Die Desoxyribonukleinsäure (DNA) ist eine der wichtigsten Substanzen überhaupt: Da die genetische Information aller lebender Organismen in ihrer Struktur kodiert wird, ist sie das Molekül des Lebens 1,2 . Beim Menschen besteht das komplette Genom aus etwa 300,000 Genen auf insgesamt 24 Chromosomen 3 . Jedes Gen kodiert dabei ein bestimmtes Protein, das nach seiner Expression via Transkription und Translation eine bestimmte biochemische Aufgabe in der lebenden Zelle ausübt. Mutationen, d. h. Veränderungen der DNA Sequenz, können in klinisch manifesten Krankheitsbildern resultieren, indem sie zur Expression von Proteinen führen, die eine veränderte biochemische Aktivität zeigen, oder in einigen Fällen diese sogar komplett verlieren. Man unterscheidet verschiedene Arten von Mutationen; diese umfassen Nukleotiddeletion, -insertion oder -austausch (d.h. Punktmutation).
Mehr als 3,000 genetisch bedingte Krankheiten sind inzwischen bekannt 4 , darunter z.B. Alzheimer 5 , Mukoviszidose (zystische Fibrose 6,7,8 ), sowie bestimmte Arten der Hämophilie oder der Muskeldystrophie 9 . Neben vererbbaren Krankheiten, die auf die Mutation bestimmter Gene zurückzuführen sind, können auch bestimmte Geburtsfehler auf chromosomalen Abnormalitäten beruhen wie z.B. die recht verbreitete Trisomie 21 (eines von 700 Lebendgeborenen betroffen) oder das auf einer Aneuploidie der Geschlechtschromosomen beruhende Klinefelter-Syndrom (XXY, einer von 590 lebendgeborenen Männern). Darüber hinaus gibt es zunehmend Hinweise, daß das Vorhandensein bestimmter DNA-Sequenzen ein Individuum für eine Reihe von Krankheiten besonders prädisponieren kann. So zum Beispiel für Diabetes, Arteriosklerose, Obesitas, eine Reihe von Autoimmunkrankheiten und auch verschiedene Krebsarten wie z.B. Brust-, Gebärmutter- und Lungenkrebs.
Die vollständige Entschlüsselung des menschlichen Genoms ist die Basis, um die Ursachen solcher Krankheiten, die auf genetischen Defekten beruhen, zu verstehen. Dieser enormen Herausforderung für die Naturwissenschaft stellen sich zahlreiche Forschungsgruppen auf der ganzen Welt, die ihre Bemühungen im Rahmen des sogenannten humanen Genom-Forschungsprogramms (Humane Genome Project, HUGO 10,11,12 ) institutionalisiert haben.
Inhaltsverzeichnis
I Einleitung
1 Wachsende Bedeutung der DNA-Analytik
2 Nachteile klassischer Methoden der DNA-Analytik
3 MALDI-TOF Massenspektrometrie zur Analyse von Biomolekülen
4 Massenspektrometrie von Nukleinsäuren
II Problemstellung
III Ergebnisse und Diskussion
1 Einführung
2 Das Pyrrolo[2,3-d]pyrimidinsystem
2.1 Biologische Bedeutung
2.2 Nomenklatur
3 Synthese von 7-Deaza-2-desoxyguanosin und 7-Deaza-2-desoxyadenosin
3.1 Darstellung der Aglykone
3.2 Synthese geeigneter Akzeptoren für Glykosidierungsreaktionen
3.3 Synthese von Glykosyldonoren
3.4 Glykosidierungsreaktionen
3.5 Abspaltung der Schutzgruppen aus den Glykosidierungsprodukten
4 Chemische Festphasensynthese von Oligodesoxynukleotiden
4.1 Die Phosphoamiditmethode
4.2 Darstellung von Monomeren für die DNA-Synthese
4.3 Benzoyl- und Isobutyryl-Gruppe als exozyklische Aminoschutzgruppen
4.4 4-tert-Butylphenoxyessigsäure als Schutzgruppe für exozyklische Aminogruppen
4.5 Phosphoamiditsynthese
4.6 Festphasengebundene Synthese modifizierter Nukleinsäuren
5 Enzymatische Darstellung modifizierter Nukleinsäuren
5.1 Die Polymerasekettenreaktion
5.2 Wahl von Primer-Template-Systemen für die PCR
5.3 Wahl einer geeigneten DNA-Polymerase für die PCR
5.4 Erfolgreicher Einbau der modifizierten Triphosphate
5.5 Effektivität des Einbaus von 7-Deazanukleosidtriphosphaten
6 Analytik doppelsträngiger DNA mit Hilfe der MALDI-TOF Massenspektrometrie
6.1 Analyse der 103-mer PCR-Produkte aus M13mp18
6.2 Analyse der 99-mer PCR-Produkte aus pHis6Bap
