Die Bedeutung von Exorphinen für die Humanernährung

Inhalt

Zusammenfassung

Abbildungsverzeichnis

Tabellenverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

1. Einleitung

2. Grundlagen: Das Opioid-System im menschlichen Körper
2.1. Opiatrezeptoren
2.2. Endogene Liganden der Opiatrezeptoren
2.2.1. Bedeutung der Affinität des Liganden zum Rezeptor bei der Wirkungsvermittlung
2.2.2. Agonisten, Antagonisten
2.3. Funktionen und Wirkspektrum des opioidergen Systems
2.4. Exogene Liganden der Opiatrezeptoren

3. Bioaktive Nahrungspeptide als Supplemente des endogenen opioiden Systems
3.1. Identifikation von Nahrungspeptiden mit opioider Aktivität
3.1.1. Adenylatcyclase-Test
3.1.2. Mouse Vas Deferens (MVD)- & Guinea Pig Ileum (GPI)-Bioassays
3.1.3. Kompetitive Bindungs-Assays
3.2. Vorkommen: Exorphinhaltige Lebensmittel

4. Charakterisierung der Exorphine (Struktur & Eigenschaften)
4.1. Opioide Peptide aus Pflanzenproteinen
4.1.1. Gluten Exorphine
4.1.1.1. Gluten Exorphine A
4.1.1.2. Gluten Exorphin B5
4.1.1.3. Gluten Exorphin C
4.1.2. Gliadorphine
4.1.3. Rubiscoline
4.1.4. Sojamorphine
4.2. Opioide Peptide aus Lebensmitteln tierischen Ursprungs
4.2.1. Exorphine aus Milch und Milchprodukten
4.2.1.1. ß-Casomorphine (BCM)
4.2.1.2. weitere Casein Exorphine (Casoxine)
4.2.1.3. Lactoferroxine
4.2.1.4. Exorphine aus Molkenproteinen (Lactorphine)
4.2.2. Hämorphine

5. Bedeutung von Exorphinen für die Humanernährung
5.1. Voraussetzungen für die Wirksamkeit
5.1.1. Freisetzung und Aufnahme im GI-Trakt
5.1.2. Aufnahme und Transport über den Blutstrom
5.1.3. Interaktion mit Opiatrezeptoren
5.2. Bioverfügbarkeit der Exorphine
5.2.1. Lebensmittelverarbeitung und die Auswirkungen auf die Exorphinfreisetzung
5.3. Wirkung von opioiden Peptiden
5.3.1. Effekte auf den Gastrointestinaltrakt
5.3.2. Postprandialer Metabolismus
5.3.3. Wirkung auf das zentrale Nervensystem (ZNS)
5.3.3.1. Nahrungsaufnahme
5.3.3.2. Lernen & Gedächtnis
5.3.3.3. Angstlindernde Wirkung
5.3.3.4. Analgetische / antinociceptive Wirkung
5.3.4. Wirkung von Exorphinen bei Neugeborenen
5.3.5. Mit Exorphinen assoziierte Krankheiten

6. Schlussfolgerung

Literaturverzeichnis

Zusammenfassung

Die vorliegende Arbeit geht der Frage nach der Bedeutung von Exorphinen für die Humanernährung nach. Exorphine sind bioaktive Nahrungspeptide mit Opiatwirkung. Sie finden sich vor allem als Bestandteil von Milchproteinen wie Casein, α-Lactalbumin und β- Lactoglobulin, sowie in Hämoglobin und pflanzlichen Proteinen wie Gluten, Gliadin, Sojaprotein und Spinat-Rubisco. Aus diesen Vorläufermolekülen werden die Exorphine während der Verdauung freigesetzt. Trotz der heterogenen Struktur sind sie in der Lage als exogene Liganden mit den endogenen Opiatrezeptoren zu interagieren. In vitro und in vivo Studien deuten auf diverse physiologische Effekte hin. Dabei sind vor allem durchfallhemmende Eigenschaften der Exorphine und lokale Wirkungen im Gastrointestinaltrakt zu nennen. Bei Säuglingen scheinen auch weitere systemische Effekte möglich zu sein. Eine Beteiligung von Exorphinen an der Entstehung von Krankheiten wird diskutiert, kann aber nicht bewiesen werden. Über die genauen Wirkmechanismen, sowie pharmakokinetische Parameter (wirksame Dosis, Bioverfügbarkeit), ist noch wenig bekannt. Daher besteht weiterer Forschungsbedarf, um den Einfluss von opioiden Peptiden aus der Nahrung auf den Menschen umfassend zu beurteilen.

