Aspectos teóricos de las pruebas diagnósticas de biología molecular para la identificación de neospora caninum en fetos bovinos de establos del estado de Hidalgo, México

INDICE

Resumen

Introducción

1. Antecedentes Históricos de Neospora caninum
1.1 Neosporosis Bovina
1.2 Neosporosis en México

2. Características de Neospora caninum
2.1 Taxonomía y Morfología
2.2 Ciclo de Vida de Neospora caninum
2.3 Transmisión de Neospora caninum
2.3.1 Transmisión Vertical
2.3.2 Transmisión Horizontal
2.3.3 Neosporosis en Hembras
2.3.4 Neosporosis en Fetos

3. Tratamiento y Principales Medidas de Control

4. Pruebas Diagnósticas para la Identificación de Neospora caninum
4.1 Técnicas Basadas en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la Detección de Neospora caninum
4.1.2 PCR Convencional
4.1.3 PCR Anidado
4.1.4 PCR Semi-anidado
4.1.5 PCR-RFLP
4.1.6 RAPD-PCR
4.1.7 PCR Tiempo Real o qPCR

5. Aspectos Generales en la Estandarización de la Extracción de ADN y de la qPCR
5.1 Estandarización de la Extracción de ADN
5.2 Aspectos Generales de la Estandarización de la qPCR

6. El Control Interno de Amplificación en la qPCR

7. Sistemas de Detección con dos Fluoróforos en la qPCR

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Resumen

Neospora caninum es un protozoario intracelular obligado que pertenece al phylum Apicomplexa, familia Sarcosystidae. Éste parásito, fue confundido con Toxoplasma gondii, debido a sus similitudes estructulares, Thilsted y Dubey identificaron por primera vez a N. caninum en 1988 como agente etiológico de aborto en bovinos (Dubey, 1999). En 1993 se consiguió el primer aislamiento procedente de un feto bovino abortado (Conrad et al, 1993). Posteriormente, se logró la reproducción de la muerte fetal en vacas gestantes inoculadas experimentalmente (Barr et al, 1994). N. caninum se ha detectado en la mayoría de las especies domésticas como los bovinos, quienes ingieren ooquistes excretados por caninos, identificados como hospederos definitivos. Se plantea que la humedad, como es el caso de la zona estudiada, posibilita que los ooquistes expulsados al exterior esporulen y permanezcan en fase infectiva y viables en la tierra, suelos y pastos por varios meses (Dubey, 1999). Esto deviene en una vía de transmisión segura, para el hospedero intermediario. En bovinos gestantes, la ingestión puede conducir a la transmisión transplacentaria exógena o en el caso de infección crónica, a la transmisión endógena debida a la reactivación de quistes que contienen bradizoitos, que, en la mayoría de los casos desencadena el proceso abortivo. Al no haber lesiones macroscópicas patognomónicas, el diagnóstico puede hacerse de diferentes formas. El estudio histopatológico de tejido fetal esencialmente de cerebro se utiliza como prueba de escrutinio, a pesar de su baja sensibilidad; ya que no requiere de una operación costosa (Anderson et al, 2000; Dubey et al, 1997; Jenkins et al, 2002; Reichel et al, 2000). Pero, la aplicación de rtPCR se ha empleado mayoritariamente en tejido del sistema nervioso central, como prueba confirmatoria, por su alta sensibilidad y especificidad, aunque no se ha usado de manera rutinaria en el diagnóstico, básicamente por el alto costo, equipo y experiencia requeridos para desarrollar dicha técnica (De Meerschman et al, 2002; Wouda et al, 1997).

En México se han realizado diferentes estudios para estimar la seroprevalencia del parásito en animales hospederos. Sin embargo, la identificación del agente causal de abortos bovinos, debe estipularse de manera clara a través de una técnica sensible y específica como PCR, con dicho análisis la detección de DNA compatible con N. caninum sería útil para confirmar el diagnóstico de éste protozoario, sin la confusión con algún otro parásito, además se define el estado de infección para plantear posteriores tratamientos farmacológicos en bovinos (Timothy et al, 1999).

