Im folgenden Versuch wurde das Enzym Lysozym, eine Muramidase, mit Hilfe einer Kationenaustauschchromatographie aus Hühnereiweiß aufgereinigt. Anhand einer Proteinbestimmung nach Bradford, einer Enzymaktivitätsbestimmung und einer SDS-PAGE wurden die einzelnen Reinigungsschritte untersucht.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
2. Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Kationenaustauschchromatographie
2.1.2 Proteinbestimmung nach Bradford
2.1.3 Diskontinuierliche SDS-PAGE nach Laemmi
2.1.4 Enzymaktivitätstest
2.2 Methoden
2.2.1 Kationenaustauscher
2.2.2 Proteinbestimmung nach Bradford
2.2.3 SDS-PAGE
2.2.4 Enzymaktivitätstest
3. Ergebnisse
3.1 Kationenaustauscher
3.2 Proteinbestimmung nach Bradford
3.3 SDS-PAGE
3.4 Enzymaktivitätstest
3.5 Reinigungstabelle
4. Diskussion
4.1 Kationenaustauschchromatographie
4.2 Proteinbestimmung nach Bradford
4.3 SDS-PAGE
4.4 Enzymaktivität
4.4.1 Zusammenfassung
5. Anhang
5.1 Beispielrechnungen
5.2 Rohdaten
5.2.1 Proteinbestimmung nach Bradford
5.2.2 Enzymaktivitätstest
Zielsetzung & Themen
Ziel dieser Arbeit ist die erfolgreiche Aufreinigung des Enzyms Lysozym aus Hühnereiweiß mittels Kationenaustauschchromatographie sowie die anschließende quantitative und qualitative Analyse der Reinheit und Enzymaktivität.
- Kationenaustauschchromatographie als präparatives Trennverfahren
- Proteinbestimmung nach Bradford zur Konzentrationsmessung
- Analytik mittels diskontinuierlicher SDS-PAGE
- Bestimmung der Enzymaktivität durch photometrische Messungen
- Berechnung von Anreicherungsfaktoren und Reinigungsausbeute
Auszug aus dem Buch
SDS-PAGE
Die Gelelektrophorese ist eine essentielle Methode zur Auftrennung und Identifizierung verschiedener Moleküle anhand ihrer Ladung und ihrer molekularen Masse. Eine spezielle Variante ist die diskontinuierliche Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (engl. sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, kurz SDS-PAGE). Das Gel ist ein Polymerisat aus Acrylamid und dem Quervernetzer N,N’-Methylenbisacrylamid. Für die Polymerisation wird ein Radikalstarter, z.B. Ammoniumpersulfat (APS), sowie ein Katalysator, z.B. Tetramethylethylendiamin (TEMED) benötigt. Diese Komponenten werden als letztes in den Ansatz gegeben, um eine frühzeitige Polymerisation im Tube zu verhindern.
Bei der diskontinuierlichen SDS-PAGE handelt sich um ein vertikales Gel, welches aus einem Sammel- und einem Trenngel besteht. Zunächst wird das Trenngel gegossen und mit Wasser überschichtet, um die Oberfläche zu glätten und den Abbruch der Polymerisation durch Luft zu verhindern. Nachdem das Trenngel auspolymerisiert ist, wird das Wasser vorsichtig entfernt, dass Sammelgel auf das Trenngel gegossen und ein Kamm eingesteckt. Das Sammelgel weist einen höheren pH auf und ist durch den geringen Acrylamidgehalt großporiger als das Trenngel. Es dient der Aufkonzentrierung der Probe vor dem Eintritt in das Trenngel.
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Beschreibt die theoretischen Grundlagen der Proteinaufreinigung und die spezifische Zielsetzung, Lysozym aus Hühnereiweiß mittels Ionenaustauschchromatographie zu isolieren.
2. Material und Methoden: Listet detailliert die verwendeten Puffer, Chemikalien, Gel-Zusammensetzungen sowie die experimentellen Vorgehensweisen für Chromatographie, Bradford-Test, SDS-PAGE und Aktivitätsmessung auf.
3. Ergebnisse: Präsentiert die gewonnenen Daten, einschließlich der Eichkurven, der dokumentierten Reinigungsschritte durch SDS-Gelbilder und der berechneten Anreicherungswerte in der Reinigungstabelle.
4. Diskussion: Analysiert die Fehlerquellen während des Versuchs, insbesondere die Problematik der Eichreihe und der kaputten Säule, und bewertet den Reinheitsgrad des isolierten Lysozyms.
5. Anhang: Enthält die vollständigen mathematischen Berechnungswege sowie die tabellarischen Rohdaten aller photometrischen Messungen.
Schlüsselwörter
Lysozym, Kationenaustauschchromatographie, Proteinreinigung, SDS-PAGE, Bradford-Test, Enzymaktivität, Muramidase, Hühnereiweiß, Gelelektrophorese, Konzentrationsbestimmung, Anreicherungsfaktor, Proteinbiochemie, Säulenchromatographie, Laborpraktikum, Molekülmasse.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit befasst sich mit der biochemischen Aufreinigung des Enzyms Lysozym aus Hühnereiweiß unter Verwendung einer Ionenaustauschchromatographie.
Welche wissenschaftliche Methode wird primär zur Trennung genutzt?
Es wird eine Kationenaustauschchromatographie eingesetzt, bei der die basischen Eigenschaften des Lysozyms (hoher isoelektrischer Punkt) zur Bindung an die Matrix genutzt werden.
Was ist das Ziel der Proteinbestimmung nach Bradford?
Die Methode dient dazu, die Proteinkonzentration in den verschiedenen Fraktionen des Reinigungsprozesses photometrisch zu bestimmen.
Wie wurde die Reinheit des Lysozyms kontrolliert?
Die qualitative Kontrolle erfolgte durch eine diskontinuierliche SDS-PAGE, während die quantitative Überprüfung über die spezifische Enzymaktivität und einen Anreicherungsfaktor durchgeführt wurde.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in die methodische Beschreibung der Experimente, die Darstellung der erzielten Ergebnisse und eine kritische Diskussion der Fehlerquellen.
Welche Charakteristika definieren diese Arbeit?
Die Arbeit zeichnet sich durch eine Kombination aus präparativer Labortätigkeit, analytischer Quantifizierung und einer detaillierten Fehlerdiskussion aus.
Welchen Einfluss hatte die misslungene Eichreihe auf die Ergebnisse?
Die fehlerhafte Eichreihe führte zu ungenauen Konzentrationswerten, was Folgefehler bei der Beladung des SDS-Gels und der Berechnung der Anreicherung verursachte.
Warum wird im Versuch eine Bakteriensuspension verwendet?
Die Bakteriensuspension dient als Substrat für den Enzymaktivitätstest, da Lysozym als Muramidase die Zellwände (Murein) von Bakterien wie Micrococcus lysodeikticus hydrolysiert.
- Arbeit zitieren
- Anonym (Autor:in), 2012, Reinigung von Lysozym durch Ionenaustausch-Chromatographie, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/278388
