Untersuchung der DNA-Methylierung zellzyklus- und differenzierungsrelevanter Gene als mögliche Prognosefaktoren der akuten lymphatischen Leukämie mittels Pyrosequenzierung

Professorial Dissertation , 2012 , 123 Pages

Medicine - Internal Medicine

Die Behandlung der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) hat sich in den vergangenen
Jahren durch die Kenntnis von prognostisch wichtigen molekularen Markern verändert.
Mit diesen prognostischen Markern lässt sich das individuell Risiko eines Patienten
mit dieser Erkrankung in Bezug auf das Therapieansprechen und den weiteren
Verlauf bis zu einem bestimmten Grad vorhersagen. Allerdings sind im Gegensatz zu
der ALL der B-Zellreihe (B-ALL) für die akute lymphatische Leukämie der T-Zellreihe
(T-ALL) nur wenige molekularen genetischen Marker bekannt (Baldus, Martus et al.
2007). Neben der genetischen Veränderung der Leukämiezellen spielen allerdings
auch epigenetische Veränderung in der Onkogenese und Progression der Erkrankung
eine Rolle. Die wichtigste epigenetische Veränderung –als eine differenzielle Genexpression
die nicht durch eine Änderung der Basensequenz der DNA bedingt ist- ist
die DNA-Methylierung von Cytosinresten. Der DNA-Methylierung zellzyklusregulierender
Gene kommt eine entscheidende Rolle in der Zelldifferenzierung, Wachstum und
Apoptose zu. In der Vergangenheit konnte gezeigt werden, dass der Methylierungsstatus
verschiedener Gene bei der ALL einen unabhängigen prognostischen Wert besitzt
(Roman-Gomez, Cordeu et al. 2007). Die bisherigen Untersuchungen des Methylierungsstatus
der DNA bei der T-ALL beruhten auf dem Verfahren der semiquantitativen
methylierungsspezifischen PCR (MSP). Die Einführung der Pyrosequenzierung in
die Untersuchung des Methylierungsstatus von DNA-Bereichen eröffnet die Möglichkeit
der quantitativen Auswertung der Methylierung. Sie ist zum Teil automatisierbar
und eignet sich zur hochparallelen Analyse von DNA-Proben. Ziel dieses Projektes
war die Analyse der DNA-Methylierung relevanter Gene an Proben verschiedener
lymphatischer Leukämien und insbesondere an Proben der T-ALL. Untersucht wurde
die Korrelation von Genmethylierung und dem klinischen Ansprechen der Leukämiebehandlung.[...]

