HPLC-Methoden zur Analyse ausgewählter Carbamate. Entwicklung, Konzentrationsstabilität und Toxizität im akuten Daphnientest

Praxissemesterarbeit


Forschungsarbeit, 2008

41 Seiten, Note: 1,0


Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung
1.1 Carbamate
1.2 Daphnia magna

2. Material/Methoden
2.1 Carbamate
2.1.1 Metolcarb
2.1.2 N,N-Dimethylphenylcarbamat
2.1.3 Methyl N-tolylcarbamat
2.1.4 N,N- Methylphenylcarbamatsäuremethylester
2.2 Akute Daphnienimmobilisierung
2.3 Analytik

3. Ergebnisse
3.1 Ergebnisse der Daphnientests
3.2 Kalibriergeraden der verwendeten Carbamate
3.3 Konzentrationsstabilität der Carbamate im akuten Daphnientest

4. Diskussion

5. Zusammenfassung

6. Literatur

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1. Einleitung

Die Entwicklung der Chemie in diesem Jahrhundert war im wesentlichen durch das Bestreben gekennzeichnet, synthetische Stoffe herzustellen, die vielseitiger verwendbar bzw. für definierte Zwecke besser geeignet sein sollten als Naturstoffe. Zu Beginn fanden die Folgen der Herstellung und Verbreitung dieser synthetischen Stoffe nur dann Beachtung, wenn die menschliche Gesundheit oder das menschliche Wohlbefinden direkt beeinträchtigt wurde. Dass die Anwendung von Chemikalien zu Schäden in der Umwelt führen kann, gelangte erst im Lauf der 50-iger und 60-iger Jahre in das öffentliche Bewusstsein, als die generelle Anwendung persistenter Organochlorinsektizide in der Landwirtschaft zu einem deutlichen Rückgang verschiedener wildlebender Tierarten führte [Pralar 1991]. Daraufhin wurden Pflanzenschutzmittel entwickelt, die eine höhere Abbaubarkeit in der Umwelt besaßen und nur in geringere Mengen ausgebracht werden mussten. Diese Maßnahme verringerte unter anderem das Risiko, dass Pflanzenschutzmittel ins Grundwasser gelangten. Andererseits können moderne hochwirksame Pflanzenschutzmittel aus ökotoxikologischer Sicht trotz geringerer Dosierung das gleiche Gefährdungspotenzial wie ältere Mittel in hoher Dosierung aufweisen. Probleme wie die Belastung benachbarter Biotope infolge von Verwehungen und Verdunstungen mit nachfolgendem Niederschlag auf anderen Flächen, sind hier zu nennen.

1.1 Carbamate

Carbamate wurden erstmals 1953 eingeführt [Sabala et al. 1997] und werden seitdem weitverbreitet in der Landwirtschaft eingesetzt. Carbamate und Organophosphat Pestizide sind die mit am meisten genutzten Pestizide. Ihr Erfolg beruht auf ihrer hohen Toxizität und ihrem schnellen Abbau in der Umwelt [Eto 1974]. Carbamate und Organophosphate wurden erst als eine umweltfreundliche Alternative zu den Chlorkohlenwasserstoffen angesehen. Jedoch fehlt ihnen die zielspezifische Wirkung, deshalb können sie akute bleibende Effekte auf in aquatischen Ökosystemen lebende Arten, insbesondere Wirbellose hervorrufen [Barata 2004]. Die Giftigkeit der Carbamate in einem Organismus beruht auf der Hemmung der Acetylcholinesterasen (AChE) [Biehl Printes et al. 2004]. Der Wirkmechanismus stellt sich wie folgt dar.

Das aktive Zentrum des Enzyms Acetylcholinesterase, welches aus den Aminosäuren Glutaminsäure, Histidin und Serin besteht, reagiert mit dem Hemmstoffmolekül. Bei dieser Reaktion überträgt der Hemmstoff durch den nukleophilen Angriff des Serins die Carbamylgruppe auf das Enzym.

Der Rest des Hemmstoffes diffundiert ab und das Enzym regeneriert sich durch Hydrolyse, wobei Carbaminsäure entsteht. Der Mechanismus läuft für das natürliche Substrat (Acetylcholin) nach dem gleichen Schema ab. Der wesentliche Unterschied besteht in der auf das Enzym übertragenen Gruppe und den daraus folgenden Reaktionsgeschwindigkeiten. Die Hydrolyse des carbamylierten Enzyms läuft wesentlich langsamer ab (Minuten bis Stunden), als die des acetylierten Enzyms [Förster 2005], welches innerhalb eines Bruchteils einer Sekunde hydrolisiert wird.

