Modulation von Apoptose und Lyse in mit Mykobakterien infizierten humanen Monozyten und Makrophagen mittels TNF-α Antagonisten

Inhaltsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

Tabellenverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

I Einleitung
1.1 Tumornekrosefaktor-alpha
1.2 TNF-α Rezeptoren
1.3 Apoptose
1.4 TNF-α Antagonisten
1.5 Rolle der Makrophagen und Monozyten in mykobakteriellen Infektionen
1.6 Zielsetzung dieser Arbeit

II Material und Methoden
1 Reagenzien, Pufferlösungen und Medien
1.1 Reagenzien
1.2 Puffer und Medien
2 Zellbiologische Methoden
2.1 Isolierung humaner mononukleärer Zellen des peripheren Blutes
2.2 Isolierung humaner Monozyten durch Elutriation
2.3 Generierung von Makrophagen aus humanen Monozyten
2.4 Ernte von Makrophagen
2.5 Zellkulturen
2.6 Durchflusszytometrische Analyse
2.7 LDH Zytotoxizitätstest,
2.8 Caspase 3/7Apoptose Test
2.9 TNF-α- Bioassay
2.10 FACS Array

III Ergebnisse
3.1 Wirkung von TNF-α auf murine Fibroblasten (L929)
3.2 Wirkung von TNF-α auf humane Monozyten und Makrophagen
3.3 Effekt der Überstände von Monozyten auf murine Fibroblasten
3.4 Blockierung der zytotoxischen Wirkung von TNF-α mittels TNF-α Antagonisten
3.5 Zytotoxische Wirkung von Mykobakterien
3.6 Zeit- und dosisabhängige Induktion von Zelltod durch Mykobakterien
3.7 Effekt von TNF-α in M.avium infizierten Monozyten
3.8 Wirkung der TNF-α-Antagonisten auf Monozyten und Makrophagen
3.9 Einfluss der TNF-α Antagonisten auf Mykobakterien infizierte Monozyten
3.10 Wirkung der TNF-α Antagonisten in Anwesenheit von Komplementsystem aus humanem Serum
3.11 Wirkung der TNF-α Antagonisten in Anwesenheit von Komplementsystem und Mykobakterien

IV Diskussion

V Zusammenfassung

VI Literatur

VII Danksagung

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1 TNF-α Antagonisten

Abbildung 2 Durchflusszytometrische Analyse

Abbildung 3 LDH Zytotoxizitätstest

Abbildung 4 Zytotoxische Wirkung von TNF-α auf murine Fibroblasten

Abbildung 5 Zytotoxischer Effekt von TNF-α auf humane Monozyten und Makrophagen

Abbildung 6 Wirkung der Monozyten–Überstände auf murine Fibroblasten

Abbildung 7 TNF-α Gehalt der Überstände stimulierter Monozyten

Abbildung 8 Einfluss der TNF-α Antagonisten auf die zytotoxische Wirkung von TNF-α

Abbildung 9 A/B Wirkung von Mykobakterien auf THP1 Zellen

Abbildung 10 Zeitabhängiger Zelltod in Monozyten

Abbildung 11 Dosisabhängige Induktion von Zelltod durch Mykobakterien

Abbildung 12 Wirkung der TNF-A Antagonisten auf M.avium infizierte Monozyten

Abbildung 13 Wirkung der TNF-α-Antagonisten auf Monozyten

Abbildung 14 Wirkung der TNF-α Antagonisten auf Makrophagen

Abbildung 15 Effekt der TNF-α Antagonisten Enbrel und Humira auf Monozyten

Abbildung 16 Einfluss der TNF-α Antagonisten auf M.avium infizierte Monozyten

Abbildung 17 Einfluss der TNF-α Antagonisten auf M.tuberculosis infizierte Monozyten

Abbildung 18 Einfluss der TNF-α Antagonisten auf M.tuberculosis infizierte Makrophagen

Abbildung 19 Wirkung der TNF-α Antagonisten in Anwesenheit von Komplementsystem

Abbildung 20 Wirkung der TNF-α Antagonisten in Anwesenheit von Komplementsystem und Mykobakterien

Abbildung 21 Einfluss der TNF-α Antagonisten auf mit Mykobakterien infizierte Makrophagen in Anwesenheit von Komplementsystem

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 TNF-α Antagonisten

Tabelle 2 Elutriationsprotokoll

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

I Einleitung

1.1 Tumornekrosefaktor-alpha

Das Protein Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) wurde zum ersten Mal 1984 von Pennica et al. aus einer Monozyten–Zelllinie isoliert und sequenziert1. 1985 beschrieb Old, dass durch TNF-α in mit Lipopolysacchariden (LPS), dem Endotoxin gram-negativer Bakterien, kontaminiertem Tumorgewebe Nekrose und zum Teil die vollständige Regression der Tumoren im Tiermodell ausgelöst wurde2. Man hielt TNF-α zunächst für ein bakterielles Produkt. Erst später entdeckten Granger et al., 1969; Carswell et al., 1975; Fransen et al., 1986, dass Antigene (hauptsächlich gegen LPS) in den Patienten für die Sekretion des körpereigenen Zytokins, TNF‑α, verantwortlich waren, welches u.a. in Tumorzellen Lyse und Zelltod auslösen kann3-5. Als therapeutisches Mittel zur Anti-Tumortherapie eignet sich TNF-α aufgrund seiner hohen Zytotoxizität jedoch nicht.