A continuación se presentan los aspectos teóricos del ciclo de vida de éste parásito, así como las pruebas diagnósticas de biología molecular que involucran una vía para el diagnóstico de N. caninum.

Introducción

Neospora caninum es un protozoario intracelular obligado que pertenece al phylum Apicomplexa, familia Sarcosystidae. Éste parásito, fue confundido con Toxoplasma gondii, debido a sus similitudes estructulares. Thilsted y Dubey, identificaron recientemente a N. caninum en el año de 1988, relacionándolo como agente etiológico de aborto en bovinos (Dubey, 1999). Sin embargo, fue en 1991 cuando se obtuvo el primer aislamiento del parásito directo de tejidos fetales de bovinos, en Estados Unidos (Conrad et al, 1993). Posteriormente, se logró la reproducción de la muerte fetal en vacas gestantes inoculadas experimentalmente (Barr et al, 1994). N. caninum se ha detectado en la mayoría de las especies domésticas como los bovinos, quienes ingieren ooquistes excretados por caninos, identificados como hospederos definitivos. Se plantea que la humedad, como es el caso de la zona estudiada, posibilita que los ooquistes expulsados al exterior esporulen y permanezcan en fase infectiva y viables en la tierra, suelos y pastos por varios meses (Dubey, 1999). Esto deviene en una vía de transmisión segura, para el hospedero intermediario. En bovinos gestantes, la ingestión puede conducir a la transmisión transplacentaria exógena o en el caso de infección crónica, a la transmisión endógena debida a la reactivación de quistes que contienen bradizoitos, que, en la mayoría de los casos desencadena el proceso abortivo. Al no haber lesiones macroscópicas patognomónicas, el diagnóstico puede hacerse de diferentes formas. El estudio histopatológico de tejido fetal esencialmente de cerebro se utiliza como prueba de escrutinio, a pesar de su baja sensibilidad; ya que no requiere de una operación costosa (Álvarez, 2003; Dubey et al, 1997; Jenkins et al, 2002; Reichel, 2000). Pero, la aplicación de rtPCR se ha empleado mayoritariamente en tejido del sistema nervioso central, como prueba confirmatoria, por su alta sensibilidad y especificidad, aunque no se ha usado de manera rutinaria en el diagnóstico, básicamente por el alto costo, equipo y experiencia requeridos para desarrollar dicha técnica (De Meerschman et al, 2002; Wouda et al, 1997).

En México se han realizado diferentes estudios para estimar la seroprevalencia del parásito en animales hospederos. Sin embargo, la identificación del agente causal de abortos bovinos, debe estipularse de manera clara a través de una técnica sensible y específica como PCR, con dicho análisis la detección de DNA compatible con N. caninum sería útil para confirmar el diagnóstico de éste protozoario, sin la confusión con algún otro parásito, además se define el estado de infección para plantear posteriores tratamientos farmacológicos en bovinos (Timothy et al, 1999).

Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo es identificar la presencia de N. caninum mediante la técnica de PCR cuantitativa, en cerebros de fetos bovinos abortados de establos del Estado de Hidalgo, México.

Para llevar a cabo la identificación del parásito mediante PCR cuantitativa, se revisará la información bibliográfica que nos permitirá establecer cuáles son los factores de cada etapa implicada en el diagnóstico para estandarizar los procesos y tener un resultado confiable.

Una vez estandarizado todo el procedimiento para el diagnóstico, se realizarán las extracciones y purificaciones de ADN a partir de muestras de cerebro, las cuales, tendrán que ser evaluadas para confirmar la presencia de éste ácido nucleico, a través de electroforesis. Para determinar la pureza del material genético, se realizará una cuantificación de ADN con la ayuda de un método espectrofotométrico. Donde la absorbancia en la lectura es el cociente entre 260 nm correspondiente a una solución de ADN doble hebra de 50 μg por mL en una cubeta de 1cm3 de camino óptico y aquella obtenida a 280 nm, rango que indica contaminaciones con proteínas; el rango del cociente que indica el alto grado de pureza, va entre 1.8 y 2 μg/mL, mientras que cocientes inferiores sólo reflejan contaminación con proteínas (Espitia et al, 2004).