Carbamate sind Salze und Ester der Carbaminsäure (H2N-COOH). Sie bauen sich nach folgender allgemeinen Formel auf.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2-1 : allgemeine

Formel der Carbamate

Wobei R und R' aliphatische oder aromatische Reste oder Wasserstoffatome sein können.

Für das theoretische Abschätzen der Toxizität von Stoffen werden immer wieder neue Modelle und Theorien, mittels QSAR entwickelt. Eines dieser Modelle heißt Strukturarlarm [von der Ohe et al. 2005]. Es bewertet die Toxizität von Stoffen anhand ihrer Struktur. Dies bedeutet das unterschiedliche chemische Gruppen z.B. Methylseitenketten an den funktionellen Gruppen zu einer bestimmten Abweichung der Toxizität von der Basistoxizität eines Stoffes führen. Die Basistoxizität eines Stoffe ist die Toxizität die aufgrund seines log KOW -Wertes angenommen wird. Die Abweichung der Toxizität von der Basistoxizität ist als erhöhte Toxizität definiert.

Die untersuchten Carbamate (MC, DMPC, MTC und MPCM) besitzen alle die gleiche Summenformel C9H11NO2, jedoch unterschiedliche Strukturformeln und somit unterschiedliche log KOW -Werte. Es wird nun angenommen das die Toxizität der untersuchten Carbamate von der Basistoxizität auf Grund der unterschiedlichen Struktur unterschiedlich stark abweichen

1.2 Daphnia magna

Zur Bewertung der Toxizität von Stoffen bzw. Umweltproben werden in der Ökotoxikologie Bioassays mit verschiedenen Organismen wie z.B. Scenedesmus vacuolatus, Lemna minor, Fischembryonen oder Daphnien verwendet. Es werden die Effekte von Substanzen auf so viel verschiedene Organismen untersucht, um das Risiko auf das gesamte Ökosystem mit seinen verschiedenen Organismengruppen abschätzen zu können. Der Toxizitätstest mit Daphnia magna gehört zum Standardrepertoire der aquatischen Ökotoxikologie. Hierbei wird die Bewegungshemmung von D. magna über 48h durch Schadstoffe beobachtet. Bereits 1984 wurde der akute Daphnientest als einer der ersten ökotoxikologischen Verfahren standardisiert.

Der Wasserfloh Daphnia magna gehört innerhalb des Stammes der Arthropoda (Gliederfüßler) zum Unterstamm Crustacea (Krebse), zur Klasse Phyllopoda (Blattfußkrebse) und zur Ordnung Cladocera (Wasserflöhe). In der Familie der Daphniidea werden mit Ctenodaphnia, Daphnia und Hyalodaphnia drei Gattungen zusammengefasst. [Fomin et al., 2003]

Daphnien sind weltweit in Süß- und Meereswasser vorzufinden. Sie sind ein wichtiger Bestandteil des aquatischen Nahrungsnetzes, da sie Bakterien, Detritus (zerfallene organische Substanz im Zustand der Aufschliessung) und Phytoplankton in tierisches Eiweiß umwandeln, welches wiederum die Nahrungsgrundlage für höhere Spezies darstellt. Als Filtrierer sind sie einem hohen Austausch mit ihrem Umgebungswasser ausgesetzt. Für ökotoxikologische Tests sind Wasserflöhe besonders geeignet, da sie sehr empfindlich gegenüber Gifftstoffen und leicht bei geringen Platzbedarf unter Laborbedingungen zu züchten sind. Weiterhin pflanzen sie sich unter günstigen Bedingungen zumeist parthenogenetisch fort und produzieren somit Klone ihrer selbst. Da durch diese Form der Fortpflanzung die genetische Varianz weitestgehend umgangen werden kann, sind die Reaktionen der Testorganismen eindeutiger auf die Wirkung der Schadstoffe zurück zuführen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2-6 : Daphnia magna [Quelle: MBL Aquaculture www.mblaquaculture.com/ content/organisms/daphnid s.php]

Ein häufig verwendeter Parameter zu Bewertung und dem Vergleich der Toxizität von Substanzen ist der EC50 -Wert eines Stoffes. Es ist diejenige Konzentration bei der 50% der Testorganismen, aufgrund der Substanz einen vorher definierten Effekt zeigen. Dieser EC50 -Wert wird aus der Konzentrations-Wirkungsbeziehung eines Stoffes auf einen Organismus gewonnen. Bei einer Konzentrations-Wirkungsbeziehung wird der Effekt gegen die Konzentration aufgetragen, wobei meist eine positive Korrelation zwischen Effekt und Konzentration zu beobachten ist.