Das TNF-α-Gen ist auf 6p21.3 lokalisiert und besteht aus 4 Exons, welche für einen Precursor aus 230 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von 26kDa kodieren. TNF-α wird zunächst als transmembranes Protein mTNF (engl. membrane-bound TNF- α) exprimiert und durch die Metalloprotease TACE (engl. TNF- α converting enzyme) proteolytisch gespalten. Das gesplicte Protein besteht aus 157 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 17kDa und wird als lösliche Form sTNF (engl. soluble TNF- α) freigesetzt, welche Homotrimere bildet2;6;7. TNF-α und das Lymphokin Lymphotoxin β (TNF-β), welches aus Lymphozyten stammt, haben ähnliche biologische Aktivitäten und zeigen eine Aminosäure-Übereinstimmung von 30%. Die Wirkung von TNF-α ist proinflammatorisch und nimmt bei der Abwehrreaktion des Körpers eine wichtige Rolle ein. Aktivierte Monozyten und Makrophagen sowie T-Lymphozyten, neutrophile Granulozyten, NK-Zellen, Endothelzellen und Fibroblasten synthetisieren das Zytokin nach Stimulation mit Immunmodulatoren wie Interferonen (IFN-γ, bzw. -α/β), Interleukinen (IL-2, GM-CSF) oder LPS (Übersicht in 8). Je nach physiologischem Zustand der Zelle kann TNF-α eine Aktivierung und Differenzierung oder aber andererseits Zelltod induzieren. Seine unterschiedlichen Funktionen vermittelt TNF-α über zwei verschiedene Rezeptoren: TNF Rezeptor Typ 1 (TNFR1) und TNF Rezeptor Typ 2 (TNFR2), welche TNF-α mit hoher Affinität (Ka =2,5x10-9) und Spezifität binden9-11.

1.2 TNF-α Rezeptoren

TNFR1 (p55), Tumornekrosefaktor Rezeptor Superfamilie 1A

Das für TNFR1 kodierende Gen befindet sich auf dem langen Arm von Chromosom 12 (12.p13.2). TNFR1 hat ein Molekulargewicht von 55 kDa. Es handelt sich um ein glykosyliertes Protein aus 455 Aminosäuren mit einer extrazellulären Domäne von 171 Aminosäuren und einer zytoplasmatischen Domäne von 221 Aminosäuren12-16. Deletionsanalysen der intrazellulären C-terminalen Region zeigten, dass TNFR1 eine Todesdomäne (engl. Death Domain, DD) besitzt und somit nach Aktivierung zur Auslösung des programmierten Zelltods (Apoptose) führen kann. Die Todesdomäne von TNFR1 interagiert mit zahlreichen Signaladaptermolekülen u.a. mit TRADD (engl. TNFR1 Associated Death Domain) und RIP (engl. Receptor Interacting Protein). Der TNF Rezeptor 1 wurde zuerst aus einer Lymphom-Zelllinie isoliert17. Exprimiert wird TNFR1 auf allen somatischen Zellen, mit Ausnahme der Erythrozyten.

TNFR2 (p75), Tumornekrosefaktor Rezeptor Superfamilie 1B

Mit einem Molekulargewicht von 75kDa und einer fehlenden Todesdomäne unterscheidet sich TNFR2 von TNFR1. Das für TNFR2 kodierende Gen befindet sich auf dem langen Arm von Chromosom 1 (1p36.3-p36.2). Ansonsten ähnelt die Genstruktur der von TNFR118;19. Das TNFR2 Gen umfasst ca. 43kb bestehend aus 10 Exons (rangierend von 346bp bis 2,5kb) und 9 Introns (343bp bis 19kb)20. Das Polypeptid besteht aus 415 Aminosäuren und wie TNFR1 aus einer transmembranen Domäne15. Der TNF Rezeptor zeigt große Sequenzhomologie in der cysteinreichen Domäne mit dem (low affinity) Rezeptor von NGF (engl. nerve growth factor) sowie mit dem Zelloberflächenantigen CD4013-16..TNFR2 wird vor allem auf stimulierten T-und B-Lymphozyten exprimiert, bzw. auf myeloiden Zellen (mononukleäre Phagozyten, dentritische Zellen, Granulozyten, Mastzellen). Die Reifung von T-Zellen und deren Aktivierung wird durch TNFR2 vermittelt20. Beltinger et al. konnten zeigen, dass TNFR2 der am häufigsten exprimierte Rezeptor auf zirkulierenden T-Zellen ist und den wichtigsten Regulator der autoregulativen Apoptose von CD8+ Zellen darstellt. Es wird diskutiert, ob TNFR2 mit TNFR1 interagiert, um so nicht-lymphoide Zellen abzutöten18.