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Hemmung der Erregungsübertragung (prä- und postsynaptisch) und reduzierte Neurotransmitterfreisetzung durch Aktivierung der Opioidrezeptoren 3

Abb. 2: Bildung der endogenen Opioidpeptide durch proteolytische Spaltung aus Vorläuferproteinen 4

Abb. 3: Das endogene opioiderge System des Menschen wird durch opioide Peptide aus Nahrungsprotein ergänzt 8

Abb. 4: Gluten Exorphin A5 (Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr) 13

Abb. 5: Gluten Exorphin B5 (Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu) 13

Abb. 6: Gluten Exorphin C (Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu) 14

Abb. 7: Rinder ß-Casomorphin-7 (Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile) 17

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Übersicht: Opiatrezeptoren, endogene Liganden und Wirkspektrum 7

Tab. 2: Untersuchung von Nahrungsproteinen nach Peptiden mit opioider Aktivität 10

Tab. 3: Übersicht Exorphine 20

Tab. 4: Maximale theoretische Ausbeute an verschiedenen Exorphinen aus Kuhmilch pro Gramm Vorläuferprotein 24

Tab. 5: Exorphingehalt pro 100 g Käse 25

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1. Einleitung

Das aus dem Schlafmohn gewonnene Opium wird bereits seit über 5000 Jahren wegen seiner schmerzstillenden und schlaffördernden Wirkung geschätzt. Dem deutschen Apotheker und Chemiker Friedrich Sertürner gelang Anfang des 18. Jahrhunderts die Isolation des Hauptwirkstoffs des Opiums, dem Morphin. Dies wird seither in der Medizin zur Schmerztherapie verwendet. Durch das hohe Suchtpotential und wegen der Verwendung als Rauschmittel gerieten Opiate jedoch immer mehr in Verruf (Hamilton & Baskett, 2000; Norn et al., 2005).

Weniger bekannt ist hingegen die Tatsache, dass Stoffe mit einem ähnlichen Wirkpotential Bestandteil der täglichen Ernährung sind. Diese opioiden Nahrungspeptide, sogenannte Exorphine, finden sich unter anderem in (Mutter-) Milch und Weizen, sowie in einigen weiteren Lebensmitteln pflanzlichen und tierischen Ursprungs. Dort sind sie in inaktivem Zustand in die Sequenz von Nahrungsproteinen wie Casein und Gluten integriert und werden erst nach dem Verzehr, während der Verdauung freigesetzt.

Wie bei allen bioaktiven Peptiden ist die Struktur, bzw. die jeweilige Aminosäuresequenz ein entscheidendes Kriterium für die Biofunktionalität. Trotz struktureller Unterschiede zu Morphin oder endogenen Opiaten sind auch einige exogene Nahrungspeptide in der Lage mit dem Opioidrezeptorsystem des Menschen zu interagieren und somit Opiatwirkungen auszulösen.

Nicht nur im Hinblick auf das wachsende Interesse an funktionellen Lebensmitteln stehen bioaktive Nahrungspeptide immer mehr im Fokus der wissenschaftlichen Forschung, sondern auch im Sinne der Biofunktionalität von natürlichen Nahrungsmitteln und deren Inhaltsstoffen. Dies bezieht sich auf pharmakologisch wirksame Strukturen von Lebensmittelinhaltsstoffen, die über den eigentlichen Nährwert hinaus weitere physiologische Eigenschaften besitzen und dadurch zur Verbesserung oder Verschlechterung der Körperfunktionen beitragen können. Zum Wirkspektrum der bioaktiven Nahrungspeptide gehört ein Einfluss auf den Gastrointestinaltrakt (Beeinflussung der Magensekretion und der Verdauung), die Immunabwehr des Körpers (immunmodulatorisch), das Herz-Kreislauf-System (blutdrucksenkend / ACE-inhibitorisch) sowie das Nervensystem (Korhonen & Pihlanto, 2006; Lavecchia et al., 2013).

Einige dieser Effekte werden durch Interaktion mit dem Opioidsystem vermittelt.

Diese Wirkungen werden, v.a. in Hinblick auf die natürlich in Muttermilch vorkommenden Exorphine und deren Einfluss auf den Säugling beim Stillen, mit einem positiven und gesundheitsfördernden Nutzen assoziiert. Andererseits werden opioide Nahrungspeptide aber auch mit Krankheiten und Unverträglichkeiten in Verbindung gebracht (potentiell involviert in Autismus und Schizophrenie).

Da in der westlichen Gesellschaft Weizen- und Milchprodukte zu den Grundnahrungsmitteln gehören und durch den hohen Verzehr dieser Lebensmittel auch große Mengen an Exorphinen aufgenommen werden, widmet sich die vorliegende Arbeit der Bedeutung von Exorphinen für die Humanernährung.

