Der Fokus in dieser Diplomarbeit ist auf die Enzymklasse der Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYPs) gerichtet. Durch das humane Genom Projekt wurden 57 aktive CYP Gene identifiziert, die anhand ihrer Sequenzidentität in 18 Proteinfamilien (CYP1-51) und 43 Proteinsubfamilien (CYP1A etc.) eingeteilt wurden.
Die Wissenschaft der Pharmakologie beschäftigt sich mit den Wechselwirkungen zwischen Arzneistoffen und dem Organismus. Teilgebiete der Pharmakologie sind die Pharmakodynamik, Pharmakokinetik und die Pharmakogenetik. Die Pharmakokinetik ist eng mit der Pharmakodynamik verknüpft und analysiert die Aufnahme (Absorption), die Verteilung (Distribution), die Metabolisierung (Metabolism) und die Ausscheidung (Excretion). In der Pharmakologie werden diese Prozesse unter dem Begriffe ADME zusammengefasst.
Die Pharmakodynamik beschäftigt sich dabei mit der Dosis-Wirkungsbeziehung des Arzneimittels und damit verbundene mögliche Arzneimittelnebenwirkungen. Die interindividuelle Variabilität der Arzneimittelwirkung und der damit verbundenen Nebenwirkungen hängen von Patienten-Faktoren (Alter, Geschlecht, Hormonstatus etc.), den gegebenen Umwelteinflüssen (Ernährung, Komedikation etc.) und von der unterschiedlichen genetischen Ausstattung der Patienten ab. Die Pharmakogenetik analysiert genetischen Faktoren und ihre Auswirkungen auf die Pharmakodynamik und -kinetik.
Im Zeitalter der Hochdurchsatz-Sequenzierungen (next-generation-sequencing) und Voranschreiten der personalisierten Medizin werden vermehrt Unterschiede in der genetischen Grundausstattung des Menschen identifiziert. Dabei handelt es sich oftmals um Einzelnukleotidaustausche (single nucleotide polymorphisms, SNPs), die bei den sogenannten nicht-synonymen Polymorphismen (nsSNPs), zu einem Aminosäureaustausch des Proteins führen. Dies kann unter Umständen zur interindividuellen Variabilität im Arzneistoffwechsel beitragen. Neben den Transkriptionsfaktoren, Rezeptoren und Ionenkanälen sind für die Pharmakogenetik vor allem Membranproteine der P-Glykoprotein/ABC-Transporterfamilie (MDR-Proteine) und die arzneimittelabbauenden Enzyme der Phase I und – II von besonderem Interesse.
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG
1.1 Pharmakologische Forschung in der Post-Genom Ära
1.1.1 Arzneimittelmetabolismus durch humane Cytochrom P450 Enzyme
1.1.2 Die Cytochrom P450 Monooxygenase 2B6
1.1.3 Sequenz- und Struktur-Funktionsbeziehungen von P450 Enzymen
1.1.4 Genotyp-Phänotyp Vorhersagen von nicht-synonymen SNPs
1.1.5 Rekombinante Expression humaner P450 Enzyme
1.1.6 Aufgabenstellung und Motivation
2. ERGEBNISSE
2.1 Analyse neuer CYP2B6 Varianten ruandischer HIV Patienten
2.1.1 Validierung von in silico Phänotyp Vorhersagen aufgrund experimenteller CYP2B6 Daten
2.1.2 Phänotyp Vorhersagen der neuen CYP2B6 SNPs
2.1.3 Sequenz und Struktur- Funktionsanalyse von CYP2B6
2.2 Rekombinante Expression von nativem CYP2B6 in E. coli „Walker Stämmen“
2.2.1 Expression in E. coli C41 und C43 mit dem Expressionsvektor pLW01
2.2.2 Quantifizierung des P450 Gehaltes in den Kulturen
2.2.3 Bestimmung der CYP2B6 Bupropionhydroxylase-Aktivität mittels LC-MS
2.2.4 Expression des ortholgen CYP2B4 in E. coli C41
2.2.5 Vergleich der Bupropion-Hydroxylase Aktivität von CYP2B4 und CYP2B6
