Caractérisation Moléculaire et Biochimique en Condition de Stress Salin de "Medicago truncatula" Gaertner

SOMMAIRE

INTRODUCTION GENERALE

Chapitre 1 : Biologie de l’Adaptation a la salinite de Medicago truncatula Gaertner. : Revue bibliographique
1. Les legumineuses
1.1. L’azote dans la nutrition des plantes g
1.2. Teneur en proteines g
1.3. Les legumineuses dans les systemes de culture
2. Le Modele Medicago truncatula Gaertn g
2.1. Interet biologique
2.2. Interet agronomique
2.3. Interet pour la recherche en genetique fondamentale
2.4. Correlation entre la diversite moleculaire et phenotypique
2.5. Biologie de la graine chez Medicago truncatula
2.5.1. Phase de maturation de la graine
2.5.2. Phase de germination de la graine 1g
2.6. Mobilisation desreserveschezlesplantes 1g
3. AdaptationdesLegumineusesau Stress HydriqueetSalin
3.1. Mecanismes de resistance et criteres de selection
3.1.1. L’esquive
3.1.2. L’evitement
3.1.2.1. La capacite d’extraction de l’eau par le systeme racinaire
3.1.2.2. La regulation stomatique
3.1.2.2. L’ajustementosmotique
3.2. La notion de tolerance au stress hydrique et stabilite des membranes cellulaires
3.3. Lesmecanismes moleculairesdelareponsealacontrainte hydrique
3.3.1. Activation transcriptionnelle des genes
3.3.2. Regulation au niveau de l’ADN genomique 2g
3.3.3. Etude des Promoteurs de Genes
3.4. Tolerance au sel des legumineuses
3.4.1. Probleme de la salinite des sols
3.4.2. Effet de la salinite sur les plantes
3.4.3. Strategies d’adaptations au stress salin
3.5. Les mecanismes antioxydants chez les plantes
3.5.1 Les oxydases alternatives (AOX)
3.5.2 Les antioxydants
3.5.2.1. Definition
3.5.2.2. Les principaux systemes non enzymatiques
3.5.2.2.1 L’ascorbateou vitamine C
3.5.2.2.2 Le glutathion
3.5.2.3. Les principales enzymes antioxydantes 3g
3.5.2.3.1 Les enzymes du cycle Asada-Halliwell-Foyer 3g
3.5.2.3.2Lesperoxydases(POX)
4. Variabilite Genetique des Plantes
4.1. L’Origine de la Diversite Genetique
4.1.1. La Diversite Genetique en Agriculture
4.1.2. Determination de la diversite genetique
4.2. Notion de vulnerabilite et erosion genetiques
4.2.1 Indicateurs de la vulnerabilite et de l’erosion genetique
4.3. Approches de la diversite moleculaire
4.3.1. Marqueurs moleculaires pour l'etude de la diversite genetique
4.3.2. Les marqueurs Microsatellites
4.4. Analyse de la variabilite genetique
4.4.1. Methodes de classification
4.4.1.1. Indices de similarites binaires symetriques
4.4.1.2. Indices de similarites binaires asymetriques
5. Aspect Genomique de Medicago truncatula Gaertn 4g
5.1. Outils genetiques et genomiques disponibles 4g
5.2. La genomique structurale et fonctionnelle 4g
5.3. La genomique structurale
5.3.1 Le sequenpage systematique
5.4. Sequenpage d’etiquettes de sequences exprimees (EST) 4g
5.5. Interet de l’utilisation des ESTs 4g
5.g. La genomique fonctionnelle
5.7. Le role regulateur des facteurs de transcription sous divers stress abiotiques

Chapitre 2 : Analyse de la Tolerance au Stress Salin de Medicago truncatula Gaertn. en relation avec le Poids et la Teneur en Proteines de Reserves des Graines
Materiels et methodes
1. Materiel
2. Methodes
2.1. Determination des de la teneur en proteines de reserves des graines
2.2. Analyse statistique
Resultats et interpretation
1. Influence du stress sel sur les differents parametres du developpement desjeunes plants chez les differents genotypes M.truncatula
2. Analyse du poids et de la teneur en proteines de reserves des graines
3. Relation entre les differents parametres du developpement desjeunes plants sous stress salin avec le poids des graines et la teneur en proteines de reserves '
Discussion g
Conclusion gg

