Das Protein Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) wurde zum ersten Mal 1984 von Pennica et al. aus einer Monozyten–Zelllinie isoliert und sequenziert. 1985 beschrieb Old, dass durch TNF-α in mit Lipopolysacchariden (LPS), dem Endotoxin gram-negativer Bakterien, kontaminiertem Tumorgewebe Nekrose und zum Teil die vollständige Regression der Tumoren im Tiermodell ausgelöst wurde. Man hielt TNF-α zunächst für ein bakterielles Produkt. Erst später entdeckten Granger et al., 1969; Carswell et al., 1975; Fransen et al., 1986, dass Antigene (hauptsächlich gegen LPS) in den Patienten für die Sekretion des körpereigenen Zytokins, TNF α, verantwortlich waren, welches u.a. in Tumorzellen Lyse und Zelltod auslösen kann. Als therapeutisches Mittel zur Anti-Tumortherapie eignet sich TNF-α aufgrund seiner hohen Zytotoxizität jedoch nicht.
Das TNF-α-Gen ist auf 6p21.3 lokalisiert und besteht aus 4 Exons, welche für einen Precursor aus 230 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von 26kDa kodieren. TNF-α wird zunächst als transmembranes Protein mTNF (engl. membrane-bound TNF-α) exprimiert und durch die Metalloprotease TACE (engl. TNF-α converting enzyme) proteolytisch gespalten. Das gesplicte Protein besteht aus 157 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 17kDa und wird als lösliche Form sTNF (engl. soluble TNF-α) freigesetzt, welche Homotrimere bildet. TNF-α und das Lymphokin Lymphotoxin β (TNF-β), welches aus Lymphozyten stammt, haben ähnliche biologische Aktivitäten und zeigen eine Aminosäure-Übereinstimmung von 30%. Die Wirkung von TNF-α ist proinflammatorisch und nimmt bei der Abwehrreaktion des Körpers eine wichtige Rolle ein. Aktivierte Monozyten und Makrophagen sowie T-Lymphozyten, neutrophile Granulozyten, NK-Zellen, Endothelzellen und Fibroblasten synthetisieren das Zytokin nach Stimulation mit Immunmodulatoren wie Interferonen (IFN-γ, bzw. -α/β), Interleukinen (IL-2, GM-CSF) oder LPS. Je nach physiologischem Zustand der Zelle kann TNF-α eine Aktivierung und Differenzierung oder aber andererseits Zelltod induzieren. Seine unterschiedlichen Funktionen vermittelt TNF-α über zwei verschiedene Rezeptoren: TNF Rezeptor Typ 1 (TNFR1) und TNF Rezeptor Typ 2 (TNFR2), welche TNF-α mit hoher Affinität (Ka =2,5x10-9) und Spezifität binden.[...]
Inhaltsverzeichnis
I Einleitung
1.1 Tumornekrosefaktor-alpha
1.2 TNF-α Rezeptoren
1.3 Apoptose
1.4 TNF-α Antagonisten
1.5 Rolle der Makrophagen und Monozyten in mykobakteriellen Infektionen
1.6 Zielsetzung dieser Arbeit
II Material und Methoden
1 Reagenzien, Pufferlösungen und Medien
1.1 Reagenzien
1.2 Puffer und Medien
2 Zellbiologische Methoden
2.1 Isolierung humaner mononukleärer Zellen des peripheren Blutes
2.2 Isolierung humaner Monozyten durch Elutriation
2.3 Generierung von Makrophagen aus humanen Monozyten
2.4 Ernte von Makrophagen
2.5 Zellkulturen
2.6 Durchflusszytometrische Analyse
2.7 LDH Zytotoxizitätstest,
2.8 Caspase 3/7Apoptose Test
2.9 TNF-α- Bioassay
2.10 FACS Array
III Ergebnisse
3.1 Wirkung von TNF-α auf murine Fibroblasten (L929)
3.2 Wirkung von TNF-α auf humane Monozyten und Makrophagen
3.3 Effekt der Überstände von Monozyten auf murine Fibroblasten
3.4 Blockierung der zytotoxischen Wirkung von TNF-α mittels TNF-α Antagonisten
3.5 Zytotoxische Wirkung von Mykobakterien
3.6 Zeit- und dosisabhängige Induktion von Zelltod durch Mykobakterien
3.7 Effekt von TNF-α in M.avium infizierten Monozyten
3.8 Wirkung der TNF-α-Antagonisten auf Monozyten und Makrophagen
3.9 Einfluss der TNF-α Antagonisten auf Mykobakterien infizierte Monozyten
3.10 Wirkung der TNF-α Antagonisten in Anwesenheit von Komplementsystem aus humanem Serum
3.11 Wirkung der TNF-α Antagonisten in Anwesenheit von Komplementsystem und Mykobakterien
IV Diskussion
V Zusammenfassung
Zielsetzung & Themen
Die vorliegende Arbeit untersucht die Wirkung der TNF-α-Antagonisten Enbrel, Humira, sTNFR1 und Remicade auf humane myeloide Primärzellen (Monozyten und Makrophagen) in An- und Abwesenheit von Mykobakterien-Infektionen, um zu klären, ob die klinisch beobachtete Reaktivierung von Tuberkulose auf einen durch diese Medikamente induzierten Zelltod in diesen Immunzellen zurückzuführen ist.