Beide Rezeptoren liegen sowohl in löslicher als auch zellmembranständiger Form vor. Nach Bindung von TNF-α werden die TNF-Rezeptoren entweder internalisiert und abgebaut, oder die extrazelluläre Rezeptor-Domäne wird proteolytisch gespalten. In Folge dieses als shedding bezeichneten Prozesses wird TNF-α durch Ausbildung von löslichen Liganden-Rezeptortrimeren inaktiviert.

TNF-α induziert in den Zielzellen eine Aktivierung von unterschiedlichen Signalwegen, welche zu verschiedenen zellulären Antworten führen: Über die Mitogen-aktivierte Proteinkinasen MAPK, p38 und die c-Jun N-terminale Kinase (JNK) werden entweder proinflammatorische oder proliferationassoziierte Gene aktiviert. Die Induktion von Apoptose, dem programmierten Zelltod, wird durch Caspasen vermittelt21. Durch den Transkriptionsfaktor NFκB werden sowohl antiapoptotische Überlebensgene als auch proinflammatorische Entzündungsgene reguliert11. Neben diesen drei Hauptwegen gibt es noch weitere Möglichkeiten zur Signaltransduktion: Über TNFR1 können Signalwege durch die Phospholipase C, Proteinkinase C und die Sphingomyelinase aktiviert werden22. Die Inositol-Trisphosphat-Kinase wirkt über Proteinkinase B auf die NFκB- Aktivierung23. TNF-α induzierte Aktivierung von Phospholipase A2 führte in Endothelzellen zur Freisetzung von Arachidonsäure24. In neutrophilen Granulozyten, Leukozyten und Fibroblasten wurde von einer Verbindung zwischen TNF-α Signalwegen und der Aktivierung von G-Proteinen (z.B. Protoonkogen ras) berichtet.25;26

1.3 Apoptose

Unter der Apoptose (griechisch απόπτωσις - in etwa das Abfallen, der Niedergang) versteht man eine Form des physiologischen Zelltods, der von einer Zelle im Gegensatz zur Nekrose selbst induziert werden kann. Beide lassen sich optisch leicht unterscheiden. Während bei der Apoptose ein Schrumpfen der Zelle einsetzt und eine Zerteilung der DNA durch Endonukleasen in definierte Stücke stattfindet, schwillt bei der Nekrose die Zelle an, wobei deren Plasmamembran zerstört wird. Als Folge kommt es oft zu Entzündungen, da hierbei bioaktive Stoffe, Zellplasma und Zellorganellen freigesetzt werden, welche Makrophagen an den Entzündungsherd locken und "entsorgt" werden müssen. Im Vergleich zur Nekrose, ist die Apoptose die häufigere Form des Zelltods. Für den tierischen Organismus stellt Apoptose einen notwendigen Mechanismus während der Embryonalentwicklung sowie bei der Regulation von Immunantworten dar. Für unser Immunsystem spielen zum Beispiel B-Lymphozyten eine große Rolle, indem sie Antikörper gegen Erreger bilden und diese somit bekämpfen können. Nach erfolgreicher Abwehr einer Infektion werden die B-Lymphozyten nicht mehr benötigt. Sie werden durch Apoptose entfernt und die Immunantwort somit abgeschaltet. Weiterhin werden Lymphozyten, die sich z.B. im Falle von Autoimmunerkankungen gegen körpereigenes Gewebe richten würden, durch Apoptose unschädlich gemacht. Die Apoptose ist also ein Bestandteil der Selbsttoleranz und der Eigenkontrolle des Immunsystems.

Auch für die Krebsforschung ist die Apoptose von Bedeutung, da sie Zellen eliminiert, die durch Mutationen oder virale Infekte geschädigt sind. Ein Ziel der Krebsforschung ist es, kontrolliert Apoptose in entarteten Zellen auszulösen. Gegenwärtig wird Apoptose besonders im Zusammenhang mit der Krebsentstehung und verschiedenen Autoimmunerkrankungen erforscht. Neuere Studien deuten darauf hin, dass TNF-α sowohl Apoptose als auch Nekrose auslösen kann21.

