Für die Aufrechterhaltung aller Lebensprozesse unseres Körpers wandelt jede Zelle kontinuierlich energiereiche Moleküle aus der Nahrung in chemisch speicherbare Energie um. Dazu braucht sie etwa 107 Sauerstoffmoleküle in der Sekunde.
Die Kenntnis des Sauerstoffverbrauchs lässt Rückschlüsse auf den physiologischen Zustand der Zellen zu. Ebenso hängt die Physiologie der Zelle von dem in der Umgebung vorhandenen Sauerstoff ab. Deshalb wird der Sauerstoffgehalt in Zellkulturen bisher mit aufwändigen Methoden oder Berechnungen bestimmt. Für die heute angewandte Lebendzellmikroskopie wäre es von großem Vorteil den Sauerstoff in der Zelle oder in ihrer unmittelbaren Umgebung kontinuierlich zu messen.
Es gibt bereits Messsysteme die mit phosphoreszierenden Farbstoffen eine sehr hohe räumliche und zeitliche Auflösung erreichen. Diese waren jedoch bislang nicht in Zellkultur einsetzbar. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit ein solches System für Lebendzellversuche adaptiert.
Dazu wurde eine Dampfsterilisation der Beads geprüft. Es wurden verschiedene Methoden zur definierten Aufnahme der Beads in die Probe und zur Kalibrierung des Systems getestet und verglichen.
In einem Kanal mit 30µl Volumen, in den metabolisierende Zellen eingesät wurden wird nach 24 Stunden eine zur Atmosphäre außerhalb des Objektträgers deutlich verringerte Sauerstoffkonzentration festgestellt. Die zeitabhängige Messung über 70 Stunden und etwa 12 Messpunkten auf 12mm Kanallänge zeigt einen schwachen lokalen Gradienten und eine starke Zeitabhängigkeit.
Um die Korrelation der Zeitabhängigkeit mit der Zelldichte zu erforschen wurde die Sauerstoffkonzentration in Töpfchen mit 300µl Fassungsvolumen und drei verschiedenen Zelldichten 81 Stunden lang verfolgt. Der Verlauf der Sauerstoffkurve verändert sich charakteristisch mit der Zellkonzentration. Das ist ein klarer Hinweis auf ein Nachlassen der metabolischen Aktivität der Zellen bei Erreichen eines konfluenten Zellrasens.
Damit wurde erstmals ein System etabliert mit dem kontinuierlich Sauerstoff in Lebendzellversuchen protokolliert und quantitativ bestimmt werden kann.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1. Sauerstofftransport und Physiologie der Zelle
1.2. Diffusion
1.3. Grundlagen zur Sauerstoffmessung
2. Material und allgemeine Methoden
2.1. Messprinzip OPAL
2.2. Materiallisten
2.3. Aufbau technisches Equipment
2.4. Bedienung OPAL und Software
2.5. Zellkultur
3. Experimente
3.1. Zuverlässigkeit dampfsterilisierter Beads
3.1.1. Versuchsdurchführung und Auswertung
3.1.2. Ergebnisse
3.1.3. Diskussion
3.2. Temperaturfaktoren
3.2.1. Versuchsdurchführung und Auswertung
3.2.2. Ergebnisse
3.2.3. Diskussion
3.3. Fehler durch Temperaturgradienten
3.3.1. Versuchsdurchführung und Auswertung
3.3.2. Ergebnisse
3.3.3. Diskussion
3.4. Entwicklung eines Protokolls zur Kalibrierung
3.4.1. Relevante Faktoren für eine Kalibrierung
3.4.2. Mögliche Durchführungsweisen
3.5. Beadhandhabung
3.6. Sauerstoffgehalt in Kanalslides mit Zellen
3.6.1.Versuchsdurchführung und Auswertung
3.6.2. Ergebnisse
3.6.3. Diskussion
3.7. Zellinduzierter Sauerstoffgradient im Kanal