2. Grundlagen: Das Opioid-System im menschlichen Körper

Um die Funktion der Exorphine als opioide Peptide zu verstehen, ist es zuerst einmal wichtig ihren Wirkort zu betrachten: Das endogene Opioidsystem des Menschen, bestehend aus Opiatrezeptoren und deren Liganden.

2.1. Opiatrezeptoren

Der Nachweis von opioiden Bindungsstellen im Gehirn von Säugetieren gelang erstmals im Jahr 1973 mittels Radioliganden (Pert & Snyder, 1973; Simon et al., 1973; Terenius, 1973). Heute sind drei verschiedene Opioidrezeptortypen bekannt: µ-, δ- und κ-Opiatrezeptoren, die zusätzlich in Subtypen (µ1/µ2, δ1/δ2 und κ1/κ2) unterteilt werden können. Sie alle gehören zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die mit sieben Transmembrandomänen in die Plasmamembran integriert sind. Der N-Terminus auf extrazellulärer Seite ist an der Ligandenbindung beteiligt und der ins Zellinnere gerichtete C-Terminus ist für die Signaltransduktion verantwortlich. Ihre Aktivierung bewirkt eine Hemmung der Adenylatzyclase (Gi), wodurch es zu einer Verringerung des cAMP-Spiegels kommt. Des Weiteren werden präsynaptische, spannungsabhängige Calciumkanäle geschlossen (G0), was zu einem verminderten Calciumionen-Einstrom und reduzierter Neurotransmitter- Freisetzung führt. Durch Öffnung von Kalium-Kanälen (Gi/0) kommt es zu einer Hyperpolarisation und einer postsynaptischen Hemmung der Erregbarkeit (Abb. 1) (Friderichs & Straßburger, 2002; Satoh & Minami, 1995).

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Abb. 1: Hemmung der Erregungsübertragung (prä- und postsynaptisch) und reduzierte Neurotransmitterfreisetzung durch Aktivierung der Opioidrezeptoren (Friderichs & Straßb urger, 2002)

Opioidrezeptoren finden sich sowohl im ZNS als auch im peripheren Nervensystem, dort z.B. an vegetativen Nervenfasern der glatten Muskulatur. Vor allem das limbische System, der Thalamus und Hypothalamus, die Medulla Oblongata und das Hinterhorn des Rückenmarks weisen eine hohe Dichte an Opiatrezeptoren auf (Estler & Schmidt, 2007; Freye, 1999). Der µ-Rezeptor ist im Gehirn am weitesten verbreitet. Vor allem im Neocortex und im Thalamus. Man findet diesen Rezeptortyp jedoch auch im Hinterhorn des Rückenmarks und im peripheren Nervensystem z.B. an myenterischen Neuronen des Verdauungstrakts. δ- Rezeptoren finden sich hauptsächlich im zentralen Nervensystem, im Neocortex, Putamen und im olfaktorischen Bereich. Rezeptoren des κ-Typs weisen die dichteste Konzentration im Bereich des Cortex auf (Dhawan et al., 1996).

2.2. Endogene Liganden der Opiatrezeptoren

Seit der Entdeckung der Opiatrezeptoren wurde auch nach deren endogenen Liganden geforscht. So wurden Mitte der 1970er Jahre Enkephaline, Endorphine und Dynorphine als endogene opioide Peptide identifiziert. Sie werden durch proteolytische Spaltung aus drei verschiedenen Vorläufermolekülen gebildet: Proenkephalin, Proopiomelanocortin und Prodynorphin (Abb. 2) (Jordan et al., 2000).

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Abb. 2: Bildung der endogenen Opioidpeptide durch proteolytische Spaltung aus Vorläuferproteinen (Lüllmann et al., 2006)

Die Freisetzung der beiden Enkephalin-Pentapeptide, Met-Enkephalin (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met) und Leu-Enkephalin (Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu), die sich nur in der C-terminalen Aminosäure unterscheiden, sowie längeren Fragmenten, die die Enkephalin-Sequenz (Tyr-Gly-Gly-Phe) beinhalten, erfolgt aus Proenkephalin. Die Bildung der Endorphine erfolgt durch limitierte Proteolyse aus Proopiomelanocortin (POMC) bzw. dessen Teilsequenz, dem β-Lipotropin. Aus POMC können neben ß-Endorphin auch weitere regulatorische Peptide, wie das melanozytenstimulierende Hormon (MSH) oder das adrenokortikotrope Hormon (ACTH) abgespalten werden. Aus Prodynorphin werden die Dynorphine freigesetzt, sowie weitere Moleküle die N-terminal die Leu-Enkephalin-Sequenz aufweisen.

Ähnlich den Opiatrezeptoren finden sich die endogenen Opioide bzw. deren Vorläufermoleküle hauptsächlich im zentralen und peripheren Nervensystem, wo sie unter anderem als Neuropeptide fungieren (Aktories & Forth, 2013).

