beschrieben wurden.
Es ist bekannt, dass epigenetische Veränderung wie die Hypermethylierung einen prognostischen Einfluß auf die Behandlung der T-ALL haben können. Die Gene, die dieser allgemeinen Beobachtung zu Grunde liegen, sind allerdings im Einzelnen nicht charakterisiert.
Ziel dieser Arbeit ist es, einen Beitrag zur besseren Kenntnis epigentischer Veränderung der Genmetyhlierung verschiedener differenzierungs-, chemoresistenz- und tumorprogressionsrelevanter Gene zu liefern und darüber hinaus resultierende prognostische Marker der T-ALL mit Hilfe epigenetischer Analysen des Methylierungsstatus zu detektieren.
4. Material und Methoden
4.1 Probenmaterial
Die einzelnen Untersuchungen erfolgten aus asservierten DNA-Proben aus Knochenmarkaspiraten der MILE-Studie (Microarray Innovation in LeukEmia-Studie, MML, München) sowie aus den GMALL-Studien 3/95, 6/99 und 7/2003 der JW Goethe Universität Frankfurt/M. (Haferlach, Kohlmann et al. 2005; Hoelzer and Gökbuget 2007) (s. Tabelle 5).
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Tabelle 5
Charakteristika der Patienten mit T-ALL und B-ALL
Die Proben aus der Kontrollgruppe stammen von Knochenmarkaspiraten gesunder Spender und Knochenmarkspräparationen aus dem caput femoris von Patienten ohne hämatologischen Erkrankungen im Rahmen einer totalen Hüftendoprothese (TEP) (s. Tabelle 6).
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Tabelle 6
Charakteristika der gesunden Kontrollgruppe
4.2 Material
Zur Durchführung der Analysen waren die im Folgenden aufgeführten materiellen Voraussetzungen notwendig.
4.2.1 Chemikalien/Reagenzien
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
4.2.2 Primer
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Tabelle 7
Lyophilisierte Primer vom Reinheitsgrad: HPLC wurden von Metabion, Martinsried (D) bezogen. (FW = forward PCR Primer, Rev(B) = biotinierter reverse PCR Primer, Seq = Sequenzierungs PCR Primer)
4.2.3 Spezielle Verbrauchsmaterialien
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
4.2.4 Technische Geräte
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
4.3 Methoden
4.3.1. Zell-Isolierung
Prinzip:
Nach vorhergehender Isolation aus Blut- oder Knochenmarksproben wird die zur Analyse benötigte DNA aus mononukleären Zellen bzw. Blasten gewonnen.
Durchführung:
Im ersten Arbeitsschritt werden die Erythrozyten in der Blut- bzw. Knochenmarkprobe aufgelöst. Hierzu wird das Material in ein Standardzentrifugenröhrchen überführt, bis 50 ml mit Lyse-Puffer aufgefüllt und für 20 Minuten auf Eis gelegt. Anschließend erfolgt eine Zentrifugation für 5 Minuten bei 2.000 Umdrehungen pro Minute (U/min). Nach Abgießen des Überstandes wird der Behälter bis 50 ml mit PBS-Lösung aufgefüllt und der Zentrifugationsvorgang wiederholt. Nach Abnehmen des Überstandes wird das sich am Boden befindliche Zellmaterial in PBS-Lösung aufgenommen. Die Leukozytenzahl wird mit dem Cell Dyn 3700 bestimmt. Um ausreichend DNA für die Analysen zu erhalten, sollten ca. 2 Mio. mononukleärer Zellen bzw. Blasten in der zu untersuchenden Probe vorhanden sein.
4.3.2 DNA-Extraktion
Prinzip:
Nach Angaben des Herstellers wurde aus den ficollisierten Blutproben durch Phenol/Chlorophorm-Extraktion unter Verwendung von Trizol-Reagenz die Gesamt-DNA gewonnen (Chomczynski and Sacchi 1987).
Durchführung:
Die Denaturierung der Zellen erfolgte nach Zugabe von 1 ml Trizol. Nach Hinzufügen von 0,2 ml Chloroform wurde für 5 Min. bei Raumtemperatur inkubiert und zur Trennung der wässrigen von der phenolischen Phase für 15 Min. bei 10 600 upm und 4°C zentrifugiert. Der wässrigen Phase werden 300 ml 100%igen Ethanols zur DNA-Fällung zugegeben. Nach Zentrifugatation wird das so entstandene DNA-Pellet zweimal mit Natriumcitrat-Lösung und abschließend mit 70%igem Ethanol gewaschen. Abschließend wird das DNA-Pellet in 8 mM Natronlauge gelöst und bis zur Weiterverarbeitung bei 4° C gelagert.
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