Desarrollo de un esquema de purificación para la hormona de crecimiento bovina producida por Pichia pastoris

TABLA DE CONTENIDO

Contenido Página:

Lista de Cuadros

Lista de Figuras

Nomenclatura

CAPÍTULO I. MARCO TEÓRICO
1.1. Introducción
1.2. Antecedentes
1.2.1. Cromatografía de intercambio aniónico
1.2.2. Cromatografía de interacciones hidrofóbicas
1.2.3. Cromatografía de exclusión molecular
1.2.4. Cromatografía líquida de alta resolución
1.3. Justificación
1.4. Hipótesis

CAPÍTULO II. OBJETIVOS
2.1. General
2.2. Particulares

CAPÍTULO III. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. Esquema general del trabajo
3.2. Material
3.2.1. Equipo
3.2.2. Material
3.2.3. Reactivos
3.3. Métodos
3.3.1. Purificación de la bGH
3.3.2. Cromatografía de intercambio aniónico
3.3.3. Cromatografía de interacciones hidrofóbicas
3.3.4. Cromatografía de exclusión molecular
3.3.5. Cromatografía liquida de alta resolución
3.3.6. Western Blot Contenido Página:
3.4. Análisis de proteínas
3.4.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida
3.4.1.1. Preparación de soluciones stock
3.4.1.2. Procedimiento
3.4.2. Cuantificación de proteínas totales

CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES
4.1. Implementación de metodologías
4.2. Esquema de purificación

CAPÍTULO V. CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

LISTA DE CUADROS

Cuadro: Página:

1. Técnicas de separación de proteínas

2. Ventajas de las técnicas principales para la separación de proteínas

3. Preparación de estándares para la curva de calibración del ensayo de Bradford

4. Resultados del esquema de purificación

LISTA DE FIGURAS

1. Gel representativo del comportamiento de la bGH estándar frente a la cromatografía de intercambio aniónico

2. Gel representativo del comportamiento de la bGH comercial incubada con pPIC9 frente a la cromatografía de intercambio aniónico

3. Gel representativo del comportamiento de la bGH comercial frente a la cromatografía de interacciones hidrofóbicas

4. Gel representativo del comportamiento de la bGH estándar frente a la cromatografía de exclusión molecular

5. Cromatograma representativo de la bGH comercial estándar frente a las condiciones establecidas por Mukhopadhyay et al., 2002 para CLAR-FR

6. Cromatograma representativo de la reinyección del pico colectado a los 19 minutos de la separación de bGH comecial estándar frente a las condiciones establecidas por Mukhopadhyay et al., 2002 para CLAR-FR

7. Gel representativo del comportamiento de la muestra dializada del medio de fermentación de Pichia pastoris que expresa bGHr frente a la cromatografía de intercambio aniónico

8. Gel representativo de la cromatografía de interacciones hidrofóbicas de la muestra proveniente de la fracción 0M de intercambio aniónico

9. Gel representativo del comportamiento de la bGH recombinante proveniente de la cromatografía de hidrofobicidad frente a la cromatografía de exclusión molecular

10. Cromatograma representativo de la bGHr purificada frente a la cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa

11. Cromatograma representativo de la reinyección del pico colectado a los 19 minutos de la separación de la bGHr purificada frente a CLAR-FR

12. Gel de muestras procesadas en Western Blot

13. Western Blot de muestras representativas del proceso de purificación

NOMENCLATURA

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CAPÍTULO I. MARCO TEÓRICO

1.1. INTRODUCCIÓN

La introducción de la tecnología del ADN recombinante ha permitido la explotación industrial de proteínas con propiedades terapéuticas que permanecían limitadas para su comercialización. Gracias a esto, las proteínas recombinantes juegan un papel muy importante en la medicina moderna. Vacunas, anticuerpos, hormonas y agentes anticancerígenos son sólo algunos ejemplos de la gran variedad de proteínas recombinantes que se pueden obtener al emplear esta tecnología (Barrera-Saldaña, 1992).

A la par del uso de proteínas recombinantes, se ha favorecido el desarrollo de mejores métodos para su producción y purificación. Diversos microorganismos han sido desarrollados como las mejores opciones para expresar proteínas, destacando entre ellos la levadura metilotrófica Pichia pastoris, la cual cuenta con mecanismos de expresión condicionada de proteínas recombinantes y la capacidad para favorecer su secreción al medio de cultivo (Barrera-Saldaña y cols., 2004).