- Analyse der zytotoxischen Wirkung von TNF-α auf Monozyten und Makrophagen
- Etablierung eines TNF-α-Bioassays zur Bewertung der Blockierungseffizienz der Antagonisten
- Quantifizierung des Zelltods (Apoptose/Nekrose) bei Mykobakterien-Infektionen mittels Durchflusszytometrie
- Untersuchung der immunmodulatorischen Effekte der TNF-α-Antagonisten auf infizierte Zellen
- Bewertung einer potenziellen komplementvermittelten Zelllyse durch die TNF-α-Therapie
Auszug aus dem Buch
1.3 Apoptose
Unter der Apoptose (griechisch απόπτωσις - in etwa das Abfallen, der Niedergang) versteht man eine Form des physiologischen Zelltods, der von einer Zelle im Gegensatz zur Nekrose selbst induziert werden kann. Beide lassen sich optisch leicht unterscheiden. Während bei der Apoptose ein Schrumpfen der Zelle einsetzt und eine Zerteilung der DNA durch Endonukleasen in definierte Stücke stattfindet, schwillt bei der Nekrose die Zelle an, wobei deren Plasmamembran zerstört wird. Als Folge kommt es oft zu Entzündungen, da hierbei bioaktive Stoffe, Zellplasma und Zellorganellen freigesetzt werden, welche Makrophagen an den Entzündungsherd locken und "entsorgt" werden müssen. Im Vergleich zur Nekrose, ist die Apoptose die häufigere Form des Zelltods. Für den tierischen Organismus stellt Apoptose einen notwendigen Mechanismus während der Embryonalentwicklung sowie bei der Regulation von Immunantworten dar. Für unser Immunsystem spielen zum Beispiel B-Lymphozyten eine große Rolle, indem sie Antikörper gegen Erreger bilden und diese somit bekämpfen können.
Zusammenfassung der Kapitel
I Einleitung: Vermittelt grundlegendes Wissen über TNF-α, dessen Signalwege und Rezeptoren, sowie die Rolle von Makrophagen und Monozyten bei der Immunabwehr von Mykobakterien.
II Material und Methoden: Beschreibt detailliert die verwendeten Chemikalien, Puffer, Zellisolierungsverfahren und die eingesetzten Testsysteme zur Analyse von Apoptose und Zytotoxizität.
III Ergebnisse: Präsentiert die experimentellen Daten zur zytotoxischen Wirkung von TNF-α sowie den Einfluss der untersuchten TNF-α-Antagonisten auf infizierte humane Zellen.
IV Diskussion: Interpretiert die Ergebnisse im Kontext aktueller wissenschaftlicher Hypothesen zur Tuberkulose-Reaktivierung und der Rolle von TNF-α-Blockern.
V Zusammenfassung: Fasst die wesentlichen Erkenntnisse zusammen, dass keine signifikante zellschädigende Wirkung durch die Antagonisten in den untersuchten Modellen nachgewiesen werden konnte.
Schlüsselwörter
TNF-α, TNF-α-Antagonisten, Apoptose, Mykobakterien, Mycobacterium tuberculosis, Makrophagen, Monozyten, Zelltod, Durchflusszytometrie, Tuberkulose, Immunologie, Enbrel, Humira, Remicade, sTNFR1.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit untersucht, ob die klinisch bekannte Reaktivierung von Tuberkulose bei einer Therapie mit TNF-α-Antagonisten auf einen direkten, durch diese Medikamente induzierten Zelltod in infizierten menschlichen Immunzellen zurückzuführen ist.
Was sind die zentralen Themenfelder der Forschung?
Die Schwerpunkte liegen auf der TNF-α-Signaltransduktion, der immunologischen Abwehr von Mykobakterien (M. tuberculosis/M. avium) durch Makrophagen und Monozyten sowie der Evaluierung verschiedener TNF-α-Blocker hinsichtlich ihrer Zytotoxizität.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Das Hauptziel ist zu klären, ob die TNF-α-Antagonisten Enbrel, Humira, sTNFR1 und Remicade Apoptose oder Nekrose in humanen myeloiden Primärzellen induzieren, was eine Erklärung für das erhöhte Disseminierungsrisiko von Mykobakterien unter dieser Therapie liefern könnte.
Welche wissenschaftlichen Methoden kommen zum Einsatz?
Es werden zellbiologische Kultivierungstechniken (z.B. Elutriation), durchflusszytometrische Analysen mit To-Pro-3-Färbung, LDH-Zytotoxizitätstests, Caspase-3/7-Apoptose-Assays und ein spezieller TNF-α-Bioassay mit murinen Fibroblasten verwendet.
Was wird im Hauptteil (Ergebnisse) behandelt?
Der Hauptteil befasst sich mit der Wirkung von TNF-α auf verschiedene Zelltypen, der Etablierung des Bioassays, dem Einfluss von Mykobakterien auf den Zelltod der Immunzellen und der Frage, ob eine Kombination aus Infektion und Antagonisten-Gabe zu verstärktem Zelltod führt.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
TNF-α, Antagonisten, Mykobakterien, Apoptose, Makrophagen, Tuberkulose, Durchflusszytometrie und Immunsystem.
Warum reagieren humane Monozyten anders auf TNF-α als murine Fibroblasten?
Die Ergebnisse zeigen, dass humane Monozyten und Makrophagen eine ca. 10.000-fach geringere Empfindlichkeit gegenüber TNF-α aufweisen als murine Fibroblasten, was vermutlich auf eine spezifische Rezeptorausstattung und zelltypspezifische Schutzmechanismen der Immunzellen zurückzuführen ist.
Konnte eine komplementvermittelte Lyse durch die untersuchten Medikamente nachgewiesen werden?
Nein, die Experimente zur Untersuchung der Komplementabhängigkeit unter Einsatz von humanem Serum erbrachten keinen Hinweis darauf, dass die TNF-α-Antagonisten eine durch das Komplementsystem induzierte Lyse infizierter Makrophagen auslösen.
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- Dagmar Schneider (Author), 2006, Modulation von Apoptose und Lyse in mit Mykobakterien infizierten humanen Monozyten und Makrophagen mittels TNF-α Antagonisten, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/230760