TNF-α ist essentiell für die Regulation von Immunzellen. Eine Dysregulation des TNF-α Haushalts führt zu einer Vielzahl pathologischer Prozesse: Es wurde ein Einfluss von TNF-α auf die Pathogenese von degenerativen neuronalen Erkrankungen wie Multipler Sklerose, der Entstehung von Diabetes sowie bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen, rheumatoider Arthritis, Psoriasis-Arthritis, ankylosierender Spondylitis aber auch bei Sepsis, Asthma und Kachexie nachgewiesen9;27-32. Beattie et al. zeigten, dass TNF-α im Nervensystem eine wichtige Rolle spielt. Neuroglia produzieren TNF-α, um so über eine erhöhte Glutamat-Rezeptorexpression die synaptische Effizienz zu verstärken. Die Inhibierung von endogenem TNF-α zeigte gegenteilige Wirkung33. Dies deutet darauf hin, dass ein konstanter Level an TNF-α ein wichtiger Faktor zur Erhaltung der synaptischen Effizienz an exzitatorischen Synapsen sowie der synaptischen Plastizität ist. Die neuroprotektive Wirkung von TNF-α konnte desweiteren in Knock-out-Mäusen für beide TNF-Rezeptoren (TNFR1 und TNFR2) gezeigt werden34. Dass eine Überexpression von TNF-α wiederum schädlich ist, wurde in einer Studie von van Heel et al. bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen festgestellt35. Immunkomplexe können in TNFR1 und TNFR2 defizienten Mäusen eine Glomerulonephritis (entzündliche Nierenerkrankung) auslösen. In TNFR1 defizienten Mäusen kam es zu einer massiven renalen T-Zell-Akkumulation mit erniedrigter Apoptoserate in T-Zellen. Trotz einer intakten Immunantwort der TNFR2 defizienten Mäuse waren diese vor Glomerulonephritis geschützt. Die Expression von TNFR2 auf intrinsischen Nierenzellen (Mesangiumzellen) aber nicht auf Leukozyten begründet diese unterschiedlichen Auswirkungen36. Dies zeigt, wie entscheidend die Rezeptorexpression, bzw. die Funktionen der TNF-Rezeptoren für die jeweilige Wirkung von TNF-α sind. Bei Autoimmunerkrankungen wie z.B. Multipler Sklerose und rheumatischen Erkrankungen, wie z.B. Rheumatoider Arthritis, Psoriasis-Arthritis, ankylosierender Spondylitis, aber auch Sepsis kommt es möglicherweise durch eine genetische Prädisposition zu einer Überproduktion von TNF-α37-41. Durch die andauernde Entzündung entwickeln sich im Laufe der Zeit zunehmend Gewebeschäden, welche bei rheumatischen Erkrankungen zu einer Zerstörung von Gelenkknorpel, Gelenk und Knochen führen können42.

TNF-Rezeptoren funktionieren als natürliche TNF-Antagonisten. Dies führte zu der Überlegung, Medikamente für die Therapie inflammatorischer Krankheitsbilder zu entwickeln, welche TNF-α spezifisch hemmen, um so z.B. im Falle der Rheumatoiden Arthritis die Schädigung des Gelenks zu verhindern. Einerseits konnten Antikörper gegen TNF-α entwickelt werden, die lösliches und rezeptorgebundenes TNF-α binden. Andererseits gelang es, Rezeptorfusionsproteine zu entwickeln, welche an humanes Immunglobulin gekoppelte TNF-Rezeptoren darstellen und lösliches TNF-α binden. Gemeinsames Ziel aller Therapien ist es, TNF-α mehr oder weniger zu inaktivieren.

1.4 TNF-α Antagonisten

Etanercept (Enbrel®)

Enbrel ist ein dimeres Fusionsprotein, in dem zwei extrazelluläre Bindungsdomänen des humanen TNFR2 an den Fc‑Teil des menschlichen Immunglobulins IgG1 als Carrier zur Verlängerung seiner Halbwertszeit gekoppelt sind. Es besteht damit aus dem eigentlichen TNF-Rezeptor 2 für TNF-α und einem Transport-Molekül. Das Fusionsprotein ist ein lösliches Molekül, das mit hoher Affinität TNF-α bindet. Die Affinität des dimeren Rezeptors zu TNF-α ist etwa 1000fach höher als die des natürlichen monomeren Rezeptors, der auf diese Weise kompetitiv verdrängt wird. Die Halbwertszeit von Enbrel liegt zwischen zwei und fünf Tagen. Es wird zweimal wöchentlich in einer Dosierung von 25 mg subkutan injiziert. Es ist zur Monotherapie in der Behandlung der rheumatoiden Arthritis, der juvenilen rheumatoiden Arthritis und Psoriasisarthritis zugelassen43.