3.7.1. Versuchsdurchführung und Auswertung
3.7.1.1. Betrachtung des Fehlers durch Verdunstung
3.7.1.2. Auswertung
3.7.2. Ergebnisse
3.7.3. Diskussion
3.8. Vertikaler Sauerstoffgradient im Töpfchen
3.8.1. Versuchsdurchführung und Auswertung
3.8.1.1.Betrachtung der Fehler
3.8.1.2.Auswertung
3.8.2. Ergebnisse
3.8.3. Diskussion
4. Abschätzung des Sauerstoffkonsums pro Zelle
4.1.Modell und Gleichungen
4.2.Ergebnis
4.3.Diskussion
5. Fazit
6. Referenzen
Zielsetzung & Themen
Die Arbeit zielt darauf ab, ein System zur optischen, kontinuierlichen Sauerstoffmessung in in vitro Zellkulturen zu etablieren und zu validieren. Es soll die Machbarkeit untersucht werden, mithilfe phosphoreszierender Beads diffusionslimitierte Sauerstoffkonzentrationen in lebenden Zellkulturen orts- und zeitaufgelöst zu bestimmen, um den metabolischen Zustand von Zellen unter verschiedenen Umgebungsbedingungen präzise zu erfassen.
- Adaption phosphoreszierender Sensorsysteme für Langzeit-Zellkulturversuche
- Einfluss der Sterilisationsmethoden auf die Sensorbeads
- Einfluss von Zellatmung und Geometrie auf Sauerstoffgradienten in Kulturgefäßen
- Abschätzung des zellulären Sauerstoffverbrauchs mittels Diffusionsmodellen
Auszug aus dem Buch
1. Einleitung
In vivo Studien sind sich darin einig, dass die Sauerstoffkonzentration im Gewebe zwischen 5 und 50 mmHg (0.67 und 6.7 kPa) liegen (Wion, 2009; Tsai, 2010). Das ist mehr als eine Größenordnung geringer als der Partialdruck von Sauerstoff in der Atmosphäre (160 mmHg oder 21 kPa). Schon 1976 untersuchte Balin die Auswirkung von Sauerstoff auf Wachstum und Zellmetabolismus von WI-38 Zellen. Er beobachtete die kürzeste Proliferationszeit bei 44 mmHg (5.9 kPa). Lange schon ist bekannt, dass zu viel Sauerstoff sogar toxisch auf Zellen wirkt (Balin, 1978 und 2002; Haugaard, 1968). Zudem wird diskutiert ob Sauerstoffmangel in Tumoren die Metastasenbildung fördert (Chaudary, 2007). Neuronale Stammzellen bilden in einer Umgebung mit 15.2 bis 38 mmHg (2 bis 5 kPa) Neurosphäre statt TH-positive Neuronen (Zhang, 2011). In Hypoxieversuchen wäre eine Auflösung im Bereich unter 0.1 bis 1 kPa gefragt (Ebbesen, 2004).
Dies macht deutlich, dass es für die physiologische Relevanz von in vitro Zellversuchen existentiell wichtig ist, die Sauerstoffkonzentration exakt zu kontrollieren. Auf Grund von mangelnden geeigneten Methoden wird dies oftmals ganz unterlassen (Toussaint, 2011). Häufig wird auch der Sauerstoff außerhalb der Probe kontrolliert und angenommen, dass in der Probe die gleichen Bedingungen herrschen. Dies ist aber falsch, wie auch in Kapitel 3.6 dieser Arbeit gezeigt werden kann. Zellen sind Sauerstoffverbraucher, was dazu führt das die Geometrie und die Materialeigenschaften die Nachdiffusion von Sauerstoff und somit die Konzentration in der Probe bestimmen.
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Beschreibt die physiologische Bedeutung der Sauerstoffkonzentration für Zellen und die Limitationen gängiger Messmethoden.
2. Material und allgemeine Methoden: Erläutert das Messprinzip auf Basis von Phosphoreszenz-löschung, das verwendete Equipment sowie die Kultivierung der Rat-1 Zellen.