Chapitre 3 : Analyse de la Diversite Genetique des Proteines de Reserves par Electrophorese g
Materiels et methodes gy
1. Materiel gy
2. Methodes gy
2.1. Extraction des proteines de reserves et SDS-PAGE gy
2.2. Analyse des donnees gg
Resultats et interpretation yq
1. Analyse du polymorphisme des profiles proteiques yq
2. Recherchede similaritesparanalyse desclusters yq
Discussion y
Conclusion y

Chapitre 4 : Etude du Comportement de deux Genotypes contrastes de Medicago truncatula Gaertn. vis-a-vis du Stress Salin yg
Materiels et methodes yg
1. Materiel yg
2. Methodes yg
2.1. Condition de germination etparametrescalcules yg
2.2. Determination des de la teneur en proteines desjeunes plants sous stress salin yy
Resultats et interpretation yy
1. Etude de la variabilite de la tolerance au stress salin au niveau phenotypique et biochimique
durant la germination yy
2. Cinetique de germination yg
Discussion g

Chapitre 5 : Caracterisation Physiologique et Biochimique de la Racine de deux genotypes contrastes de Medicago truncatula Gaertn. sous Stress Salin
Materiel et methodes
1. Materiel
2. Methodes
2.1. Condition de croissance sous le traitement par NaCl
2.2. Mesure des differents parametres biometriques (longueur et poids des racines)
2.3. Calcul du potentiel hydrique de la Racine
2.4. Determination de l’activite Guaiacol Peroxydase
2.5. Extraction et dosages des proteines solubles racinaires
2.6. Extraction et determination de la masse moleculaire des antioxydants
2.7. Analyse statistique
Resultats et interpretation
1. Effet du stress salin sur la longueur, le poids et le potentiel hydrique de la racine
2. Effet du stress salin sur l’activite Guaiacol peroxydase (GPX)
3. Effet du stress salin sur le contenu racinaire en proteines
4. Effet du stress salin sur le contenu racinaire en Ascorbate et en Gluthatione
Discussion
Conclusion

Chapitre 6 : Analyse de la Diversite Genetique de Differents Ecotypes de Medicago truncatula Gaertn par Les Marqueurs Moleculaires
Materiel et methodes
1. Materiel
2. Methodes
2.1. Caracterisation moleculaire
2.1.1 Extraction d’ADN et amplification par PCR
2.1.2 Analyse de donnees
Resultats et interpretation
1. Analyse de diversite moleculaire revelees par les marqueurs EST-SSR
2. Correlation entre les differents donnees moleculaires etudies et les marqueurs (EST-SSR)
3. Relations genetiques (Similarites / Dissimilarites ) et classification des accessions par rapport
au deux genotypes contrastes au stress salin
3.1 Analyse basee sur chaque EST -SSR (primer)
3.2 Analyse globale de classification basee sur les quatre amorces d’EST- SSR etudies
Discussion
Conclusion

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

ANNEXE 1 (Protocole de manipulation, mesures de parametres physiologiques.) ANNEXE 2 : Liste des publications

INTRODUCTION GENERALE

CHAPITRE 1. BIOLOGIE DE L’ADAPTATION A LA SALINITE DE MEDICAGO TRUNCATULA Gaertner : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
Les legumineuses, Le Modele Medicago truncatula Gaertner, Adaptation des Legumineuses au Stress Hydrique et salin, Variability Genetique des Plantes, Aspect Genomique de Medicago truncatula

CHAPITRE 2. ANALYSE DE LA TOLERANCE AU STRESS SALIN DE MEDICAGO TRUNCATULA Gaertn. EN RELATION AVEC LE POIDS ET LA TENEUR EN PROTEINES DE RESERVES DES GRAINES
Materiel et methodes :
Traitement par NaCl, Calcul du poids et dosage des proteines de reserves de graines, Analyse statistique
Resultats et interpretation : Comparaison entre les differents parametres etudies
Discussion
Conclusion

CHAPITRE 3. ANALYSE DE LA DIVERSITE GENETIQUE DES PROTEINES DE RESERVES PAR ELECTROPHORESE
Materiel et methodes : Extraction des proteines solubles et SDS-PAGE)
Resultats et interpretation : Analyse du polymorphisme genetique
Discussion
Conclusion