Una vez cumplida con dicha valoración del analito, se pasará a la siguiente etapa para la determinación de N. caninum, por PCR cuantitativa. Se tendrá que corroborar en el proceso de estandarización la concordancia de los resultados obtenidos entre réplicas y en diferentes corridas. Así mismo, deberán optimizarse los parámetros críticos para dicha técnica y determinar aquellos que sean imprescindibles para que el sistema sea confiable (Binder, 1997h; Organización Mundial de Sanidad Animal, 2004). En la determinación del protozoario.

Finalmente, la estandarización de la extracción y del PCR nos conducirá a una adecuada interpretación en las lecturas de amplificación.

1. Antecedentes Históricos de Neospora caninum

Se denomina neosporosis a la enfermedad producida por protozoos del género Neospora. Esta parasitosis se diagnosticó por primera vez en 1984, Noruega, por Bjerkas y colaboradores; los cuales describieron una encefalopatía mortal en seis cachorros de la raza Bóxer, los cuales resultaron serológicamente negativos a Toxoplasma gondi, fue caracterizada por encefalomielitis y miositis (Salinas et al, 2005). Sin embargo, casos similares fueron descritos en Estados Unidos hasta que finalmente el género Neospora se logró describir por primera vez en 1988, incluyéndose una única especie en ese momento: Neospora caninum (Dubey et al, 1988b); en ese mismo año, se obtuvo el primer aislado del parásito a partir de muestras de origen canino (Dubey et al, 1988a). La obtención in vitro del primer aislado de N. caninum permitió el desarrollo de una prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFAT) para el diagnóstico serológico de la neosporosis; un año más tarde (1989), Lindsay y Dubey desarrollaron una prueba de inmunohistoquímica (IHQ) para la detección del parásito en tejidos de animales infectados. Posteriormente, se fueron empleando otro tipo de pruebas diagnósticas, que a grandes rasgos, podemos clasificarlas en indirectas, como el inmunoensayo (ELISA), la prueba de aglutinación directa y el Western Blot (Atkinson et al, 2000b; Björkman y Uggla, 1999) y directas como la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Holmdahl y Mattsson, 1996; Lally, 1996a; Yamane et al, 1996), incluyendo la PCR cuantitativa (Álvarez, 2003; Collantes et al, 2002; Müller, 2002), siendo esta última altamente específica y sensible para la detección de infección fetal (Anderson et al, 2000; Pereira, 2003).

En 1989 comenzaron a desarrollarse los primeros modelos experimentales de la enfermedad por Lindsay y Dubey, que realizaron las primeras inoculaciones del parásito en ratones y ratas55. Estudios subsecuentes han demostrado N. caninum tiene rango amplio de hospederos, entre ellos se encuentran animales domésticos, como bovinos, felinos, caninos, equinos y animales silvestres. Finalmente, el descubrimiento del perro como el hospedador definitivo de N. caninum puso de manifiesto la posibilidad de transmisión horizontal, en 1998 por McAllister. En éste mismo año, el parásito es considerado como el agente causal de aborto en bovinos44.

En 1989, Speer y Dubey realizaron estudios sobre la ultraestructura de los taquizoítos, bradizoítos y quistes tisulares; mientras Thilsted y Dubey (1989) describieron, por primera vez, a N. caninum como agente etiológico de abortos en el ganado bovino.En la actualidad, la importancia de la neosporosis bovina tiene repercusiones económicas a nivel mundial, que cruza con aborto, mortalidad neonatal y nacimiento de terneros con sintomatología neuromuscular o clínicamente sanos, pero crónicamente infectados (Álvarez, 2003; Thilsted y Dubey, 1989).