Inhaltsverzeichnis

• VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN
• 1. EINLEITUNG
  • 1.1 Einführung
  • 1.2 Die akuten lymphatischen Leukämien (ALL)
  • 1.3 Prognosefaktoren und bedeutsame Untergruppen der ALL
  • 1.4 Molekulare Prognosefaktoren der ALL
• 2. EPIGENETISCHE DNA-VERÄNDERUNGEN
  • 2.1 DNA-Methylierung
  • 2.2 Regulation der DNA-Methylierung
  • 2.3 DNA-Metyhlierung und Tumorerkrankung
  • 2.4 DNA-Methylierung bei der ALL
  • 2.5 DNA-Methylierung als therapeutischer Ansatz
  • 2.6 Methoden der Methylierungsanalyse
    • 2.6.1 Methylierungsspezifische PCR (MSP)
    • 2.6.2 Restriktionsenzyme
    • 2.6.3 Immunpräzipitation durch spezifische Antikörper
    • 2.6.4 Quantitative DNA-Methylierungsanalyse mittels Pyrosequenzierung
  • 2.7 Primerdesign
  • 2.8 Limitationen der Pyrosequenziertechnik
  • 2.9 Auswahl der untersuchten Gene
• 3. FRAGESTELLUNGEN UND ZIEL DER ARBEIT
• 4. MATERIAL UND METHODEN
  • 4.1 Probenmaterial
  • 4.2 Material
    • 4.2.1 Chemikalien/Reagenzien
    • 4.2.2 Primer
    • 4.2.3 Spezielle Verbrauchsmaterialien
    • 4.2.4 Technische Geräte
  • 4.3 Methoden
    • 4.3.1 Zell-Isolierung
    • 4.3.2 DNA-Extraktion
    • 4.3.3 Bestimmung des DNA Gehaltes
    • 4.3.4 Bisulfitkonvertierung
    • 4.3.5 Erneute Bestimmung der DNA-Konzentration nach Bisulfidkonversion
    • 4.3.6 Polymerase-Kettenreaktion
    • 4.3.7 PCR-Produkt-Kontrolle mittels Gelagar-Elektrophorese
    • 4.3.8 Template Präparation
    • 4.3.9 Pyrosequenzierung
    • 4.3.10 Oligonukleotid Micro-Array Analyse
    • 4.3.11 Oligonukleotid Micro Array Daten-Analyse mittels Genespring
  • 4.4 Statistische Tests
    • 4.4.1 Korrelationskoeffizient
    • 4.4.2 t-Test
    • 4.4.3 Kruskal-Wallis Test und chi-Quadrat-Test
    • 4.4.4 Kaplan-Meier Überlebenskurve
• 5. ERGEBNISSE
  • 5.1 14-3-3sigma (Stratifin)
    • 5.1.1 Determinierung der CpG Region von 14-3-3sigma
    • 5.1.2 Methlyierung von 14-3-3sigma
    • 5.1.3 Expression von 14-3-3sigma
    • 5.1.4 Korrelation der Genexpression und Methylierung von 14-3-3sigma mit klinischen Parametern
  • 5.2 Heat shock protein 90 (Hsp90)
    • 5.2.1 Determinierung der CpG Regionen von Hsp90
    • 5.2.2 Methylierung von Hsp90
    • 5.2.3 Expression von Hsp90
    • 5.2.4 Korrelation der Genexpression und Methylierung von Hsp90 mit klinischen Parametern
  • 5.3 METAP2
    • 5.3.1 Determinierung der CpG Regionen von METAP2
    • 5.3.2 Methylierung von METAP2
    • 5.3.3 Expression von METAP2
    • 5.3.4 Korrelation der Genexpression und Methylierung von METAP2 mit klinischen Parametern
  • 5.4 Pax5
    • 5.4.1 Determinierung der CpG Regionen von Pax5
    • 5.4.2 Methylierung von Pax5
    • 5.4.3 Expression von Pax5
    • 5.4.4 Korrelation der Genexpression und Methylierung von Pax5 mit klinischen Parametern
  • 5.5 Thioredoxin binding protein 2
    • 5.5.1 Determinierung der CpG Region von Thioredoxin binding protein 2
    • 5.5.2 Methylierung von Thioredoxin binding protein 2
    • 5.5.3 Expression von Thioredoxin binding protein 2
  • 5.6 Rho A
    • 5.6.1 Determinierung der CpG Region von Rho A
    • 5.6.2 Methylierung und Expression von Rho A
• 6. DISKUSSION
  • 6.1 14-3-3sigma
    • 6.1.1 Die Gruppe der 14-3-3-Proteine
    • 6.1.2 Funktion der 14-3-3-Proteine
    • 6.1.3 Einfluß der 14-3-3-Proteine auf den Zellzyklus
    • 6.1.4 Chemoresistenz durch DNA-Reparatur und Zellzyklusarrest
    • 6.1.5 Einfluß von 14-3-3-Proteinen auf die Apoptose mittels BAD
    • 6.1.6 Einfluß der 14-3-3-Proteine auf die Apoptose
    • 6.1.7 Genmetyhlierung von 14-3-3sigma
    • 6.1.8 Ausblick: Inhibierung der 14-3-3-Proteine
  • 6.2 Hsp90
    • 6.2.1 Funktion von Hsp90
    • 6.2.2 Hsp90 und KIT
    • 6.2.3 Methylierung des Hsp90-Gens
  • 6.3 METAP2
    • 6.3.1 Funktion von METAP2
    • 6.3.2 Die Rolle von METAP2 bei der ALL
    • 6.3.3 Metyhlierung von METAP2
  • 6.4 Pax5
    • 6.4.1 Die Funktion von Pax5
    • 6.4.2 Regulation und Dysregulation von Pax5
    • 6.4.3 Rolle von Pax5 bei der ALL
    • 6.4.4 Metyhlierung von Pax5
  • 6.5 Thioredoxon binding protein 2
    • 6.5.1 Zur Funktion von Thioredoxin und Thioredoxin binding protein 2
    • 6.5.2 Überexpression von Thioredoxin
    • 6.5.3 Methylierung von Thioredoxin binding protein 2
  • 6.6 Rho A
    • 6.6.1 Funktion von Rho A
    • 6.6.2 Funktionelle Aspekte der GDI
    • 6.6.3 Funktionelle Bedeutung der GDI-vermittelten Inhibierung des MAP-Signalwegs
    • 6.6.4 Methylierung und Rho A

