In dieser Bachelorarbeit wurden verschiedene Genetische Marker für hämatologische Krebserkrankungen (z.B. MyD88, U2AF1, Jak2), mithilfe derer Aussagen über die Diagnose bzw. Prognose einer Krebserkrankungen machen können, eingesetzt, um die Methode der Pyrosequenzierung auf ihre Grenzen hin zu testen. Es wurden verschiedene Ansätze (Plasmide, Patienten-DNA, etc.) gewählt, bei denen Verdünnungsreihen mittels Pyrosequenzierung analysiert wurden. Somit wurde letztendlich getestet, wie wenig mutierte Allele in einer Patientenprobe vorhanden sein dürfen, damit die Methode die Mutation noch zuverlässig detektiert.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Anwendungen von Sequenzanalysen in der Onkologie
1.2 Pyrosequenzierung als etablierte Methode in der Sequenzanalyse
1.3 Im Rahmen dieser Arbeit untersuchte genetische Marker
1.4 Zielsetzungen dieser Arbeit
2 Material
2.1 Verbrauchsmaterialien
2.2 Zelllinien
2.3 Patientenproben
2.4 Primer
2.5 Kitsysteme
2.6 Reagenzien und Lösungen
2.7 Geräte, Software und Datenbanken
3 Methoden
3.1 DNA-Isolierung aus FFPE-Gewebe
3.2 DNA-Konzentrationsbestimmung
3.2.1 NanoDrop 2000 Spectrophotometer
3.2.2 Qubit® 2.0 Fluorimeter
3.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
3.4 Quantitative real-time PCR
3.5 Klonierung mittels TOPO® TA Cloning® - Technologie
3.6 Plasmidisolierung
3.7 Pyrosequenzierung
3.8 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
4 Ergebnisse
4.1 Verdünnungsanalysen des Gens U2AF1
4.2 Verdünnungsanalysen des Gens MYD88
4.3 Verdünnungsanalysen des Gens Jak2
5 Diskussion
5.1 U2AF1: Analytische Sensitivität von Codon S34 im Vergleich zu Codon Q157
5.2 MYD88: Sensitivität niedriger als bei Codon S34 trotz Auftreten zusätzlicher Peaks
5.3 Jak2: Anwendung einer Zelllinien-Mischungsstudie zur Evaluierung der Sensitivität des Assays
5.4 Ausblick
Zielsetzung & Themen
Das Hauptziel dieser Arbeit ist die quantitative Validierung von Pyrosequenzierungs-Assays für die hämatopathologische Diagnostik, um durch die Herstellung definierter Positivkontrollen die analytische Sensitivität (Limit of Detection) zuverlässig bestimmen zu können.
- Validierung von Mutations-Hotspots in den Genen U2AF1, Jak2 und MYD88
- Etablierung einer Methode zur Erstellung von Positivkontrollen mittels Klonierung und Zelllinien-Mischungsstudien
- Vergleich der Sensitivität bei unterschiedlichen Mutationsereignissen (Peaks vs. Peak-Höhenänderungen)
- Simulation eines diagnostisch relevanten Hintergrunds durch Einbettung in FFPE-DNA-Matrizen
Auszug aus dem Buch
3.7 Pyrosequenzierung
Die Pyrosequenzierung ist eine quantitative „sequence-by-synthesis“-Technik, mit der die Basenabfolge kurzer DNA-Abschnitte und somit mögliche Mutationen und Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP) detektiert werden können. Grundlage dieser Sequenziermethode ist eine enzymkatalysierte Reaktionskaskade, die nur bei Einbau des richtigen Nukleotids ablaufen kann und nur unter dieser Voraussetzung die Generation eines Lichtsignals zur Folge hat (siehe Abb. 3). Zunächst setzt eine Polymerase bei Inkorporation des entsprechenden Nukleotids Pyrophosphat (PPi) frei, welches durch die ATP Sulfurylase und dem Substrat Adenosin-5‘-phosphosulfat (APS) zu ATP umgewandelt wird. Letzteres wird dann für die Oxidation von Luciferin durch die Luciferase benötigt, wobei ein Lichtsignal von einer CCD-Kamera detektiert wird. Dieses Lichtsignal ist proportional zu der Anzahl eingebauter Nukleotide. Das Enzym Apyrase baut nach jedem Zyklus überschüssige Nukleotide und ATP Moleküle ab. Als Resultat wird ein Pyrogram erhalten, anhand dessen die DNA Sequenz abgelesen werden kann (Harrington et al. 2013).