3. Experimente: Dokumentiert die Validierung der dampfsterilisierten Beads, die Bestimmung von Temperaturfaktoren und die Durchführung verschiedener Langzeitmessungen von Sauerstoffgradienten in Zellkulturen.
4. Abschätzung des Sauerstoffkonsums pro Zelle: Nutzt die experimentellen Daten, um mittels Diffusionsmodell den metabolischen Sauerstoffverbrauch der Zellen pro Zeiteinheit quantitativ abzuschätzen.
5. Fazit: Fasst die Eignung des Messsystems zusammen und diskutiert notwendige Optimierungen für zukünftige Zellkulturexperimente.
6. Referenzen: Listet die für die Arbeit verwendete wissenschaftliche Literatur auf.
Schlüsselwörter
Sauerstoffmessung, Zellkultur, Phosphoreszenzlöschung, Diffusionsgradienten, Zellmetabolismus, Mikroskopie, in vitro, Mikro-Beads, Rat-1 Zellen, Sauerstoffpartialdruck, Biologie, Physiologie, Sensorik, Langzeitexperimente
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in der Arbeit grundlegend?
Die Arbeit beschäftigt sich mit der Etablierung einer optischen Methode zur Messung von Sauerstoffkonzentrationen in Zellkulturen, um die Sauerstoffversorgung von Zellen unter experimentellen Bedingungen direkt beobachten zu können.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Die Arbeit verknüpft Zellbiologie mit physikalischen Messmethoden, insbesondere der Fluoreszenz-/Phosphoreszenz-Sensorik, und befasst sich mit Stofftransportprozessen wie der Diffusion.
Was ist das primäre Ziel der Arbeit?
Das Ziel ist die Anpassung und Validierung eines Systems auf Basis phosphoreszierender Beads für in vitro Zellkulturstudien, um diffusionslimitierte Sauerstoffkonzentrationen präzise zu messen.
Welche wissenschaftliche Methode wird verwendet?
Es wird die Methode der Phosphoreszenzlöschung (quenching) eingesetzt, bei der die Abklingzeit von Sensorfarbstoffen in Abhängigkeit von der Sauerstoffkonzentration gemessen wird.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Im Hauptteil werden methodische Tests zur Sterilisation und Kalibrierung der Sensoren sowie diverse Experimente zu Sauerstoffgradienten in verschiedenen Kulturgefäßen mit unterschiedlichen Zellkonzentrationen durchgeführt.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Zellkultur, Sauerstoffmessung, Phosphoreszenz, Diffusion, Metabolismus, in vitro, Sensorik.
Warum ist das Verfahren der Dampfsterilisation im Autoklav für die Beads kritisch?
Das Autoklavieren ist eine Standardmethode zur Sterilisation, es besteht jedoch das Risiko, dass die thermische Belastung die Sensoreigenschaften der Beads (wie die Lichtintensität oder die Sensitivität gegenüber Sauerstoff) verändert, was eine Neukalibrierung erforderlich macht.
Wie beeinflusst die Zellkonzentration den gemessenen Sauerstoffgehalt?
Höhere Zellkonzentrationen führen zu einem schnelleren und stärkeren Abfall der Sauerstoffkonzentration in der Umgebung, da die Zellen aktiv Sauerstoff für ihre Lebensprozesse verbrauchen.
Was zeigt der Vergleich zwischen den verschiedenen Gefäßgeometrien?
Unterschiedliche Geometrien wie Kanalslides oder Töpfe beeinflussen die Sauerstoffdiffusion und damit die räumliche und zeitliche Verteilung des Sauerstoffs, was direkte Auswirkungen auf die Bedingungen hat, unter denen die Zellen wachsen.
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- Lena Friedmann (Author), 2015, Optische Sauerstoffmessung in der in vitro Zellkultur zur Bestimmung der orts- und zeitaufgelösten, diffusionslimitierten Sauerstoffkonzentrationen, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/302331