Als strukturelle Gemeinsamkeit dieser endogenen Opioide ist die einheitliche Aminosäuresequenz Tyr-Gly-Gly-Phe am N-Terminus zu nennen, welche als Schlüsselsequenz für die Interaktion mit den Opiatrezeptoren gilt. Die verschiedenen Opioide unterscheiden sich in ihrer Affinität zu den jeweiligen Rezeptoren. Jedoch ist die Bindungsaffinität der Opiatpeptide nicht selektiv, sondern viele binden überlappend an mehrere Rezeptor-Subtypen. Enkephaline binden bevorzugt an δ-Rezeptoren und Dynorphin an Rezeptoren des κ-Typs. ß-Endorphine haben etwa die gleiche Affinität für µ- wie δ- Rezeptoren. Obwohl alle Opioidpeptide auch mit dem µ-Rezeptor interagieren können, ist ihre Selektivität und Wirksamkeit bei diesem Rezeptortyp eher gering. Als hoch selektive endogene Liganden für den µ-Rezeptor gelten dagegen die erst 1997 entdeckten Endomorphine (Mizoguch et al., 2013).

2.2.1. Bedeutung der Affinität des Liganden zum Rezeptor bei der Wirkungsvermittlung

Die Affinität des Opioids zum Rezeptor ist entscheidend für dessen Wirkstärke und maßgeblich zur Bestimmung der pharmakologisch wirksamen Dosis. Wie stark die Affinität eines Liganden ist, hängt von Form und Molekülgröße sowie der sterischen Konfiguration der Atome des Moleküls ab. Je besser die räumliche Struktur des Liganden zum Rezeptor passt, desto höher ist die Bindungsbereitschaft und somit die Wirkstärke ('Schlüssel-Schloss-Prinzip'). Nach der Bindung führen die Wechselwirkungen zwischen Ligand und Rezeptor zu einer Konformationsänderung des Rezeptors in den funktionellen Zustand. Die Wirkungsqualität, also die Stärke des ausgelösten Effekts, hängt von dieser intrinsischen Aktivität des Liganden ab (Freye, E., 1999).

2.2.2. Agonisten, Antagonisten

Die Opioide unterscheiden sich nicht nur in ihrer Affinität für die jeweiligen Rezeptortypen, sondern auch hinsichtlich der intrinsischen Aktivität. Daher lassen sich die Bindungspartner der Opiatrezeptoren in reine Agonisten, Agonist-Antagonisten bzw. partielle Antagonisten und Antagonisten unterscheiden. Die Agonisten sind die aktivierenden Liganden der Opiatrezeptoren. Dazu zählt neben den endogenen Opioiden vor allem das Morphin. Ein Beispiel für einen reinen Antagonisten ist Naloxon (Lüllmann et al., 2006). Antagonisten weisen meist eine hohe Rezeptoraffinität auf, besitzen aber nur eine schwache bis keine intrinsische Aktivität. Dadurch kommt es zwar zur Bindung an den Rezeptor, jedoch nicht zu dessen Aktivierung. Somit lösen reine Antagonisten keine Opiatwirkung aus, sondern fungieren als Hemmstoff. Antagonisten sind aufgrund der höheren Affinität in der Lage Agonisten vom Rezeptor zu verdrängen (kompetitive Verdrängung). So hat Naloxon beispielsweise eine höhere Affinität als Morphin, aber eine wesentlich geringere intrinsische Affinität. Gemischte Agonist-Antagonisten können auch einen vorhandenen Agonisten von seiner Bindungsstelle verdrängen und so wie Antagonisten wirken. Bei alleiniger Gabe wirken sie hingegen wie reine Agonisten (Freye, E., 1999).

2.3. Funktionen und Wirkspektrum des opioidergen Systems

So wie die Opiatrezeptoren und deren endogene Liganden an vielen verschiedenen Stellen im menschlichen Organismus verteilt sind, so vielfältig ist auch ihr Wirkspektrum. δ -Rezeptoren spielen unter anderem eine Rolle bei der Aufhebung bzw. Unterdrückung der Schmerzempfindung, gastrointestinaler Motilität, kognitiven Funktionen, Regulation der Atmung, sowie stimmungsabhängigem Verhalten (Dhawan et al., 1996). Bei Versuchen an Ratten verursachten selektive δ-Agonisten und endogene Enkephaline eine gesteigerte Bewegungsaktivität und antidepressive Effekte (Baamonde et al., 1992). Auch die Immunfunktion kann durch δ-affine Liganden beeinflusst werden, da einige Immunzellen δ- Rezeptoren exprimieren (Carr et al., 1988). Die antinociceptive Wirkung wird durch δ- Rezeptoren vermittelt, die im Rückenmark lokalisiert sind (Heyman et al., 1987; Porreca et al., 1984). Eine Atemdepression kann durch δ-Rezeptoraktivierung zustande kommen, da die Atemfrequenz verringert und die Sauerstoffaufnahme gesenkt wird (Schaeffer & Haddad, 1985). Ein weiterer Effekt ist die Inhibition des gastrointestinalen Transits durch selektive δ- Agonisten (Porreca & Burks, 1983; Porreca et al., 1984). Es ist interessant zu erwähnen, dass die Wirkstärke von δ-Agonisten während entzündlichen Diarrhöen erhöht ist, was vermutlich auf sensibilisierte Rezeptoren in den entzündeten Geweben zurückzuführen ist (Pol et al., 1994).