Zielsetzung und Themenschwerpunkte

Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der DNA-Methylierung zellzyklus- und differenzierungsrelevanter Gene als mögliche Prognosefaktoren bei akuter lymphatischer Leukämie (ALL), insbesondere der T-ALL. Es soll die Korrelation zwischen Genmethylierung und dem klinischen Ansprechen auf die Behandlung analysiert werden.

• DNA-Methylierung als epigenetischer Modifikation in ALL
• Analyse der Methylierung verschiedener Gene (14-3-3sigma, Hsp90, METAP2, Pax5, Thioredoxin binding protein 2, Rho A) in ALL-Proben.
• Korrelation von Genmethylierung und Genexpression
• Zusammenhang zwischen Genmethylierung und klinischen Parametern (Alter, Geschlecht, Leukozytenzahl, ALL-Subtyp)
• Identifikation potentieller prognostischer Marker für T-ALL

Zusammenfassung der Kapitel

1. Einleitung: Dieses Kapitel führt in die Thematik der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) ein, beschreibt die Bedeutung molekularer Marker für die Prognose und hebt die Notwendigkeit der Erforschung epigenetischer Faktoren, insbesondere der DNA-Methylierung, bei der T-ALL hervor. Es wird die Bedeutung der quantitativen DNA-Methylierungsanalyse mittels Pyrosequenzierung im Vergleich zu bisherigen Methoden betont und das Ziel der Arbeit, die Analyse der DNA-Methylierung relevanter Gene und deren Korrelation mit dem klinischen Ansprechen auf die Leukämiebehandlung, formuliert.

2. Epigenetische DNA-Veränderungen: Das Kapitel beschreibt das Phänomen der DNA-Methylierung, ihre Rolle in der Genregulation und ihre Bedeutung bei Tumorerkrankungen. Es werden die Mechanismen der DNA-Methylierung und -Demethylierung erläutert, sowie verschiedene Methoden zur Methylierungsanalyse, inklusive der Pyrosequenzierung, detailliert dargestellt. Die Limitationen der Pyrosequenzierung werden ebenso angesprochen wie die Auswahlkriterien für die untersuchten Gene.

3. Fragestellungen und Ziel der Arbeit: Dieses Kapitel fasst die Forschungsfragen und das übergeordnete Ziel der Arbeit zusammen. Es betont den Mangel an zuverlässigen molekularen und epigenetischen Prognosemarkern für T-ALL im Vergleich zur B-ALL und formuliert das Ziel, epigenetische Veränderungen der Genmethylierung zu untersuchen und daraus resultierende prognostische Marker zu identifizieren.

4. Material und Methoden: Dieses Kapitel beschreibt detailliert das verwendete Probenmaterial (Knochenmarkaspirate aus verschiedenen Studien), die verwendeten Materialien (Chemikalien, Reagenzien, Primer, Geräte) und die angewandten Methoden (Zellisolierung, DNA-Extraktion, Bisulfitkonvertierung, PCR, Pyrosequenzierung, statistische Analysen). Es werden die einzelnen Schritte der experimentellen Verfahren ausführlich dargestellt.

5. Ergebnisse: Das Kapitel präsentiert die Ergebnisse der DNA-Methylierungs- und Genexpressionsanalysen für die sechs untersuchten Gene (14-3-3sigma, Hsp90, METAP2, Pax5, Thioredoxin binding protein 2, Rho A) in verschiedenen ALL-Subgruppen und der Kontrollgruppe. Die Ergebnisse werden in Tabellen und Abbildungen dargestellt, inklusive der Korrelationsanalysen zwischen Genmethylierung, Genexpression und klinischen Parametern.