Um die Toxizität von Stoffen möglichst genau zu beurteilen, ist es wichtig das die Expositionskonzentration über den Testzeitraum konstant bleibt oder nur geringfügig abweicht. Dazu wurde eine stoffanalytische Bestimmung der Realkonzentrationen der Testsubstanzen vor und nach dem Test durchgeführt.

Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher eine HPLC-Methode für die quantitative Analytik von bestimmten Carbamaten entwickelt werden, um Aussagen über die Konzentrationstabilität dieser Stoffe im akuten Daphnientest zu treffen. Dazu wurden Proben aus dem akuten Daphnientest über 48h entnommen und gemessen.

2. Material/Methoden

2.1 Chemikalien

2.1.1 Metolcarb

Metolcarb (CAS-Nr. 1129-41-5) ist ein klarer kristallener Feststoff. Er besitzt bei einem log KOW- Wert von 1,7 und eine Wasserlöslichkeit von 2600 mg/L. Die Substanz besitzt die Summenformel C9H11NO2 und eine Molare Masse von 165,2 g/mol. Metolcarb besitzt keinen pKA-Wert, da es nicht ionisiert wird. Der Stoff hat bei 25 °C einen Dampfdruck von 0,00108 mm Hg. Der Schmelzpunkt liegt bei 76,5°C. Diese Daten wurden der SRC (Syracuse Research Corporation) PhysProp-Datenbank entnommen. Es wird zur Bekämpfung und Kontrolle verschiedener saugender Insekten eingesetzt (z.B. Baumwollblattlaus, mediterane Fruchtfliege, Zwergzikade, Apfelwickler, ...) [HSDB Stand: 8.11.2002]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2-2 : Metolcarb

2.1.2 N,N-Dimethylphenylcarbamat

N,N-Dimethylphenylcarbamat (CAS-Nr. 6969-90-0) besitzt die Summenformel C9H11NO2 und eine Molare Masse von 165,2 g/mol. Es ist ein kristalliner Feststoff. Er besitzt bei einen log KOW- Wert von 1,56 eine Wasserlöslichkeit von 3010 mg/L. Der Stoff hat bei 25°C einen Dampfdruck von 0,0641 mm Hg. N,N-Dimethylphenylcarbamat besitzt keinen pKA-Wert, da es nicht ionisierend ist. Diese Daten wurden der SRC PhysProp-Datenbank entnommen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2-3 : N,N-Dimethyl

carbamatsäurephenylester

2.1.3 Methyl N-tolylcarbamat

Methyl N-tolylcarbamat (CAS-Nr. 5602-96-0) besitzt eine Molare Masse von 165,2 g/mol und die Summenformel C9H11NO2. Es ist ein kristalliner Feststoff. Es hat bei einen log KOW- Wert von 2,29 eine Wasserlöslichkeit von 717 mg/L. Der Stoff besitzt bei 25 °C einen Dampfdruck von 0,0187 mm Hg. Methyl N-tolylcarbamat besitzt keinen pKA-Wert, da es nicht ionisierend ist. Diese Daten wurden der SRC PhysProp-Datenbank entnommen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2-4 : Methyl N-(p-tolyl)

carbamat

2.1.4 N,N-Methylphenylcarbamatsäuremethylester

N,N-Methylphenylcarbamatsäuremethylester wurde von Vladimir Nikitorov an der Universität Sant Petersburg, Russland synthetisiert und besitzt bisher keine CAS-Nummer. Es hat eine Molare Masse von 165,2 g/mol und die Summenformel C9H11NO2 . Es hat einen geschätzten log KOW -Wert von 2,5 daraus folgt eine geschätzte Wasserlöslichkeit von ca. 477,2 mg/L. Die Wasserlöslichkeit wurde mit dem Programm EPI Suite Version 3.20 ermittelt. Weitere Daten zu diesem Stoff sind nicht vorhanden

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2-5 : N,N-Methyl-

phenylcarbamatsäure- methylester

Alle verwendeten Carbamate wurden für die Daphnientests direkt in Achener Daphnien Medium gelöst. Für die HPLC-Analytik wurden die Substanzen in bidestiliertem Wasser gelöst oder die Realproben mit bidestilliertem Wasser verdünnt.