La presente investigación se enfoca en la purificación de la hormona de crecimiento bovina recombinante expresada por la levadura P. pastoris, empleando para esto técnicas cromatográficas que se basan en las características intrínsecas de la proteína de interés para lograr su acondicionamiento hacia el ambiente más adecuado para su posterior utilización en análisis especializados de bioactividad.

1.2. ANTECEDENTES

La purificación de una proteína es esencial para el estudio de sus propiedades e investigar sus aplicaciones en la medicina. Para esto, existen técnicas de separación que hacen uso de las propiedades fisicoquímicas propias de las moléculas, como las que se describen en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Técnicas de separación de proteínas.

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Tomado de: Ahmed, 2005.

Las técnicas de separación pueden ser combinadas para producir un esquema de purificación más eficiente al basarse en varias de las características de la proteína de interés. El Cuadro 2 muestra las ventajas de las principales técnicas cromatográficas empleadas en la purificación de proteínas y su conveniencia a través de las distintas fases de un esquema de purificación (Skoog y cols., 1995).

Cuadro 2. Ventajas de las técnicas principales para la separación de proteínas

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Tomado de: Amersham Biosciences, 2001

1.2.1. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO ANIÓNICO

La cromatografía de intercambio iónico empleada para la separación de biomoléculas fue introducida en 1960 y actualmente juega un papel muy importante en la separación y purificación de proteínas recombinantes (Vydac, 2000).

Esta cromatografía basa su principio de separación en la relación que existe entre la carga neta de las proteínas y el pH de la fase móvil, ya que esta relación es única para cada proteína. La interacción entre las moléculas cargadas y la matriz es controlada para favorecer la unión o elución de moléculas específicas y lograr así la separación de la molécula de interés (Skoog y cols., 1995).

La cromatografía de intercambio aniónico ha sido empleada como fase inicial en distintos esquemas para purificar hormonas de crecimiento y otras proteínas de interés médico e industrial. Olson y cols., (1981) fueron los primeros en reportar la purificación de GH humana recombinante (hGHr) producida por Escherichia coli. Para ello emplearon la cromatografía de intercambio aniónico débil (DEAE-Sepharose) como fase inicial en combinación de cinco pasos de separación, los cuales incluyen una lisis celular, seguida de una precipitación con sulfato de amonio, la cromatografía de intercambio aniónico débil, una cromatografía de intercambio catiónico débil (CM-Sepharose) y finalizando con una cromatografía de exclusión molecular (Sephacryl S-200), reportando con esto un 98% de pureza final sin anexar información de la recuperación o pureza obtenidos por cada técnica individual. En 2003, Ouyang y cols., emplearon como único paso de purificación la cromatografía de intercambio aniónico fuerte (Q-Sepharose) para purificar GH porcina recombinante expresada por Pichia pastoris previa precipitación con sulfato de amonio, recuperando cerca del 70% de la GH recombinante con una pureza relativa del 95%.

Zhang y cols., (2004) purificaron inulinasa de Aspergillus niger expresada en P. pastoris, la cual es una enzima degradadora de inulina con la cual se produce jarabe rico en fructosa. Ellos reportaron el empleo de la cromatografía de intercambio aniónico fuerte (HiTrapQ) como único paso cromatográfico obteniendo 11% de recuperación de la proteína con un 95% de pureza. Además reportaron que las proteínas de P. pastoris fueron eluidas a fuerzas iónicas mayores, destacando así el carácter aniónico de las proteínas del sistema de expresión en condiciones de pH neutro, concluyendo que esta característica puede ser empleada como estrategia principal para eliminar este tipo de proteínas contaminantes en la cromatografía de intercambio iónico.

Lo anterior fue comprobado por Chen y cols., (2004), quienes produjeron y purificaron fosfatasa alcalina de placenta humana en P. pastoris. Como purificación, emplearon una columna empacada con una matriz de intercambio aniónico débil (DEAE-Sepharose), con la cual obtuvieron cerca del 100% de recuperación y una pureza superior al 99%.

La cromatografía de intercambio aniónico en sus modalidades fuerte (resina denominada Q) y débil (resina denominada DEAE) ha sido empleada para purificar otras proteínas de interés llevando a porcentajes de pureza superiores al 95% cuando ha sido empleada como fase inicial del proceso de purificación. Entre esas proteínas se encuentran la ovalbumina de huevo (Ito y Matsudomi , 2005), la ovotransferrina (Mizutani y cols., 2004), penicilina G acilasa de Providencia rettgeri (Senerovic y cols., 2005), pepsinogeno porcina (Yoshimasu y cols., 2002), galactosa-b-1,3-glucorunosiltransferasa I (Lattard y cols., 2005), enzima fibrinolítica PM246 (Hu y cols., 2005) y la tanasa de Aspergillus oryzae (Zhong y cols., 2004).