Adalimumab (D2E7-Humira®)

Der erste humane gegen TNF-α gerichtete Antikörper Humira wurde im September 2003 in Deutschland zugelassen. Humira ist ein rekombinanter humaner monoklonaler IgG1-Antikörper, der mittels Phagen-Display-Technologie entwickelt wurde. Er bindet spezifisch an TNF-α und blockiert dessen Interaktion mit den p55- und p75-TNF-Rezeptoren (TNFR1 und TNFR2) der Zelloberfläche. Durch seine humane Herkunft wird die Antigenität dieses Antikörpers deutlich reduziert. Humira wird 14-tägig in einer Dosierung von 40 mg subkutan injiziert. Die Halbwertszeit beträgt 11 bis 15 Tage44.

Infliximab (Remicade®)

Remicade ist ein chimärer monoklonaler Antikörper, der gegen menschliches TNF-α gerichtet ist. Er besitzt an der TNF-Bindungsstelle einen murinen Anteil, während die konstante Region dem humanen IgG1-Molekül entspricht. Remicade bindet mit hoher Affinität und Spezifität an freies und bereits rezeptorgebundenes TNF-α und hemmt damit die proinflammatorische Aktivität von TNF-α. Der TNF-α Antagonist wird in einer Dosierung von 3-5 mg/kg Körpergewicht als Infusion verabreicht. Nach einer Induktionsphase von zwei und sechs Wochen, wird die Therapie auf ein Behandlungsintervall von 4 bis 8 Wochen eingestellt (Halbwertszeit 10 bis 14 Tage). Da Remicade kein vollständig humaner Antikörper ist, besteht die Gefahr der Antikörperbildung und einer daraus folgenden funktionellen Inaktivierung des Medikaments45.

Eine Übersicht zu den einzelnen TNF-α Antagonisten und deren Herstellung ist in Abb.1 gegeben.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1 TNF-α Antagonisten. Herstellung der TNF-α Antagonisten nach Bendtzen K, Mol Biotechnol. 2000 14(3):251-61 (modifiziert).

TNF-α Antagonisten werden zunehmend im Bereich der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und der rheumatoiden Arthritis eingesetzt. Der Einsatz von Anti-TNF-α Antikörpern, löslichen TNF-α Rezeptoren und TNFR-Fc-Fusionsproteinen zeigte bei der Behandlung von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen sowie Rheumatoider Arthritis deutliche Therapieerfolge. Rheumapatienten berichteten bereits nach zweiwöchiger Therapie mittels TNF-α Antagonisten von einer starken Schmerzlinderung und weniger Gelenksteifigkeit. In diesem Kontext kam es jedoch vermehrt zu einer Reaktivierung von latenten Tuberkuloseinfektionen (engl . latent tuberculosis infection, LTBI)46-49. Nach Studien von Keane et al. und Wallis et al. kam es bei 239 von 100000 Patienten, welche mittels Remicade therapiert wurden zu einer Reaktivierung einer latenten Tuberkuloseinfektion. Die Therapie mittels Enbrel führte nur bei 74 von 100000 Patienten zu einer Reaktivierung einer LTBI46;50. Aufgrund dieser Daten wurde eine unterschiedliche Wirkung der TNF-α Antagonisten im Rahmen von mykobakteriellen Infektionen postuliert. Eine mögliche Ursache für die Reaktivierung von LTBI wurde in einem durch TNF-α Antagonisten induzierten Zelltod von infizierten Monozyten und Makrophagen gesehen. Durch apoptotische Monozyten oder Makrophagen würden Granulome nicht vollständig ausgebildet sein, sodass Mykobakterien disseminieren könnten47;51.