ĸ-Rezeptoren sind an der Regulation verschiedenster Körperfunktionen beteiligt. Dazu zählen unter anderem Schmerzwahrnehmung, gesteigerte Diurese, Ernährungsverhalten und neuroendokrine Funktionen (Dhawan et al., 1996). Liganden mit einer Affinität für diesen Rezeptortyp haben häufig eine sedierende Wirkung und verursachen Dysphorie (Pfeiffer et al., 1986). Da Areale wie das limbische System, das für Lernen, Emotionen und Verhalten zuständig ist, nur eine geringe Konzentration an ĸ-Rezeptoren aufweisen, ist das Sucht- und Abhängigkeitspotential bei ĸ-affinen Liganden sehr gering (Freye, E., 1999).

Unter den hochselektiven μ-Rezeptor Agonisten finden sich potente antinozizeptive Substanzen (z.B. Morphin), was nahelegt, dass μ-Rezeptoren eine wichtige Rolle in der Regulation der Schmerzwahrnehmung spielen (Freye, E., 1999).

μ-Opioidrezeptoren sind auch an einer Vielzahl weiterer physiologischer Funktionen beteiligt. Dazu zählen unter anderem kardiovaskuläre Funktionen, Nahrungsaufnahme und Darmpassage, Respiration, Lern- und Gedächtnisleistung, Bewegungsaktivität, Thermoregulation, Hormonsekretion und Immunfunktion. Bis auf die Hormonsekretion werden die weiteren genannten Körperfunktionen durch eine Aktivierung des μ-Rezeptors abgeschwächt (Dhawan et al., 1996).

Für alle genannten Rezeptoren gilt, dass die beschriebenen Wirkungen durch Bindung eines reinen Antagonisten, wie z.B. Naloxon aufgehoben werden.

Tab. 1: Übersicht: Opiatrezeptoren, endogene Liganden und Wirkspektrum (modifiziert nach Spektrum Online, 2000)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die unterschiedliche Verteilung der Rezeptorpopulationen in den verschiedenen Körperkompartimenten, die vielfältigen Funktionen, sowie teilweise ungeklärte Interaktions - und Wirkmechanismen der verschiedenen agonistischen wie antagonistischen Liganden an z.T. mehreren Rezeptortypen erschweren genaue Aussagen über die funktionelle Bedeutung. Außerdem gibt es Hinweise auf speziesspezifische Unterschiede in der Anzahl und Verteilung der einzelnen Rezeptortypen und -populationen, sowie geringe Abweichungen in den Ligandenbindungskapazitäten (Maurer, 1982; Robson et al, 1985). Dadurch ist es schwierig, Ergebnisse aus Tierstudien untereinander zu vergleichen und Rückschlüsse auf die Bedeutung für den Menschen zu ziehen.

2.4. Exogene Liganden der Opiatrezeptoren

Opiatrezeptoren können sowohl mit endogenen als auch exogenen Opioid-Agonisten, wie Antagonisten interagieren. Dabei können die Strukturen der exogenen Liganden sehr unterschiedlich sein. Zum einen finden sich unter den exogenen Liganden Alkaloide, wobei hier das Morphin als berühmtester Vertreter zu nennen ist (Freye, E., 1999). Zum anderen gibt es Opiatliganden mit Peptidstruktur, die nach H. Teschmacher wiederum in 'typische', wie 'atypische' Peptide unterteilt werden können. Die Struktur der 'typischen' opioiden Peptide ist vergleichbar mit der der endogenen Opiate. Sie alle weisen die N- terminale Aminosäuresequenz Tyr-Gly-Gly-Phe auf, die auch bei den endogenen Enkephalinen zu finden ist (vgl. Kapitel 2.2). 'Atypische' Opioide Peptide hingegen weisenunterschiedliche Aminosäuresequenzen am N-Terminus auf. Jedoch findet sich dort immer ein Tyrosin-Rest, zum Teil noch gefolgt von anderen Aminosäuren (Teschemacher, 1993). Diese 'atypischen' opioiden Peptide werden aus einer Reihe von Vorläuferproteinen freigesetzt, unter anderem aus Nahrungsprotein (Teschemacher et al., 1997).