1.2.2. CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIONES HIDROFÓBICAS

Como fase intermedia de purificación, la cromatografía de interacciones hidrofóbicas es una excelente herramienta para separar proteínas que presentan cierto carácter hidrofóbico. Esta cromatografía está basada en el principio establecido por Tiselius en 1948, donde menciona que las proteínas y otras sustancias que son precipitadas a altas concentraciones de sales neutras (proceso conocido como “Salting Out”) son adsorbidas fuertemente en adsorbentes, que en soluciones libres de sales no muestran afinidad por las proteínas y que a altas concentraciones se convierten en excelentes adsorbentes. (Skoog y cols., 1995).

En 1986, Lefort y Ferrara obtuvieron a partir de Escherichia coli una hGHr 100% pura aplicando la cromatografía de interacciones hidrofóbicas (Phenyl-Sepharose) como fase intermedia, en combinación con una cromatografía de intercambio aniónico débil como fase inicial (DEAE-Sepharose) y una de exclusión molecular como fase de pulido (Ultragel AcA44), reportando que el uso de la resina Phenyl-Sepharose llevó a un 28% de recuperación del producto final, siendo este el paso más ineficiente del proceso.

Este resultado fue comprobado por De Oliveira y cols. (1999) quienes reportaron la reducción de contaminantes provenientes de E. coli en un 99%, recuperando un 43% de hGHr planteando la utilización de una cromatografía de interacciones hidrofóbicas (Phenyl-Sepharose) como fase final en el esquema de purificación desarrollado por estos autores.

Hasta la fecha, la cromatografía de interacciones hidrofóbicas no ha sido empleada para purificar GH recombinantes expresadas en Pichia pastoris. Sin embargo, diversos autores han recurrido a esta cromatografía para purificar otras proteínas expresadas bajo este sistema. Damasceno y cols., (2004) purificaron a través de esta cromatografía un fragmento de anticuerpo humano, correspondiente al dominio variable de la cadena sencilla, para su uso en el tratamiento contra el cáncer de colon denominado A33scFv. Ellos emplearon la cromatografía de interacciones hidrofóbicas (Phenyl-Sepharose) como fase intermedia de purificación, con la cual obtuvieron un 25% de recuperación y 90% de pureza.

Gadkari y cols., (2003) expresaron y purificaron las hormonas gonadotropina coriónica y luteinizante humanas en Pichia pastoris para investigar su función en el proceso de la reproducción humana. Los autores reportan el empleo de la cromatografía de interacciones hidrofóbicas (Phenyl-Sepharose) como paso inicial seguido de una cromatografía de intercambio catiónico fuerte (SP-Sepharose), obteniendo como resultado una preparación enriquecida de ambas proteínas con una pureza superior al 95%.

Nuevas proteínas recombinantes han sido purificadas a través de la cromatografía de interacciones hidrofóbicas, aumentando hasta en un 90% de pureza cuando esta cromatografía ha sido empleada como fase inicial y/o intermedia del proceso de purificación. Entre las proteínas purificadas se encuentran la aglutinina de Galanthus nivalis (Baumgartner y cols., 2003), butolina (Weatherly y cols., 2002), cinamoil esterasa de Aspergillus niger (Juge y cols., 2001), enzima activadora de proteína C (Kunes y cols., 2002), lipasa B de Candida antartica (Rotticci-Mulder y cols., 2001), bilirrubina oxidasa de Myrothecium verrucaria (Kataoka y cols., 2005) y la equistatina (Outchkourov y cols., 2002), entre otras.

1.2.3. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

La cromatografía de exclusión molecular ha demostrado ser una herramienta eficaz para finalizar los esquemas de purificación (denominándose usualmente a esta fase de finalización como fase de pulido), permitiendo el acondicionamiento de la proteína de interés, bajo las condiciones más adecuadas para su uso final. Esta técnica basa sus principios de separación, en la diferencia en tamaño que presentan las macromoléculas y la migración diferencial que presentan a través de los poros de distintos tamaños de la resina (Skoog y cols., 1995).