1.5 Rolle der Makrophagen und Monozyten in mykobakteriellen Infektionen

Die Tuberkulose besitzt im Vergleich zu anderen bakteriell verursachten Krankheiten die höchste Morbidität und Mortalität52. Der Erreger der Tuberkulose ist das Mycobacterium tuberculosis, welches zur Gattung Mycobacterium gehört und den Aktinomyzeten im Reich der Bacteria zugeordnet wird. Mycobacterium tuberculosis gehört mit anderen Mykobakterien (u.a. Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum) zum Mycobacterium tuberculosis Komplex. Verwandte Mykobakterien sind Mycobacterium leprae (Erreger der Lepra) und Mycobacterium ulcerans (Erreger des Buruli-Ulkus, einer Hautinfektion). Mykobakterien sind nicht-sporenbildene, aerobe Stäbchen (ca. 0.2-0.5 µm auf 2-5 µm), die sich intrazellulär vermehren. Sie lassen sich nach Behandlung mit Phenol-Fuchsin im Gegensatz zu den meisten anderen Bakterien nicht mehr durch Einwirkung eines Ethanol-Salzsäure-Gemisches entfärben und werden daher als säurefest bezeichnet53. Dies wird für den mikroskopischen Nachweis genutzt. Die Infektion mit M.tuberculosis erfolgt hauptsächlich aerogen über den Respirationstrakt. Obwohl sich eine Infektion mit M.tuberculosis in vielen unterschiedlichen Organen manifestieren kann, ist die Lungentuberkulose das häufigste Erkrankungsbild54. Es entwickelt jedoch nur ca. jeder zehnte Infizierte eine aktive Tuberkulose. Das Immunsystem kann M.tuberculosis im Allgemeinen kontrollieren jedoch nicht vollständig eliminieren. Schätzungen zufolge sind ca. 30% der Weltbevölkerung mit M.tuberculosis infiziert55. Die Reaktivierung einer latenten Infektion kann unter immunsupprimierenden Bedingungen, wie z.B. einer Behandlung mit Corticoiden oder bei verminderter T-Lymphozyten-Anzahl wie bei einer HIV-Infektion sowie nach Behandlung mit TNF-α Antagonisten ausgelöst werden (Übersicht in56). Mögliche Ursachen können fehlende Aktivierung von Monozyten, Makrophagen, T-Zellen und mangelhafte Ausbildung von Granulomen aufgrund des erniedrigten TNF-α Spiegels sein35;36;57. Auch ohne erkennbaren Immundefekt kann es zu einer Reaktivierung einer latenten Tuberkulose-Infektion kommen54. Nach M.tuberculosis wird M.avium als häufigstes mit Krankheitsbildern assoziiertes Mykobakterium aus klinischen Untersuchungsmaterialien isoliert. Bei den Betroffenen handelt es sich in der Regel um immunsupprimierte Individuen, z.B. Patienten mit der erworbenen Immunschwäche AIDS (engl. acquired immune deficiency syndrome) oder Patienten nach Chemotherapie oder Transplantation. Aus diesem Grund wird M.avium als opportunistisches Pathogen für den Menschen eingestuft58-61.

Makrophagen sind die in vivo von Mykobakterien hauptsächlich infizierten Zellen des Wirtsorganismus, in denen die Bakterien intrazellulär replizieren und persistieren können62. Die Phagozytose von Bakterien als antimikrobieller Prozess endet in der Verschmelzung von Phagosomen mit Lysosomen. Diese enthalten z.B. saure Hydrolasen, welche die Degradation von bakteriellen Strukturen katalysieren63. Virulente Mykobakterien-Spezies können aktiv die Reifung des Phagosoms und die Fusion mit dem lysosomalen Kompartiment behindern, um so eine Voraussetzung für ihre intrazelluläre Persistenz zu schaffen (Zusammenfassung in 62). Die erfolgreiche Aktivierung antimykobakteriell wirksamer Abwehrmechanismen erfordert die Rekrutierung weiterer Effektorzellen, v.a. Monozyten und T-Lymphozyten, an den Infektionsort. Hierzu sezernieren Makrophagen lösliche Mediatoren wie proinflammatorische Zytokine, z. B. TNF-α, IL-1β und Chemokine z.B. MCP-1 (engl . monocyte chemotactic protein), RANTES (engl. regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted) und MIP-1a (engl. macrophage inflammatory protein-1 alpha). TNF-α wird sehr früh nach Kontakt mit bakteriellen Erregern durch Makrophagen freigesetzt. Essentiell ist TNF-α für die Kontrolle einer akuten Infektion mit Mykobakterien64. Unter anderem reguliert TNF-α die Expression von Integrinen z.B. VCAM-1 (engl . vascular cell adhesion molecule-1) auf der Oberfläche von Endothelzellen. Integrine dienen der Adhäsion von Entzündungszellen im Blutgefäß. Dies stellt eine wichtige Voraussetzung für die anschließende Diapedese in infiziertes Gewebe dar65. TNF-α wirkt synergistisch mit Interferon–γ (IFN-γ) auf die Induktion von Adhäsionsmolekülen, Chemokinen und bakteriostatischen Prozessen in aktivierten Makrophagen66-68.

Im Rahmen einer antimykobakteriellen Abwehrreaktion werden Granulome ausgebildet. Hierbei handelt es sich um Läsionen aus zentral liegenden mit Mykobakterien infizierten Makrophagen und Riesenzellen. Diese sind von einem Saum aus T-Lymphozyten umgeben69-71. Für die Induktion und Aufrechterhaltung dieser mononukleären Zellanhäufung ist die lokale T-Zell-gesteuerte Produktion von Zytokinen wie TNF-α, IFN-γ und Chemokinen wie RANTES und MCP-1 ebenfalls von essentieller Bedeutung (Übersicht in54). Für die Ausbildung eines protektiven Granuloms ist die frühe Aktivierung der T-Zellen und Makrophagen durch TNF-α unerlässlich, um eine Disseminierung des Erregers zu verhindern51;57;72;73. Die einerseits für die Kontrolle mykobakterieller Infektionen unabdingbare Aktivierung der Immunantwort muss andererseits zum Schutz des umliegenden gesunden Gewebes effektiv kontrolliert und reguliert werden. Ehlers et al. zeigten, dass TNF-α bzw.TNF-Rezeptor-1 (p55)-gendefiziente Mäuse im Rahmen mykobakterieller Infektionen schwerste Gewebeschäden aufweisen, die unter anderem auf eine fehlende Regulation der T-Zell-Antwort durch aktivierungsinduzierten TNF-α-vermittelten Zelltod zurückzuführen sind74;75. Somit ist TNF-α sowohl bei der Initiation als auch der Begrenzung der Entzündungsreaktion im Rahmen einer mykobakteriellen Infektion von Bedeutung51.