2.2.6 Fraktionierung und Verteilung des exprimierten CYP2B6 im E. coli Lysat
2.3 Das E. coli pET SUMO Expressionssystem
2.3.1 Expression von SUMO-CYP2B6 und N-terminalen Varianten
2.3.2 Fraktionierung von pET-SUMO exprimiertem CYP2B6
2.3.3 Aufreinigung von SUMO-CYP2B6del mittels Magnetic Beads
2.3.4 Fazit der Expression von CYP2B6 in E. coli
2.4 Expression und Charakterisierung der neuen CYP2B6 Varianten
2.4.1 Expression der Varianten CYP2B6.G110V, -I114T, -V183G und CYP2B6.6 in E. coli C41
2.4.2 Bupropionhydroxylase-Aktivität der in E. coli C41 exprimierten Varianten
2.4.3 Expression der neuen CYP2B6 Varianten in COS-1 Zellen
2.4.4 Bupropionhydroxylase-Aktivität der in COS-Zellen exprimierten Varianten
2.4.5 Enzymparameter der CYP2B6.R253H, -R487S und CYP2B6.6 Varianten
3. DISKUSSION
3.1 Validierung der CYP2B6 Phänotyp Vorhersagen
3.2 In silico Analyse neuer CYP2B6 Varianten in ruandischen HIV Patienten
3.3 Expression von membrangebundenem CYP2B6 in E. coli C41
3.3.1 Aktivität des nativen CYP2B6
3.4 pET-SUMO Expressionssystem in E. coli zur Expression von nativem P450 Enzymen
3.5 Zusammenfassung der in vitro und in silico Analyse neuen CYP2B6 Varianten
3.6 Ausblick
4. MATERIALIEN UND METHODEN
4.1 Experimentelle Arbeiten
4.1.1 Klonierung von CYP2B6 in pLW01
4.1.2 Konstruktion der pET-SUMO-2B6 Expressionsvektoren
4.1.3 Ortspezifische Mutagenese der neuen CYP2B6 cDNA Varianten
4.1.4 Expression in E. coli
4.1.5 Zellaufschluß und Zentrifugationsschritte
4.1.6 Aufreinigung der SUMO-CYP2B6 Proteine mit der Magentic Beads ® Technologie
4.1.7 Rekombinante Expression von CYP2B6 in COS-1 Zellen
4.1.8 Western Blot
4.1.9 Reduzierte CO-Differenzspektroskopie zur Quantifizierung von exprimiertem CYP2B6
4.1.10 LC/MS Analyse
4.2 In silico Arbeiten
4.2.1 Datenbanken
4.2.2 PCR, DNA Sequenz Tools
4.2.3 Protein Primär- und Tertiärstruktur Tools
4.2.4 Online Genotyp-Phänotyp Vorhersage Programme
Zielsetzung & Themen
Die Arbeit untersucht die interindividuelle Variabilität des Enzyms CYP2B6, das für den Metabolismus wichtiger Medikamente, insbesondere in der HIV-Therapie, von zentraler Bedeutung ist. Ziel ist die Charakterisierung neuer, in ruandischen Patienten identifizierter CYP2B6-Varianten durch eine Kombination aus bioinformatischen Vorhersagemethoden und experimentellen in vitro Analysen, um deren Einfluss auf die Enzymfunktion zu bewerten.
- Pharmakogenetische Analyse des Cytochrom P450 Enzyms CYP2B6
- Validierung bioinformatischer Algorithmen zur Vorhersage von Genotyp-Phänotyp-Beziehungen
- Etablierung von E. coli Expressionssystemen zur Gewinnung funktioneller P450 Enzyme
- Biochemische Charakterisierung von loss of function Varianten
- Analyse der klinischen Relevanz für die HIV-Medikation (Efavirenz, Nevirapin)
Auszug aus dem Buch
1.1.2 Die Cytochrom P450 Monooxygenase 2B6
Eines der weniger gut untersuchten und charakterisierten P450 Enzyme war CYP2B6. Anfang 2000 war noch relativ wenig über dieses Isoenzym bekannt [8]. Zwanzig Jahr nach der Entdeckung der ersten Polymorphismen, welche den Arzneimittelstoffwechsel des Menschen beeinflussen [9], existierten für CYP2B6 keine phänotypische Charakterisierung von pharmakogenetischen Effekten. Da CYP2B6 nur ca. 3-6 % des P450 Lebermikrosomen Anteils ausmacht [10], wurde es lange Zeit weniger beachtet als andere humane P450 Enzyme.