Autores antes mencionados (Olson y cols., 1981; Lefort y Ferrara, 1986; de Oliveira y cols., 1999; Rotticci-Mulder y cols., 2001 y Kataoka y cols., 2005) han empleado esta cromatografía como fase de pulido en sus esquemas de purificación, consiguiendo con esto elevar sus porcentajes de purificación por arriba del 95%.

Por otra parte, Flodh y cols., (1986) reportaron que el uso de la cromatografía de exclusión molecular (Sephacryl S-200) logró aumentar la pureza de una preparación de hGHr expresada en Escherichia coli, obteniéndola a un grado superior al 99%.

Barbier y cols., (2004) emplearon una resina de exclusión molecular tipo Sepharose 4B (Amersham Biosciences) para purificar la enzima nitrato reductasa eucariótica expresada en P. pastoris, como paso posterior a una cromatografía de afinidad por metales inmovilizados. Este grupo de reportó una eficiencia de recuperación del 98%, con una pureza superior al 98%. De manera similar, Fierens y cols., (2004) usaron la cromatografía de exclusión molecular (Sephacryl S-100) como paso final en su esquema de purificación para obtener la proteína inhibidora de xilanasa I de Triticum aestivum, la cual es utilizada en la preparación de cereales y sus derivados. El empleo de esta cromatografía llevó a una pureza mayor al 95% con un rendimiento de recuperación cercano al 50%.

Existen otros ejemplos donde la cromatografía de exclusión molecular como fase de pulido, en el proceso de separación, ha logrado la purificación de proteínas recombinantes producidas por P. pastoris, elevando la pureza de las proteínas recombinantes hasta un 99%. Entre los esquemas de purificación que han reportado el uso de esta cromatografía están los desarrollados por Damaso y cols., (2003) que purificaron la xilanasa de Thermomyces lanuginosis; Ševo y cols., (2002) que lograron aislar penicilina G amidasa de Providencia rettgeri; Rolland y cols., (2001) que purificaron y caracterizaron un antígeno contra la proteína core del Hepatitis B; Paramasivam y cols., (2002) que purificaron lactoferrina de caballo; Bisht y cols., (2001) que produjeron y aislaron una proteína de la envoltura del virus del dengue tipo 2; Liu y cols., (2001) que aislaron al interferón a-1 humano y Chantasingh y cols., (2005) que prepararon y purificaron la xilanasa 10 de Aspegillus aerreus, entre otras.

1.2.4. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

La cromatografía líquida de alta resolución en su modalidad de fase reversa (CLAR-FR) es una herramienta ampliamente utilizada para evaluar la pureza final del producto purificado, con la cual se comparan los espectros y tiempos de retención del producto purificado contra el tiempo de retención del compuesto estándar comercial. Mukhopadhyay y cols., (2002) establecieron las condiciones de separación óptimas para aislar y confirmar la identidad de diversas GHs recombinantes producidas por E. coli. Actualmente, la identidad de las proteínas recombinantes expresadas en P. pastoris es evaluada mediante esta metodología, destacándose como ejemplos de estas proteínas recombinantes la citosina bloqueadora de crecimiento de Pseudaletia separata (Koganesawa y cols., 2002), pediocina PA-1 de Pediococcus acidilactici (Beaulieu y cols., 2005), alergen Ole 10 de polen de olivo (Barral y cols., 2005), endotoxina neutralizante (Paus y cols., 2002), glicoproteína D de Herpes Simple 1 y 2 (Kooij y cols., 2002), Monoamina oxidasa A humana (Li y cols., 2002) y el ligando Flt3 (Zhang y cols., 2005), entre otras.

1.3. JUSTIFICACIÓN

El propósito de la producción en masa de proteínas recombinantes es el de purificarlas para usarlas en el beneficio de la salud. Debido a que las hormonas de crecimiento tienen un particular interés para la industria farmacéutica y pecuaria, es necesario el desarrollo de un esquema de purificación que permita aislar estas proteínas.

Este trabajo surge de la necesidad de purificar la hormona de crecimiento bovina recombinante producida en el Laboratorio de Biotecnología del Departamento de Bioquímica por la levadura Pichia pastoris en un porcentaje superior al 95% .

1.4. HIPÓTESIS

La estrategia de purificación por Cromatografía de Intercambio Aniónico – Cromatografía de Interacciones Hidrofóbicas – Cromatografía de Exclusión Molecular es adecuada para establecer un porcentaje de pureza superior al 95% para la hormona de crecimiento bovina producida por Pichia pastoris.