CHAPITRE 4. ETUDE DU COMPORTEMENT DE DEUX GENOTYPES CONTRASTES DE MEDICAGO TRUNCATULA Gaertn. VIS-A-VIS DU STRESS SALIN
Materiel et methodes : Cinetique de germination, Dosage des proteines solubles, Analyse statistique Resultats et interpretation : Variabilite phenotypique et biochimique de la tolerance au stress salin
Discussion
Conclusion

CHAPITRE 5. CARACTERISATION PHYSIOLOGIQUE ET BIOCHIMIQUE DE LA RACINE DE DEUX GENOTYPES CONTRASTES DE MEDICAGO TRUNCATULA Gaertn. SOUS STRESS SALIN...
Materiel et methodes :
Calcul de parametres physiologiques, Activite enzymatique, Extraction et analyse des antioxydants, Dosage des proteines solubles
Resultats et interpretation : Effet du stress salin sur la synthese des proteines, Enzymes et antioxydants racinaires
Discussion
Conclusion

CHAPITRE 6. ANALYSE DE LA DIVERSITE GENETIQUE DE DIFFERENTS ECOTYPES DE MEDICAGO TRUNCATULA Gaertn. PAR LES MARQUEURS MOLECULAIRES
Materiel et methodes : Extraction d’ADN, Amplification par PCR et Analyse par des marqueurs EST-SSR Resultats et interpretation : Analyse phylogenetique et Recherches de similarites
Discussion
Conclusion

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

ANNEXE 1 : Protocole de manipulation, mesures de parametres physiologiques

ANNEXE 2 : Travaux personnels

DEDICACES

Je dedie ma these :

- A mes Parents, pour tous les efforts et les sacrifices qu’ils ont consenti pour ma formation,

En temoignage de ma re connaissance et mon respect,

- A ma Femme et mon Enfant,
- A toute ma famille et ceux qui me sont chers,
- A tous les miens,
- A tous mes amis, collegues et camarades de promotion

REMERCIEMENTS

Je tiens a remercier, Monsieur le Professeur HADJADJ AOUL Seghir, Responsable du laboratoire d’ecologie vegetale et rapporteur de cette these, pour la confiance et les encouragements bienvaillants qu’il m’a constamment temoigne pour finaliser ma these. Il m’a prodigue de precieux conseils. Qu’il trouve ici l’expression de ma reconnaissance et de mon indefectible attachement.

Je remercie egalement, Madame la Professeure FYAD LAMECHE Fatima Zohra, Responsable du laboratoire d’amelioration des plantes, pour la realisation de la partie biometrique et l’analyse des proteines des trois premiers chapitres au sein de son laboratoire.

Ma grande gratitude a Madame la Professeure IGHIL-HARIZ Zohra de l’universite d’Oran 1. Elle me fait aujourd’hui l’honneur de presider le jury de ma these. Qu’il me soit permis de lui exprimer ma profonde gratitude.

Mes vifs remerciements a Monsieur le Professeur BELKHODJA Moulay de l’universite d’Oran 1 pour sa precieuse aide et pour avoir accepter de juger ma these. Qu’il me soit permis de lui exprimer ici mes sinceres et tres respectueux remerciements.

Je remercie egalement Monsieur le Professeur DJABEUR Abderezak de l’universite USTOran d’avoir accepter dejuger mon travail.

Je remercie infiniment Monsieur le Processeur ADDA Ahmed de l’universite de Tiaret pour m’avoir fait l’honneur d’examine ce travail.

Mes plus sinceres remerciements a Madame la Professeure Esther M GONZALEZ de l’universite de NAVARA (Espagne) pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire et d’avoir accepter d’evaluer mon travail de cette these.

Ma grande gratitude et mes remerciements au Dr UDUPA M. Sripada de l’ICARDA de Rabat et au Dr Iraqi Driss et toute son equipe de l’INRA de Rabat pour l’octroi de la semence des differentes accessions de Medicago truncatula Gaertner. et pour m’avoir accueilli au sein de leur institut afin de realiser la partie moleculaire.

La vie quotidienne nous apprend que chacun ne se realise, qu’apartir des autres etpour les autres.

Le fruit des efforts reste tributaire du vouloir, de l’energie et de la connaissance d’autrui.

Personne ne peut honnetementpretendre « s’etre fait tout seul».

Les reelles capacites d’enseignement et de recherche loin de s’improviser, reclame dans le travail, ouverture d’esprit et imagination.