Aber auch fehlende selektive Substrate und Inhibitoren machten die CYP2B6 Erforschung zu einer schwierigen Aufgabe. 2001 wurden die ersten CYP2B6 Polymorphismen von der Forschungsgruppe um Prof. Dr. Ulrich Zanger am Institut für klinische Pharmakologie Stuttgart publiziert [11]. Von diesem Zeitpunkt an nahm die Zahl der neuen CYP2B6 Polymorphismen stetig zu. Das Cytochrom 2B6 stellte sich als ein sehr polymorphes Gen heraus.
Zusammenfassung der Kapitel
1. EINLEITUNG: Einführung in die pharmakologische Forschung in der Post-Genom-Ära und die Bedeutung der Cytochrom P450 Enzyme, insbesondere CYP2B6.
2. ERGEBNISSE: Detaillierte Darstellung der in silico und in vitro Analysen neuer CYP2B6-Varianten sowie der Etablierung verschiedener Expressionssysteme.
3. DISKUSSION: Kritische Einordnung der Validierungsergebnisse von Vorhersage-Tools und Interpretation der biochemischen Daten zur Enzymaktivität.
4. MATERIALIEN UND METHODEN: Auflistung der verwendeten Chemikalien, Apparaturen und experimentellen Protokolle für die molekularbiologischen und biochemischen Untersuchungen.
Schlüsselwörter
Pharmakogenetik, CYP2B6, Cytochrom P450, Arzneimittelmetabolismus, Genotyp-Phänotyp-Vorhersage, in silico, rekombinante Expression, E. coli, Mutagenese, HIV-Therapie, Efavirenz, Nevirapin, SNPs, loss of function, Bupropion.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Diplomarbeit grundsätzlich?
Die Arbeit befasst sich mit der pharmakogenetischen Untersuchung des Enzyms CYP2B6, um zu verstehen, wie genetische Unterschiede zwischen Menschen die Wirksamkeit und Verträglichkeit von Medikamenten beeinflussen.
Welches sind die zentralen Themenfelder?
Zentrale Themen sind die Bioinformatik zur Vorhersage von genetischen Veränderungen, die rekombinante Proteinexpression in Bakterien und Säugetierzellen sowie die enzymatische Charakterisierung von CYP2B6-Varianten.
Was ist das primäre Ziel oder die Forschungsfrage?
Das Ziel ist die funktionelle Bewertung neuer, in ruandischen HIV-Patienten gefundener CYP2B6-Varianten, um deren potenzielle Auswirkungen auf die Arzneimittelmetabolisierung aufzuklären.
Welche wissenschaftliche Methode wird verwendet?
Die Arbeit kombiniert in silico Methoden wie Bioinformatik-Vorhersageprogramme mit experimentellen Laboransätzen, darunter ortsspezifische Mutagenese, Expression in E. coli und COS-Zellen sowie enzymatische Aktivitätsmessungen mittels LC/MS.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in die bioinformatische Analyse und Validierung von Vorhersageprogrammen, die Etablierung des E. coli-Expressionssystems und die experimentelle Charakterisierung der identifizierten CYP2B6-Mutationen.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Die wichtigsten Begriffe sind Pharmakogenetik, CYP2B6, Genotyp-Phänotyp-Vorhersage, loss of function Varianten und Bupropion-Metabolismus.
Welche Herausforderungen traten bei der Expression von CYP2B6 in E. coli auf?
Es zeigte sich, dass das native CYP2B6 nur in geringen Mengen als funktionelles Holoprotein in E. coli exprimiert wird und zum Großteil als inaktives Apoprotein vorliegt, was die spektrale Quantifizierung und Aktivitätsmessung erschwerte.
Welchen Einfluss haben die neuen Mutationen auf die HIV-Therapie?
Einige der identifizierten Mutationen führen zu einem "loss of function" Phänotyp, was bedeutet, dass das Enzym Medikamente wie Efavirenz oder Nevirapin schlechter abbauen kann, was für die Dosierung bei betroffenen Patienten klinisch relevant ist.
- Quote paper
- Robert Radloff (Author), 2011, Pharmakogenetische Analyse neuer CYP2B6 Varianten mittels rekombinanter Expression und in silico Vorhersagen, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/317551