Zunächst wird der zu sequenzierende DNA-Abschnitt mittels PCR vervielfältigt, wobei einer der beiden eingesetzten Primer einen tail besitzt (bzw. direkt biotinyliert ist). Der PCR-Ansatz enthält außerdem einen universal-biotinylierten Primer, dessen Sequenz komplementär zu der des tails ist, sodass das entstehende PCR-Produkt anschließend an Streptavidin Sepharose beads gebunden werden kann. Diese Bindung an die beads erfolgt durch 5-minütiges Schütteln einer 96-Well Platte, in der jeweils 5 µL PCR-Produkt (bei dem Gen U2AF1 7,5 µL) mit 47 µL Binding Buffer, 25 µL HPLC-H2O und 3 µL Streptavidin Sepharose beads versetzt wurden.
Zusammenfassung der Kapitel
1 Einleitung: Diese Einleitung thematisiert die Bedeutung molekularbiologischer Mutationsanalysen in der Onkologie sowie die Etablierung der Pyrosequenzierung als quantitative Diagnostikmethode.
2 Material: In diesem Kapitel werden alle verwendeten Verbrauchsmaterialien, Zelllinien, Patientenproben, Primer, Kits sowie die eingesetzte technische Ausstattung aufgelistet.
3 Methoden: Dieses Kapitel erläutert die experimentellen Verfahren, von der DNA-Isolierung aus FFPE-Gewebe über die qPCR-basierte Quantifizierung bis hin zur Klonierung und Durchführung der Pyrosequenzierung.
4 Ergebnisse: Hier werden die Verdünnungsanalysen der Gene U2AF1, MYD88 und Jak2 präsentiert und die jeweils ermittelte analytische Sensitivität dargestellt.
5 Diskussion: Dieses Kapitel bewertet die erzielten Ergebnisse im Vergleich zur Fachliteratur und reflektiert die Stärken und Grenzen der verwendeten Kontrollmethoden.
Schlüsselwörter
Pyrosequenzierung, Validierung, Onkologie, U2AF1, Jak2, MYD88, Sensitivität, Limit of Detection, Positivkontrollen, Mutation, Sequenzanalyse, FFPE, Plasmid, Zelllinie, Diagnostik.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit beschäftigt sich mit der quantitativen Validierung von Pyrosequenzierungs-Assays, die in der molekularen Diagnostik eingesetzt werden, um Mutationen bei Krebserkrankungen präzise nachzuweisen.
Welche zentralen Themenfelder werden behandelt?
Die Schwerpunkte liegen auf der Evaluierung der analytischen Sensitivität verschiedener genetischer Marker (U2AF1, Jak2, MYD88) sowie der methodischen Erstellung von Positivkontrollen für die Routinediagnostik.
Was ist das primäre Ziel der Forschungsarbeit?
Das Ziel ist die Etablierung einer zuverlässigen Anleitung zur Erstellung von Positivkontrollen, um die Nachweisgrenze (LOD) von Pyrosequenzierungs-Assays effizient bestimmen zu können.
Welche wissenschaftliche Methode wird primär verwendet?
Die Hauptmethode ist die Pyrosequenzierung in Kombination mit anderen Verfahren wie der real-time PCR, DNA-Klonierung und der Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil befasst sich detailliert mit den experimentellen Verdünnungsreihen unter Verwendung von Plasmiden und Zelllinien-DNA sowie der anschließenden Interpretation der gewonnenen Pyrogramme.
Welche Begriffe charakterisieren diese Arbeit am besten?
Die wichtigsten Schlagworte umfassen Pyrosequenzierung, analytische Sensitivität, Mutationsnachweis, Positivkontrolle und onkologische Diagnostik.
Warum spielt die Reinheit des FFPE-Gewebes für die Untersuchung eine Rolle?
FFPE-Gewebe dient als realitätsnahe Matrix, um die Bedingungen in einer Patientenprobe zu simulieren und das Hintergrundrauschen bei der Mutationsanalyse realistisch abzubilden.
Warum ist die Klonierung von MYD88-Fragmenten notwendig?
Die Klonierung ermöglicht die präzise Kontrolle der mutierten Allelmenge, wenn keine geeignete Zelllinie mit der spezifischen Mutation verfügbar ist, was eine exakte Bestimmung der Sensitivität erlaubt.
- Arbeit zitieren
- Lena Thöle (Autor:in), 2014, Quantitative Validierung von Pyrosequenzierungs-Assays für die hämatopathologische Diagnostik, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/299936