Los primeros estudios sobre los mecanismos de transmisión de N. caninum realizados por Lindsay y Dubey en 1990, pusieron de manifiesto la importancia de la transmisión vertical del parásito y establecieron un modelo experimental en el ratón para el estudio patogénico de la infección (Álvarez, 2003). Así mismo, se demostró la transmisión transplacentaria en caninos, felinos, ovinos y bovinos. En 1992, se confirma experimentalmente, la transmisión vertical del parásito en la especie bovina (Dubey, 1992).

Un punto importante en la corta historia del género Neospora, fue la descripción de una segunda especie, la cual provoca trastornos neurológicos en el caballo: Neospora hughesi. Posteriormente, diversos autores pusieron en evidencia las diferencias ultraestructurales, antigénicas, genéticas y de patogenicidad existentes entre esta nueva especie y N. caninum (Marsh et al, 1998; Pérez, 2004).

Aunque en años atrás ya se había descrito al parásito y se habían reportado casos en otros países, en México, la neosporosis fue detectada en 1997 en un feto bovino abortado, de la raza Holstein, que presentó lesiones histopatológicas características, confirmándose la presencia del parásito a través de IHQ (Salinas et al, 2005).

1.1 Neosporosis Bovina

Aunque inicialmente, la neosporosis fue descrita como una enfermedad neuromuscular grave en el perro, el descubrimiento de N. caninum como agente causal de aborto en ganado bovino de leche y carne impulsó el desarrollo de los primeros estudios sobre la enfermedad en esta especie; posteriormente se han realizado numerosos trabajos para conocer la prevalencia real de la infección y la participación del parásito en el aborto y la mortalidad neonatal. Desde las décadas de los ochenta N. caninum ha emergido, como un importante parásito, de enfermedades reproductivas entre bovinos; en 1989 Thilsted y Dubey reconocieron al protozoario como agente etiológico del aborto en esta especie doméstica, además en 1991, Anderson y Barr, dieron a conocer a la neosporosis como la primera causa de aborto en el ganado lechero en California (EE.UU.) (Álvarez, 2003; Anderson et al, 1991; Muñoz, 2004; Pérez, 2004). El primer aislamiento asociado a Neospora caninum fue en 1987, en una finca lechera en Nuevo México. Aunque, estudios retrospectivos en California sugieren que este protozoo ya se encontraba en el año 1985 (Álvarez, 2003).

El aborto es el signo clínico más característico de la neosporosis bovina, se presenta durante todo el año (Anderson et al, 1991), existiendo países donde es más común, en verano y otros en invierno. Además, tanto los bovinos productores de carne, como los de leche pueden estar afectados por el parásito, no existiendo, hasta el presente, ninguna predisposición racial (Dubey, 1999).

En el ganado bovino, las lesiones se localizan, principalmente, en el feto abortado, los cuales pueden aparecer totalmente autolíticos o momificados, siendo esta última presentación relativamente común por el parásito; se han observado algunas características clínicas en placenta. Las lesiones más comunes se van a presentar en los fetos abortados; en animales adultos, que estando infectados, no suelen manifestar alteraciones anatomopatológicas evidentes (Álvarez, 2003).

Las alteraciones macroscópicas en fetos son raras y suelen presentarse en la musculatura, tanto esquelética como cardiaca, en forma de pequeñas áreas blanquecinas que profundizan a la sección. Microscópicamente, sólo se observa zonas con inflamación, focos de necrosis, las cuales pueden aparecer en cualquier órgano o tejido fetal, por frecuencia de aparición destaca el sistema nervioso central (SNC), el corazón, el músculo esquelético y el hígado. N. caninum es detectado casi exclusivamente en las lesiones del SNC, este parásito invade de forma activa neuronas y astrocitos, provocando trastornos neuromusculares graves por la destrucción de estas células (Pérez, 2004).