3. Bioaktive Nahrungspeptide als Supplemente des endogenen opioiden Systems

Nicht nur exogene Opiate wie Morphin, sondern auch opioide Peptide aus Nahrungsprotein sind Supplemente des endogenen opioidergen Systems des Menschen. Aufgrund ihres exogenen Ursprungs und der morphinartigen Aktivität wurde die Bezeichnung 'Exorphine' für diese opioiden Nahrungspeptide eingeführt (Zioudrou et al., 1979).

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Abb. 3: Das endogene opioiderge System des Menschen wird durch opioide Peptide aus Nahrungsprotein ergänzt (modifiziert nach Teschemacher, 2003)

Die Isolation opioider Peptide aus Nahrungsproteinen beschreiben erstmals Ziourdou et al. 1979. Sie untersuchten Pepsin-Hydrolysate von Weizengluten und α-Casein. Exorphine werden, ähnlich wie die endogenen Opioide, aus Vorläuferproteinen (Gluten, Casein usw.), die selbst keine Opiatwirkung besitzen, freigesetzt.

Strukturell unterscheiden sich Exorphine von den typischen endogenen opioiden Peptiden dahingehend, dass sie keine Enkephalin-Sequenz (Tyr-Gly-Gly-Phe; siehe Kapitel 2.2) aufweisen. Aufgrund ähnlicher Aminosäuremuster in der Primärsequenz von endogenen und exogenen opioiden Peptiden (bestimmte Anordnung von hydrophoben und hydrophilen Segmenten) sind diese in der Lage mit dem Rezeptor zu interagieren. Dabei weisen die meisten Exorphine sogar eine höhere biologische Aktivität (Rezeptoraffinität) als die endogenen Opioide auf (Ya. Bakalkin et al., 1992).

Ein strukturelles Charakteristikum der meisten exogenen opioiden Peptide ist ein Tyrosin-Rest am Amino-Terminus, der entscheidend für die Interaktion mit den Opiatrezeptoren ist. Somit zählen Exorphine zu den 'atypischen' opioiden Peptiden (vgl. Kapitel 2.4).

3.1. Identifikation von Nahrungspeptiden mit opioider Aktivität

Die gängige Vorgehensweise bei der Analyse von Lebensmitteln auf Stoffe mit opioider Aktivität umfasst folgende Schritte: Das Präparat, meist ein Gemisch aus Nahrungsproteinen oder isolierte Proteine aus Nahrungsmitteln, wird mit Pepsin, Trypsin oder Chymotrypsin hydrolysiert, bzw. eine Verdauung mit verschiedenen gastrointestinalen Enzymen simuliert. Das so gewonnene Hydrolysat wird anschließend mit Hilfe verschiedener Bioassays auf Inhaltsstoffe mit opioider Aktivität untersucht. Dazu zählen der 'Adenylate Cyclase Activity'- Test, die 'Mouse Vas Deferens'- und 'Guinea Pig Ileum'-Bioassays, sowie kompetitive Bindungsassays mit Opiatrezeptoren, die im Folgenden kurz beschrieben werden (Teschemacher, 2003).

3.1.1. Adenylatcyclase-Test

Wie in Kapitel 2.1 erwähnt, führt die Aktivierung der Opiatrezeptoren zu einer Hemmung der opiatsensitiven Adenylatcyclase. Die maximale Inhibition schwankt, abhängig vom Enzympräparat, zwischen 30 -50 % und wird durch den Opiatantagonisten Naloxon aufgehoben. Naloxon selbst hat keinen Effekt auf die Adenylatcyclase. Der Adenylatcyclase- Test gilt daher als Nachweis für opioide Eigenschaften einer Testsubstanz, wenn die inhibitorische Wirkung durch den Antagonisten Naloxon blockiert wird (Zioudrou et al., 1979).

3.1.2. Mouse Vas Deferens (MVD)- & Guinea Pig Ileum (GPI)-Bioassays

Henderson et al. (1972) konnten bei elektrisch stimulierten Samenleitern von Mäusen eine Inhibition der Kontraktion durch niedrige Dosen von Morphin nachweisen. Die durch Morphin aktivierten Rezeptoren führen zu einer verminderten Noradrenalin-Freisetzung. Dieser Effekt wird durch Naloxon unterbunden (Henderson et al., 1972).