6.3 Restriktionsverdau der 99-mer PCR-Produkte
6.4 Ribomodifizierte Primer zur Darstellung 7-deaza-modifizierter Nukleinsäuren
7 Massenspektrometrie einzelsträngiger DNA
7.1 Analytik synthetischer Homopolymere von 7-Deaza-2-desoxyadenosin
7.2 Das Streptavidin-Biotin-System
7.3 Asymmetrische PCR mit biotinmodifizierten Primern
7.4 Darstellung und Massenspektrometrie komplett c7-modifizierter Nukleinsäuren
8 DNA-Sequenzanalyse
8.1 Vermessung einer modifizierten synthetischen DNA-Leiter
8.2 DNA-Sequenzierung mit Hilfe einer Endonuklease
9 Modifikation des Zuckers zur Stabilisierung der DNA
9.1 Enzymatische Reaktionen mit 2-Fluoro-2-desoxynukleosidtriphosphaten
9.2 2-Fluorocytidin in einem synthetischen Oligonukleotid
9.3 Kombination von Basen- und Zuckermodifikation
10 Konzept eines massenspektrometrischen Polymerase-Inkorporations-Assays
IV Zusammenfassung
V Summary
VI Diskussion und Ausblick
VII Experimenteller Teil
VIII Literaturverzeichnis
Zielsetzung & Themen
Die vorliegende Arbeit untersucht Möglichkeiten zur Stabilisierung von Nukleinsäuren gegenüber der säurekatalysierten Depurinierung unter den Bedingungen der MALDI-TOF Massenspektrometrie durch chemische Modifikation. Ziel ist es, durch den Einsatz von 7-Deazapurinen und 2-Fluorozuckermodifikationen die massenspektrometrische Analyse von DNA, insbesondere im Hinblick auf Sensitivität und Auflösung, maßgeblich zu verbessern sowie die Anwendung in enzymatischen Verfahren wie der PCR und der DNA-Sequenzierung zu evaluieren.
- Synthese modifizierter 7-Deazapurin-2-desoxynukleoside als Bausteine für die DNA-Synthese.
- Chemische Festphasensynthese von modifizierten Oligonukleotiden mittels Phosphoamiditchemie.
- Optimierung des enzymatischen Einbaus modifizierter Triphosphate in der PCR.
- Massenspektrometrische Analytik von modifizierter doppel- und einzelsträngiger DNA.
- Evaluation von Methoden zur Probenkonditionierung und Immobilisierung (Streptavidin-Biotin-System).
Auszug aus dem Buch
3 MALDI-TOF Massenspektrometrie zur Analyse von Biomolekülen
Die Massenspektrometrie stellt ein Verfahren dar, um distinkte Moleküle zu „wägen“. Sie zählt daher wohl unbestritten zu den heute leistungsfähigsten Methoden der instrumentellen Analytik in der organischen Chemie und hat sich zum Nachweis und bei der Identifizierung unterschiedlichster Substanzen bis in den extremen Spurenbereich als Methode der Wahl etabliert. Es ist nicht verwunderlich, daß mit zunehmender Bedeutung der Biochemie und Biotechnologie in den letzten Jahren immer wieder versucht wurde, den Einsatzbereich massenspektrometrischer Verfahren durch neue Ionisierungstechniken auf biochemisch relevante Substanzklassen zu erweitern, an denen die klassische Elektronenstoßionisation (EI) oder auch die chemische Ionisation (CI) scheitern. Bei diesen und verwandten Verfahren erfolgt die Ionisation bei reduziertem Druck in der Gasphase. Die Voraussetzung dafür ist, daß sich die Probe unzersetzt verdampfen läßt, was aber bei den meisten polaren, thermisch labilen und sehr großen Biomolekülen mit ihrem fast nicht existenten Dampfdruck nur äußerst selten gegeben ist.
Seit den 70er Jahren werden Laser in der organischen Massenspektrometrie eingesetzt. Die Laserdesorption (LD) gelang allerdings zunächst nur bei relativ kleinen Molekülen und hatte daher wenig praktische Bedeutung. Überwunden wurde dies durch die fast zeitgleiche Einführung des matrixunterstützten Laserdesorptionsverfahrens (MALD) durch Hillenkamp und Karas bzw. Tanaka im Jahre 1988. Da sowohl die Laserdesorption seit den 70er Jahren als auch die TOF-Technologie sogar schon seit den 50er Jahren bekannt waren, ist die enorme Zeitverzögerung kaum begreiflich, bis eine Kombination der beiden Methoden endlich Einzug in die moderne Massenspektrometrie gefunden hat.