2.2 Akute Daphnienimmobilisierung

Als Testorganismus wurde die Cladocere Daphnia magna verwendet. Die am Helmholtz Zentrum für Umweltforschung UFZ Leipzig verwendete Daphnienkultur wurde mit Tieren der Technischen Hochschule Aachen aufgebaut. Die Daphnien wurden in den Altersstufen 1. - 5. Woche, bei jeweils 20 Tiere pro Woche in Einzelhälterung gehalten. Jedes Muttertier wurde in einem separaten Glas mit ca. 80 mL Kulturmedium gehalten. Für die Tests wurden nur die Neonaten (Jungtiere der Daphnien) der Muttertiere (die älter als zwei Wochen) waren verwendet. Tiere, die älter als fünf Wochen waren wurden durch Neonaten der dritten Woche ersetzt, somit bestand die Kultur ständig aus ca. 100 Muttertieren.

Die Kultivierung der Daphnien und die Versuche mit selbigen wurden ausschließlich in Glasgefäßen durchgeführt, da sich bei der Verwendung von Kunststoffgefäßen eventuell Weichmacher lösen könnten und somit zusätzliche chronische Effekte auf die Daphnien hervorrufen würden. Jedoch konnten bei der Lagerung des Nährmediums nicht immer Glasgefäße verwendet werden, da mit unter große Mengen des Mediums gebraucht wurden (bis zu 8 Liter). Die Lagerung des Mediums in dem Kunststofftank überschritt jedoch nie eine Lagerungsdauer von drei Tagen.

Als Kulturmedium wurde das „Aachener Daphnienmedium“ (ADaM) [Klüttgen et al., 1994] sowohl für die Hälterung der Daphnien als auch zur Durchführung der ökotoxikologischen Versuche verwendet. Das Medium für die Hälterung der Daphnien wurde jeweils Montags und Freitags ausgewechselt. Hierbei wurden nur die Muttertiere umgesetzt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab. 2-1 :Zusammensetzung des Aachener Daphnienmediums

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die in der Tabelle 2-1 angegebenen Substanzen wurden mit bidestilliertem Wasser vermischt und mit wasserdampfgesättigter, sterilfiltrierter Pressluft ca. 24 Stunden bis zur Sauerstoffsättigung belüftet.

Als Futter für die Daphnien wurde die Grünalge Scenedesmus vacuolatus verwendet. Die Kultivierung der Algenkultur wird in [Löffler, 2005] beschrieben. Die Bestimmung der Gesamt-Algenzahl im Konzentrat erfolgte mit Hilfe des CASY 1-Cell Counter and Analyser Systems, damit konnte anhand der Anzahl der Algen die genaue Futtermenge berechnet werden. Die Fütterung selbst erfolgte nach dem Schema in Tab. 2-2. Freitags wurde zusätzlich zu den Algen jeweils noch 250 µL Hefesuspension zugegeben, damit die Daphnien mit essentiellen Nährstoffen versorgt werden.

Tab. 2-2 :Fütterungsschema der Daphnienkultur

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Ab 3. Woche 2,7*10[9] 4,1*10[9] + 250 µL Hefe

Versuchsablauf

Da für drei Testsubstanzen (Metolcarb, NN-Dimethylphenylcarbamat, Methyl N- tolylcarbamat) schon Vorversuche mit Daphnia magna durchgeführt wurden lagen für diese Stoffe schon konkrete Konzentrationsbereiche vor, in denen eine Immobilisierung der Daphnien zu erwarten waren. Deshalb wurden für diese Substanzen nur noch Daphnientests durchgeführt mit einer geringen Anzahl an getesteten Konzentrationen, um Proben für eine genaue Konzentrationsbestimmung mit der HPLC zu gewinnen. Für die andere Substanz ( N,N-Methylphenylcarbamatsäuremethylester ) gab es theoretische Annahmen über den Bereich der wirksamen Konzentrationen.

[...]

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Details

Titel
HPLC-Methoden zur Analyse ausgewählter Carbamate. Entwicklung, Konzentrationsstabilität und Toxizität im akuten Daphnientest
Untertitel
Praxissemesterarbeit
Hochschule
Hochschule Zittau/Görlitz; Standort Zittau
Note
1,0
Autor
Jahr
2008
Seiten
41
Katalognummer
V323783
ISBN (eBook)
9783668236202
ISBN (Buch)
9783668236219
Dateigröße
576 KB
Sprache
Deutsch
Anmerkungen
Alle praktischen Arbeiten wurden im Department „Bioanalytische Ökotoxikologie“, Fachbereich Analytik und Ökotoxikologie des Helmholtz Zentrum für Umweltforschung UFZ in Leipzig durchgeführt.
Schlagworte
Ökotoxikologie, Analytische Chemie, Daphnientest, Carbamate
Arbeit zitieren
Maik Scholz (Autor), 2008, HPLC-Methoden zur Analyse ausgewählter Carbamate. Entwicklung, Konzentrationsstabilität und Toxizität im akuten Daphnientest, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/323783

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