In Anlehnung daran erfolgt auch das 'Guinea Pig Ileum Longitudinal Muscle Myenteric Plexus Preparation'-Assay, bei dem eine elektrisch stimulierte Kontraktion der Ileum Muskulatur ebenfalls durch Opioide gehemmt wird. Im Gegensatz zum 'Mouse Vas Deferens'-Assay, bei dem die Inhibition vorwiegend auf einer Interaktion mit den δ-Rezeptoren beruht, stehen hier µ-Liganden im Fokus (Gaginella, 1995).

Neben dem Nachweis opioider Aktivität, kann mit Hilfe dieser Assays auch die agonistische (bzw. antagonistische) Wirkstärke opioider Substanzen ermittelt werden. Dies geschieht durch Bestimmung des IC50-Werts, der die Konzentration eines Stoffes angibt, die notwendig ist, um eine Inhibition der Kontraktion um 50% zu verursachen (Kosterlitz & Watt, 1968). Folglich ist ein niedriger IC50-Wert ein Indiz für größere Wirkstärke.

3.1.3. Kompetitive Bindungs-Assays

Das Bindungsverhalten von Exorphinen an Opiatrezeptoren kann in kompetitiven Assays mit Radioliganden, wie [[3]H] Dihydromorphin oder [[3]H-Tyr, DAla² ] Met-Enkephalin-Amid analysiert werden (Zioudrou et al., 1979).

So getestete Proteinpräparate mit opioider Aktivität werden anschließend einer chromatographischen Aufreinigung und Isolationsprozeduren unterzogen. Die genaue Identifikation der isolierten Peptide erfolgt meist mit Hilfe des Edman-Abbaus und weiteren Analysen zur Bestimmung der Aminosäuresequenz. Die Synthese des identifizierten Peptids ist ein weiterer wichtiger Schritt zur Bestätigung der analysierten Peptidsequenz. Für den Fall, dass ein Proteingemisch als Testsubstanz benutzt wurde, ist es außerdem wichtig, den Vorläufer des Exorphins zu definieren. Die so isolierten bzw. synthetisierten Exorphine werden dann weiteren Tests zur Charakterisierung und Beurteilung der opioiden Aktivität unterzogen (Teschemacher, 2003).

Eine alternative Herangehensweise auf der Suche nach Exorphinen in Nahrungsprotein besteht in der direkten Synthese von Proteinfragmenten, deren Struktur auf eine mögliche Interaktion mit Opiatrezeptoren hinweist (Tyrosinrest am N-Terminus). Das synthetisierte Peptid wird anschließend auf eine agonistische oder antagonistische Opiatwirkung getestet und im positiven Fall die Freisetzung aus Vorläuferproteinen unter gastrointestinalen Bedingungen untersucht (Teschemacher, 2003).

3.2. Vorkommen: Exorphinhaltige Lebensmittel

Nach in 3.1 beschriebener Vorgehensweise wurden verschiedenste Lebensmittel auf Nahrungspeptide mit agonistischer oder antagonstischer opioider Aktivität analysiert (Tab. 2).

Tab. 2: Untersuchung von Nahrungsproteinen nach Peptiden mit opioider Aktivität (modifiziert nach Teschemacher, 2003)

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Exorphine finden sich sowohl in Lebensmitteln pflanzlichen, als auch tierischen Ursprungs. Milch und Milchprodukte sind dabei die bedeutendste (und am besten erforschte) Quelle für Exorphine. In den Milchproteinen α- und β-Casein, α- und β-Lactalbumin sowie Lactotransferrin

konnten Stoffe mit opioider Aktivität nachgewiesen und identifiziert werden. Auch Blut wurde als Bestandteil von Fleisch und Wurstwaren auf Exorphine untersucht. Sowohl Enzympräparate mit Serumalbumin, Hämoglobin als auch mit Vollblut von Rindern enthielten opioide Peptide, die als Albumin- bzw. Hämoglobin-Fragmente identifiziert wurden. Bei den pflanzlichen Lebensmitteln sind unter anderem Weizen-, und Sojaproteine eine Quelle für Exorphine. Sie finden sich darin als Komponente von Gluten und Gliadin, bzw. dem Sojaprotein ß-Conglycinin. Außerdem wurde von Yang et al. (2001) Spinat als eine weitere pflanzliche Exorphinquelle identifiziert. Das darin enthaltene Enzym D-Ribulose-1,5- bisphosphat-carboxylase/-oxygenase (Rubisco) gilt als Vorläufermolekül für Peptide mit opioider Aktivität (Teschemacher, 2003).

4. Charakterisierung der Exorphine (Struktur & Eigenschaften)

Die opioide Aktivität, also die Fähigkeit der Exorphine an Opiatrezeptoren zu binden, ist ein entscheidendes Kriterium für die Wirksamkeit (siehe Kapitel 2.2.1). Damit diese Interaktion zustande kommt, müssen bioaktive Nahrungspeptide gewisse strukturelle Voraussetzungen erfüllen (Kostyra et al., 2004). Struktur und Eigenschaften der verschiedenen Exorphine, sowie Untersuchungen zu deren Freisetzung aus Vorläuferproteinen werden nachfolgend im Einzelnen beschrieben.