Bei dieser Methode wird die zu untersuchende Probe mit einem 100- bis 1000 fachen Überschuß einer sogenannten Matrix verdünnt, auf einem Probenteller kokristallisiert und im Hochvakuum des Massenspektrometers einem intensiven Impuls kurzwelliger Laserstrahlung von wenigen Nanosekunden Dauer ausgesetzt.
Zusammenfassung der Kapitel
I Einleitung: Beschreibt die Bedeutung der DNA-Analytik, die Limitationen klassischer Methoden und führt in die Grundlagen der MALDI-TOF Massenspektrometrie ein.
II Problemstellung: Erläutert die säurekatalysierte Depurinierung als Hauptursache für Signalverschlechterungen bei der MALDI-TOF MS von Nukleinsäuren und definiert die Synthese von 7-Deazapurinen als Lösungsansatz.
III Ergebnisse und Diskussion: Detaillierte Darstellung der Synthese modifizierter Basen, der Festphasensynthese modifizierter Oligonukleotide sowie deren Anwendung in enzymatischen Reaktionen und MALDI-TOF Analysen.
IV Zusammenfassung: Fasst die Ergebnisse der Arbeit zusammen, insbesondere die verbesserte Stabilität und Analytik durch die Kombination von Basen- und Zuckermodifikationen.
V Summary: Englische Zusammenfassung der wissenschaftlichen Erkenntnisse.
VI Diskussion und Ausblick: Kritische Würdigung der erreichten Ergebnisse und Diskussion zukünftiger Entwicklungen in der massenspektrometrischen DNA-Analytik.
VII Experimenteller Teil: Dokumentation der verwendeten Geräte, Chemikalien, Syntheseprotokolle und analytischen Daten.
VIII Literaturverzeichnis: Umfassende Auflistung der für die Arbeit relevanten wissenschaftlichen Quellen.
Schlüsselwörter
MALDI-TOF Massenspektrometrie, DNA-Analytik, 7-Deazapurine, 2-Fluoronukleotide, Oligonukleotidsynthese, Phosphoamiditmethode, PCR, Depurinierung, Nukleinsäuren, Massenauflösung, Biotin-Streptavidin-System, Sequenzanalyse, Zuckermodifikation, DNA-Stabilität, Probenkonditionierung
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit befasst sich mit der Verbesserung der massenspektrometrischen Analyse von DNA durch chemische Modifikationen, um die bei MALDI-TOF Messungen auftretende Depurinierung zu unterbinden.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Die zentralen Felder umfassen die organische Synthese modifizierter Nukleoside, deren Inkorporation in Oligonukleotide via Festphasensynthese sowie deren Einsatz in enzymatischen Reaktionen wie der Polymerasekettenreaktion.
Was ist das primäre Ziel der Forschungsarbeit?
Das primäre Ziel ist die Steigerung der Stabilität, Nachweisempfindlichkeit und Massenauflösung bei der MALDI-TOF Analyse von Nukleinsäuren durch den Einbau von 7-Deazapurinen und modifizierten Zuckereinheiten.
Welche wissenschaftliche Methode wird primär verwendet?
Die primäre analytische Methode ist die MALDI-TOF Massenspektrometrie, ergänzt durch klassische organische Synthesemethoden und enzymatische Amplifikationstechniken wie die PCR.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in die chemische Synthese der modifizierten Synthesebausteine, die Festphasensynthese der modifizierten Oligonukleotide und die Untersuchung ihres Verhaltens in biochemischen Prozessen und massenspektrometrischen Analysen.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Die Arbeit wird durch Begriffe wie MALDI-TOF MS, 7-Deazapurine, 2-Fluoronukleotide, Festphasensynthese und DNA-Stabilisierung charakterisiert.
Warum ist die Depurinierung ein Problem bei der MALDI-TOF MS von DNA?
Die Depurinierung führt während des MALDI-Prozesses zur Fragmentierung der DNA, was das Molekülionensignal durch Peaktailing verschlechtert und die massenspektrometrische Bestimmung der Molekülmasse erheblich erschwert.
Welchen Vorteil bietet die 7-Deazamodifikation?
Durch das Ersetzen des N7-Stickstoffatoms im Purinring durch eine Methingruppe wird die Stabilität gegenüber saurer Hydrolyse drastisch erhöht, was die Fragmentierung bei der Desorption und Ionisation im Massenspektrometer stark reduziert.
- Quote paper
- Dr. Carsten Siegert (Author), 1999, Chemische und enzymatische Synthese modifizierter Nukleinsäuren für die Analytik mit Hilfe der MALDI-TOF Massenspektrometrie, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/25015