1.6 Zielsetzung dieser Arbeit

In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob sich die TNF-α Antagonisten Enbrel, Humira, sTNFR1 und Remicade aufgrund ihrer unterschiedlichen Struktur in ihrer Effizienz, TNF-α zu blockieren, unterscheiden. Hierfür sollte ein TNF-α Bioassay etabliert werden. Desweiteren sollte untersucht werden, inwiefern sich die Wirkung der TNF-α Antagonisten auf humane myeloide Primärzellen in An- und Abwesenheit von Mykobakterien unterscheidet. Lässt sich durch die TNF-α Antagonisten Apoptose in mit Mykobakterien infizierten humanen Monozyten und Makrophagen induzieren, und wenn ja, besteht eine Dosisabhängigkeit? Eine mögliche Modulation von Zelltod in mit Mykobakterien infizierten myeloiden Primärzellen, bzw. der Anteil toter Zellen sollte durchflusszytometrisch analysiert werden. Da sowohl Apoptose als auch Nekrose von humanen myeloiden Primärzellen zu einer Disseminierung mykobakterieller Erreger führen könnten, sollte anhand eines Zytotoxizitäts-Tests analysiert werden, ob durch TNF-α Antagonisten eine Komlement begingte Lyse in mit Mykobakterien infizierten Monozyten und Makrophagen ausgelöst wird.

II Material und Methoden

1 Reagenzien, Pufferlösungen und Medien

1.1 Reagenzien

Acrylamid/Bisacrylamid (Stammlösung 40% w/v) (SERVA, Heidelberg)

Aktinomycin D ( SIGMA, Deisenhofen)

Ammoniumperoxodisulfat (APS; SERVA, Heidelberg)

Azeton (MERCK, Darmstadt)

Bcl-2 mAk, B-cell lymphoma- 2 (BD BIOSCIENCES, Heidelberg)

Bromphenolblau (SERVA, Heidelberg)

Caspase-3 mAk, (BD BIOSCIENCES, Heidelberg)

Caspase-3/7 Apoptose-Kit (PROMEGA,Mannheim) )

Caspase-3 (E-8) mAk (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, Heidelberg)

Dimethylsulfoxid (DMSO, SIGMA, Deisenhofen)

Dithiothreitol (DTT; SIGMA, Deisenhofen)

EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) (BIOCHROM, Berlin)

enhanced chemiluminescence (ECL)-Lösungen

(AMERSHAM BUCHLER , Braunschweig)

enhanced chemiluminescence (ECL)-Hyperfilm

(AMERSHAM BUCHLER , Braunschweig)

FACS Array (Cytometric Bead Array, CBA TM Apoptose Kit)

(BD BIOSCIENCES, Heidelberg)

Fötales Kälberserum (hitzeinaktiviert, 30 min, 56 °C), (FKS; BIOCHROM, Berlin)

D-Glucose (MERCK, Darmstadt)

L-Glutamin (BIOCHROM, Berlin)

Glycin (SERVA, Heidelberg)

Glycerol (SERVA, Heidelberg)

Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS; BIOCHROM, Berlin)

HEPES (N- (2-Hydroxyethyl)-piperazin-N’-2-ethansulfonsäure)

(BIOCHROM, Berlin)

Humanserum (HS, Forschungszentrum Borstel) von gesunden Spendern der Blutgruppe AB aus Vollblut gewonnen (freundlicherweise von Prof. Dr. S. Ehlers, Laborgruppe Molekulare Infektiologie, Forschungszentrum Borstel, zur Verfügung gestellt)

humaner Makrophagen-koloniestimulierender Faktor

(M-CSF; R&D SYSTEMS, Wiesbaden)

Kristallviolett (SIGMA, Deisenhofen)

LDH Zytotoxizitätstest ( MOBITEC, Göttingen)

LPS (Lipopolysaccharid; Salmonella enterica, Serotyp Friedenau H909; freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. H. Brade, Laborgruppe Biochemische Mikrobiologie, Forschungszentrum Borstel)