4.1. Opioide Peptide aus Pflanzenproteinen

Unter den Exorphinen aus Pflanzenprotein finden sich meist δ-selektive Peptide (Ausnahme Sojamorphine), die als Agonisten an diesem Rezeptor wirken.

4.1.1. Gluten Exorphine

Opioide Aktivität in Pepsin-Hydrolysaten von Weizengluten wurde erstmalig von Zioudrou et al. (1979) entdeckt. Der Nachweis der opioden Aktivität erfolgte sowohl mit dem MVD- als auch mit dem Adenylatcyclase-Assay (Zioudrou et al., 1979). Der Forschungsgruppe um Yoshikawa gelang daraufhin die Isolation und Charakterisierung von fünf opioiden Peptiden aus Weizengluten. Sie nannten sie Gluten Exorphine A4, A5, B4, B5 und C (Yoshikawa, 2013).

Vier Peptide mit opioider Aktivität fanden sich in einem mit Pepsin und Thermolysin versetzten Extrakt von Weizengluten. Durch Strukturanalysen konnten folgende Sequenzen ermittelt werden: Gly-Tyr-Tyr-Pro (Gluten Exorphin A4), Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr (Gluten Exorphin A5), Tyr- Gly-Gly-Trp (Gluten Exorphin B4) und Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu (Gluten Exorphin B5) (Fukudome & Yoshikawa, 1992). Ein weiteres Exorphin mit der Sequenz Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu (Gluten Exorphin C) konnte ebenfalls aus Gluten isoliert werden, welches nur mit den gastrointestinalen Proteasen Pepsin, Trypsin und Chymotrypsin behandelt wurde. Dies lässt darauf schließen, dass Gluten Exorphin C nach dem Verzehr von Weizengluten im Gastrointestinaltrakt freigesetzt wird (Fukudome & Yoshikawa, 1993).

Gluten Exorphine A und B konnten zwar nicht aus Pepsin-Trypsin-Chymotrypsin Hydrolysaten aus Gluten isoliert werden, jedoch kann trotzdem davon ausgegangen werden, dass auch diese Peptide in vivo durch gastrointestinale Proteasen freigesetzt werden, wie Studien mit Pepsin und Pankreas-Elastase belegen (Fukudome, et al., 1997).

Da Gluten ein Gemisch aus vielen verschiedenen Proteinen ist, konnte noch nicht für jedes Exorphin das entsprechende Vorläuferprotein (Primärsequenz) identifiziert werden. In der Primärstruktur von hochmolekularem Glutenin findet sich 15 mal die Sequenz des Gluten Exorphins A5, sowie einige weitere Sequenzen, die dem Gluten Exorphin A4 entsprechen (Fukudome & Yoshikawa, 1992).

Alle genannten Gluten Exorphine weisen eine Affinität für den δ-Opiatrezeptor auf. Jedoch gibt es Unterschiede in der Wirkstärke, die auf strukturelle Verschiedenheiten zurückzuführen sind. Im MVD Assay konnte eine agonistische Aktivität mit folgenden IC50-Werten nachgewiesen werden: 70 µM (Gluten Exorphin A4), 60 µM (A5), 3,4 µM (B4), 0,017 µM (B5) und 13,5 (C) (Yoshikawa, 2013).

4.1.1.1. Gluten Exorphine A

Die opioide Aktivität der beiden Gluten Exorphine A4 und A5 konnte durch das Mouse-Vas- Deferens (MVD) Assay nachgewiesen werden. Im GPI-Assay zeigte sich dagegen keine Aktivität, was bedeutet, dass die Gluten Exorphine A δ-selektive Liganden sind (vgl. Kapitel 3.1.2). In verschiedenen Versuchen mit abgewandelten Molekülen konnte gezeigt werden, dass das N-terminale Glycin die Wirkungsaktivität erhöht. Insofern unterscheiden sich die Gluten Exorphine A hinsichtlich ihrer Struktur-Wirkungs-Beziehungen von den endogenen opioiden Peptiden (Fukudome & Yoshikawa, 1992).

Ein strukturelles Charakteristikum der Gluten Exorphine A ist, dass die beiden TyrosinAminosäuren zusammenhängend sind (siehe Abb. 4). Dabei ist bei Gluten Exorphin A5 das Tyr³ von essentieller Bedeutung für die opioide Aktivität, wohingegen Tyr² durch die aromatische Aminosäure Phenylalanin ersetzt werden kann (Yoshikawa, 2013).

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