CAPÍTULO II. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

Desarrollar un esquema de purificación para la hormona de crecimiento bovina producida en Pichia pastoris.

2.2. OBJETIVOS PARTICULARES

1. Evaluar la eficiencia de purificación de la técnica de cromatografía de intercambio aniónico como fase inicial del proceso de purificación.
2. Evaluar la eficiencia de purificación de la técnica de cromatografía de interacciones hidrofóbicas como fase intermedia del proceso de purificación.
3. Evaluar la eficiencia de purificación de la técnica de cromatografía de exclusión molecular como fase final del proceso de purificación.
4. Evaluar la pureza final de la hormona de crecimiento bovino por cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa.
5. Comprobar la identidad de la hormona de crecimiento bovino obtenida del esquema de purificación mediante Western Blot.

CAPÍTULO III. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1. ESQUEMA GENERAL DEL TRABAJO

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3.2. MATERIALES

3.2.1. EQUIPO

A continuación se presenta la lista del equipo que se empleó para la realización de este trabajo:

- Bomba peristáltica Dynamax® RP-1.

(Rainin Instrument Co., Emeryville, CA, EUA)

- Cámara de electroforesis Mini-PROTEAN® 3.

(Bio-Rad Laboratorios, Inc., Hercules, CA, EUA)

- Centrífuga 5415C.

(Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania)

- Espectrofotómetro Biophotometer.

(Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania)

- Fuente de poder BRL modelo 500.

(Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, EUA)

- Agitador mecánico Orbit modelo 3540.

(Barnstead International, Dubuque, IO, EUA)

- Incubadora de agitación oscilatoria R76.

(New Brunswick Scientific, Edison, NJ, EUA)

- Centrifugadora Beckman Allegra J2-M1.

(Beckman-Coulter, Inc., Fullert, CA, EUA)

- Campana de flujo laminar, Protector Laboratory Hood.

(Labconco Corp., Kansas City, MI, EUA)

- Cromatógrafo de líquidos de alta resolución: 600 Controller,

717 Autosampler, 996 Photodiode Array Detector.

(Waters Corp., Milford, MA, EUA)

- Termoagitador Cinarec 2 Thermolyne.

(Barnstead Internacional, Dubuque, IO, EUA)

3.2.2. MATERIAL

Dentro de los materiales utilizados, se encuentran:

- Columna Poly-Prep® de 9 cm.

(Bio-Rad Laboratorios, Inc., Hercules, CA, EUA)

- Columna Econo-Column® de 20 cm.

(Bio-Rad Laboratorios, Inc., Hercules, CA, EUA)

- Pipetas Research® modelos:

0.5-10mL, 2-20mL, 10-100mL, 100-1000mL

(Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania)

- Tubos de polipropileno para centrifugar con capacidad de 50 mL.

(Corning Incorporated, Acton, MA, EUA)

- Tubos de polipropileno para centrifugar con capacidad de 15 mL.

(Corning Incorporated, Acton, MA, EUA)

- Microtubos de polipropileno para centrifugar con capacidad de

0.6, 1.5, 2 mL.

(Cel Assosciates Inc., Pearland, TX, EUA)

- Pipetas serológicas de vidrio de 5 y 10 mL.

(Corning Incorporated, Acton, MA, EUA)

- Celdas de plástico para biofotómetro UVette® de 2 mL.

(Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania)

- Reservorios de vidrio Pyrex® de 1 L, 500 mL y 250 mL.

(Corning Incorporated, Acton, MA, EUA)

- Pizeta de plástico.

(Corning Incorporated, Acton, MA, EUA)

- Sistema de microfiltración de vidrio Fisherbrand®.

(Fisher Scientific, Pittsburg, PA, EUA)

- Matraces Erlen-Meyer Pyrex® de 250, 500 y 1000 mL.

(Corning Incorporated, Acton, MA, EUA)

- Asa bacteriológica.

(Fisher Scientific, Pittsburg, PA, EUA)

- Jeringas de plástico Plastipak de 3 y 10 mL.

(Becton Dickinson, Sparks, MD, EUA)

- Acrodiscos de 0.22 y 0.45 mm.

(Waters Corp., Milford, MA, EUA)

- Microfiltros Whatman de 0.22 y 0.45 mm.

(Waters Corp. Milford, MA, EUA)

- Membrana de diálisis con corte de 12 kDa

(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA)

- Membrana de nitrocelulosa para Western Blot

(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA)

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