C5F6 L929 (Murine Fibroblastenzelllinie, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. C. Hölscher, Laborgruppe Juniorprofessur Molekulare Infektiologie, Forschungszentrum Borstel)

Methanol (MERCK, Darmstadt)

Mycobacterium avium (Stamm SE01, freundlicherweise von Prof. Dr. S. Ehlers, Laborgruppe Molekulare Infektiologie, Forschungszentrum Borstel, zur Verfügung gestellt)

Mycobacterium tuberculosis (Stämme H37Rv, CDC1551, freundlicherweise von Prof. Dr. S. Ehlers, Laborgruppe Molekulare Infektiologie, Forschungszentrum Borstel, zur Verfügung gestellt)

Natriumazid (MERCK, Darmstadt)

Tri-Natriumzitrat-Dihydrat (MERCK, Darmstadt)

Natriumdodecylsulfat (SDS; AMERSHAM, Braunschweig)

Natriumglutamat (MERCK, Darmstadt)

Natriumpyruvat (MERCK, Darmstadt)

Nitrozellulose-Blotmembran (SARTORIUS, Göttingen)

Pancoll (PAN BIOTECH GMBH, Aidenbach)

PARP mAk, Poly (ADP-Ribose) Polymerase (BD BIOSCIENCES, Heidelberg)

PBMZ (Periphere mononukleäre Blutzellen)

Phenol (MERCK, Darmstadt)

Rinderserumalbumin (BSA, bovine serum albumin ; SIGMA, Deisenhofen)

RPMI 1640 (BIOCHROM, Berlin)

RPMI 1640 mit Hepes (BIOCHROM, Berlin)

Penicillin/Streptomycin (BIOCHROM, Berlin)

Saponin (SIGMA, Deisenhofen)

Saccharose (SIGMA, Deisenhofen)

Schwefelsäure, 95-97% (MERCK, Darmstadt)

Staurosporin (Streptomyces sp.; CALBIOCHEM, Darmstadt)

Streptavidin, Peroxidase-gekoppelt (1 mg/ml; DIANOVA, Hamburg)

3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin (FLUKA, Buchs, Schweiz)

Tetramethylethylendiamin (TEMED; SERVA, Heidelberg)

Thimerosal (ROTH, Karlsruhe)

Humanes TNF-α (Tumor-Nekrose-Faktor-α) (PEPROTECH, Offenbach)

To-Pro-3 Iodid (2 µM; MOBITEC, Göttingen)

Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris; SERVA, Heidelberg)

Trockenmilch (GABLER-SALITER GmbH, Obergünzburg) Trypanblau (FLUKA, Buchs, Schweiz)

Trypsin/EDTA-Lösung (BIOCHROM, Berlin)

Tween 20 (SIGMA, Deisenhofen)

Tween 80 (SIGMA, Deisenhofen)

Wasserstoffperoxid (MERCK, Darmstadt)

Westernblot-Filterpapier (SCHLEICHER & SCHUELL, Dassel)

Zitronensäure, kristallwasserfrei (MERCK, Darmstadt)

1.2 Puffer und Medien

Hanks’ balanced salt solution (HBSS)

9,86 g/l HBSS-Trockensubstanz

3,70 g/l NaHCO3

pH 7,2

285 mosm

HEPES-Natriumsalzpuffer

N- (2-Hydroxyethyl)-piperazin-N’-2-ethansulfonsäure-Natriumsalz (C8H17N2NaO4S)

M = 260,28 g/mol

pKa (20°C) (0,1 mol/l)= 7,55

20 mmol/l

Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS, phosphate buffered saline)

140 mmol/l NaCl

2,7 mmol/l KCl

8,1 mmol/l NaH2PO4

1,5 mmol/l KH2PO4

pH 7,2

285 mosm

Azidhaltige Phosphat-gepufferte Salzlösung (Azid-PBS)

7,1 g/l NaCl

0,2 g/l KCl

1,44 g/l Na2HPO4

0,2 g/l KH2PO4

1,0 g/l NaN3

pH 7,2

Tris-gepufferte Salzlösung (TBS, tris buffered saline)

10 mM Tris/HCL

150 mM NaCl

pH 8,0

Tris-gepufferte Salzlösung mit Tween (T-TBS)

TBS mit 0,1% (v/v) Tween 20

RPMI 1640 Medium

RPMI-Trockensubstanz nach Herstellerangaben gelöst

pH 7,2

285 mosm

Zitratlösung

3,8 % (v/w) Tri-Natrium-Zitrat-Dihydrat

Medien für die Zellkulturen

Zellkulturmedium

RPMI 1640

10% FKS, hitzeinaktiviert

2 mM L-Glutamin

Zellkulturmedium für THP1

RPMI 1640

10% FKS, hitzeinaktiviert

2 mM L-Glutamin

100 U/ml Penicillin

100 µg/ml Streptomycin

[...]