1.2 Neosporosis en México

La neosporosis bovina constituye una enfermedad de reciente descubrimiento en México, fue detectada en 1997 en un feto abortado de la raza Holstein, macho, de cinco meses de gestación, que presentó lesiones histológicas características, confirmándose la presencia del parásito a través de inmunohistoquímica. El parásito ha sido reconocido como una de las principales causas de aborto a nivel mundial, principalmente en países como Estados Unidos, Nueva Zelanda y Holanda, además de que también se ha reconocido en Canadá, Gran Bretaña, Bélgica, Suecia, Dinamarca, Australia, Japón, Sudáfrica, Israel, Argentina y México (Salinas et al, 2005).

Los estudios clínico-patológicos sobre esta enfermedad han sido insuficientes, debido a los pocos años de hallazgo que tiene. Sin embargo, en lo que respecta a México, ya se han podido detectar lesiones fetales características en tejido muscular y hepático. Se han encontrado quistes parasitarios y taquizoítos en el sistema nervioso central de fetos abortados, lo cual ha sido confirmado principalmente mediante técnicas como la inmunohistoquímica, la seropositividad utilizando ELISA, esto se ha confirmado en diversos hatos del Altiplano Mexicano (Morales et al, 1997).

2. Características de Neospora caninum

2.1 Taxonomía y Morfología

Neospora caninum, es un protozoario intracelular obligado, perteneciente al phylum Apicomplexa, clase Sporozoea, subclase Coccidia, orden Eucoccidia, suborden Eimeriina y familia Sarcocystidae. Morfológicamente es similar a Toxoplasma gondii, ambos se caracterizan por tener ciclos biológicos heteroxenos, es decir, existen varios huéspedes donde se desarrolla el parásito y forman quistes en el hospedador intermediario (Pérez, 2004).

Cabe destacar cuatro especies estrechamente relacionadas: N. caninum, T. gondii, H. hammondi y H. heydorni, cuyos ooquistes tienen un tamaño similar. Sin embargo, presentan importantes diferencias tanto biológicas como estructurales, que justifican la existencia del género N. caninum (Dubey et al, 2002a; Dubey et al, 2002b). El empleo de pruebas diagnósticas serológicas específicas ha permitido diferenciar a N. caninum de otras especies, debido a su composición antigénica. Estudios filogenéticos basados en el análisis de la secuencia de la subunidad menor del ARN ribosomal (nss-ARNr), mostraron un elevado grado de homología entre N. caninum y T. gondii, sugiriendo que los dos organismos podrían pertenecer al mismo género (Muñoz, 2004). Sin embargo, cuando se investigaron los genomas de Neospora, de Toxoplasma y de Sarcocystis mediante técnicas de RAPD-PCR se encontraron diferencias significativas (Guo y Johnson, 1995). En el ciclo biológico, se ha logrado discernir como hospedador definitivo de N. caninum al perro, mientras que el gato es hospedador definitivo de H. heydorni, T. gondii y H. hammondi (Pérez, 2004).

Morfológicamente, se distinguen tres etapas infecciosas claramente definidas; los taquizoítos, los quistes tisulares con bradizoítos en el interior y los ooquistes, las dos primeras etapas son identificadas, en el hospedador intermedio, mientras, que la última, se encuentra en el hospedador definitivo. Los taquizoítos tienen un tamaño que oscila entre 3-7 μm de longitud y 1-5 μm de anchura y una morfología ovoide, globular o lunar, dependiendo de la etapa de división en la que se encuentren. Los quistes tisulares miden aproximadamente 100 μm de diámetro, tienen forma redondeada u oval y pueden contener en su interior hasta 200 bradizoítos, éstos tienen aproximadamente de 6-8 μm de longitud por 1-1,8 μm de anchura. Los ooquistes tienen forma esférica o subesférica, su tamaño medio es de 11.7 μm longitud y 11,3 μm de anchura (Dubey y Lindsay, 1996; Dubey, 1999).

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