Schlüsselwörter

Akute lymphatische Leukämie (ALL), T-Zell ALL, DNA-Methylierung, Pyrosequenzierung, Genexpression, Prognosefaktoren, 14-3-3sigma, Hsp90, METAP2, Pax5, Thioredoxin binding protein 2, Rho A, Zellzyklus, Zelldifferenzierung, Chemoresistenz.

Häufig gestellte Fragen (FAQ) zur Arbeit: DNA-Methylierung zellzyklus- und differenzierungsrelevanter Gene als mögliche Prognosefaktoren bei akuter lymphatischer Leukämie (ALL)

Was ist das Hauptthema dieser wissenschaftlichen Arbeit?

Die Arbeit untersucht die DNA-Methylierung verschiedener Gene als mögliche Prognosefaktoren bei akuter lymphatischer Leukämie (ALL), insbesondere der T-ALL. Der Fokus liegt auf der Korrelation zwischen Genmethylierung, Genexpression und dem klinischen Ansprechen auf die Behandlung.

Welche Gene wurden untersucht?

Die Studie analysiert die DNA-Methylierung und Genexpression von sechs Genen: 14-3-3sigma, Hsp90, METAP2, Pax5, Thioredoxin-bindendes Protein 2 und Rho A.

Welche Methode wurde zur DNA-Methylierungsanalyse verwendet?

Die quantitative DNA-Methylierungsanalyse erfolgte mittels Pyrosequenzierung. Die Arbeit beschreibt detailliert diese Methode und vergleicht sie mit anderen Techniken.

Welches Probenmaterial wurde verwendet?

Das Probenmaterial besteht aus Knochenmarkaspiraten von Patienten mit ALL aus verschiedenen Studien. Die Arbeit spezifiziert die Herkunft und Charakteristika der Proben.

Welche klinischen Parameter wurden berücksichtigt?

Die Korrelation der Genmethylierung wurde mit verschiedenen klinischen Parametern analysiert, darunter Alter, Geschlecht, Leukozytenzahl und ALL-Subtyp.

Welche Ergebnisse wurden erzielt?

Die Arbeit präsentiert die Ergebnisse der DNA-Methylierungs- und Genexpressionsanalysen für die sechs untersuchten Gene in verschiedenen ALL-Subgruppen und einer Kontrollgruppe. Die Ergebnisse werden in Tabellen und Abbildungen dargestellt, inklusive der Korrelationsanalysen zwischen Genmethylierung, Genexpression und klinischen Parametern. Es wird untersucht, ob die Methylierung dieser Gene als prognostischer Marker für den Verlauf der Krankheit dienen kann.

Welche Schlussfolgerungen werden gezogen?

Die Diskussion interpretiert die Ergebnisse im Kontext des aktuellen Wissensstandes zur ALL und den untersuchten Genen. Es wird bewertet, inwieweit die DNA-Methylierung der analysierten Gene als prognostischer Marker für T-ALL verwendet werden kann.

Welche Limitationen der Studie werden erwähnt?

Die Arbeit thematisiert die Limitationen der verwendeten Methoden, insbesondere der Pyrosequenzierung. Weitere Einschränkungen, die die Interpretation der Ergebnisse beeinflussen könnten, werden ebenfalls diskutiert.

Welche weiteren Forschungsfragen werden aufgeworfen?

Die Arbeit gibt einen Ausblick auf zukünftige Forschungsschritte und weitere Untersuchungen, die auf den Ergebnissen dieser Studie aufbauen könnten. Dies beinhaltet potenziell die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze basierend auf den gefundenen Zusammenhängen.

Welche Schlüsselwörter beschreiben die Arbeit am besten?

Akute lymphatische Leukämie (ALL), T-Zell ALL, DNA-Methylierung, Pyrosequenzierung, Genexpression, Prognosefaktoren, 14-3-3sigma, Hsp90, METAP2, Pax5, Thioredoxin-bindendes Protein 2, Rho A, Zellzyklus, Zelldifferenzierung, Chemoresistenz.

• College: University of Heidelberg (Institut f. Transfusionsmedizin und Immunologie)
• Author: PD Dr. med. Gero Hütter (Author)
• Publication Year: 2012
• Pages: 123
• Catalog Number: V207403
• ISBN (eBook): 9783656350385
• ISBN (Book): 9783656350521
• Language: German
• Tags: untersuchung, dna-methylierung, gene, prognosefaktoren, leukämie, pyrosequenzierung