Anonyme

ABREVIATIONS

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LISTES DES TABLEAUX

Tab 1 : ANOVA a un facteur de l’effet du stress salin sur les differents parametres de developpement des jeunes plants chez les genotypes de M.truncatula

Tab 2 : ANOVA a deux facteurs de l’effet du stress salin sur les differents parametres de developpent des jeunes plants chez les genotypes de M. truncatula

Tab 3 : Classification des moyennes des differents niveaux des stress salin sur les differents parametres de developpement chez M. Truncatula.

Tab4 : Matrice des distances entre les genotypes de M. truncatula sous differents niveaux de stress salin pour le ratio (Tige /Racine).

Tab5 : Matrice des distances entre les genotypes de M. truncartula pour la teneur en proteines de reserves.

Tab 6 : Coefficients de correlation (r) entre differents parametres de developpement des jeunes plants sous differentes concentrations des salinite, poids des graines seches et la teneur en proteines de reserves chez M.truncatula.

Tab7 : Nombre et le type de bandes de la diversite genetique chez les quatre genotypes de Medicago truncatula

Tab8 : Matrice se similarite base sur le coefficient de Jaccard pour les proteines de reserves des graines chez les genotypes de M. Truncatula .

Tab 9 : Resultats de l’analyse de variance a deux facteurs de l’effet traitement, genotype et leurs interaction pour les parametres : taux de germination et indice de tolerance, poids frais et teneur en proteines desjeunes plants.

Tab 10 : Resultats d’analyse de variance a deux facteurs. 1. Effet traitement (stress salin). 2. Effet genotype. 3. Effet interaction sur les parametres morphologiques, physiologiques et biochimiques au niveau racinaire.

Tab 11 : Resultats obtenus de l’effet du stress salin sur les parametres biochimiques (proteines solubles, activite GPX, pools : ASC+DHA et GSH+GSSG) au niveau racinaire.

Tab 12 : Informations sur les ecotypes de Medicago truncatula etudiees.

Tab 13 : Caracteristiques et resultats obtenus sur le polymorphisme des marqueurs microsatellites EST-SSR utilises pour l’analyse genetique des 11 ecotypes de M. truncatula.

Tab 14 : Resultats obtenus sur le polymorphisme des bandes amplifiees pour chaque marqueur EST-SSR utilises chez les differentes accessions de M. truncatula.

Tab 15 : Correlation entre les differents parametres etudies sur l’ensemble des amorces (loci EST-SSR).

Tab 16 : Matrice de similarite genetique pour le locus EST-SSR (MTIC044) base sur le coefficient de Jaccard entre les differentes accessions de Medicago truncatula.

Tab 17 : Matrice de similarite genetique pour le locus EST-SSR (MTIC 124) base sur le coefficient de Jaccard entre les differentes accessions de Medicago truncatula.

Tab 18 : Matrice de similarite genetique pour le locus EST-SSR (MTIC 077) base sur le coefficient de Jaccard entre les differentes accessions de Medicago truncatula

Tab 19 : Matrice de similarite genetique pour le locus EST-SSR (MTIC 335) base sur le coefficient de Jaccard entre les differentes accessions de Medicago truncatula.

Tab 20 : Matrice de similarite genetique pour les quatre loci EST-SSR base sur le coefficient de Jaccard entre les differentes accessions de Medicago truncatula

Tab 21 : Resume de resultats de 87 echantillons d’ADN apartir de jeunes plants de M. truncatula

Tab 22 : Concentrations de ASC, DHA, GSH, GSSH, (ASC+DHA) et (GSH+GSSH) Pools, ASC/ASC+DHA et GSH/GSH+GSSH Ratios au niveau racinaire chez les deux genotypes contrastes de M. truncatula sous differents traitements de NaCl.

LISTE DES FIGURES

Fig 1 : Classification des legumineuses de la famille des Papilionoideae (Zhu et al. 2005)

Fig 2 : Fleurs, feuilles, gousses et grains chez la legumineuse modele Medicago truncatula Gaertn.

Fig 3 : Structure de la graine chez Medicago truncatula

Fig 4: Representation schematique des reponses moleculaires a la secheresse dans une cellule vegetale (Yamaguchi-Shinozaki, 2002).

Fig 5 : Genes induits par le stress hydrique et leur fonction possible dans la reponse a la tolerance au stress osmotique (Yamaguchi-Shinozaki, 2002).

Fig 6 : Representation schematique des principales voies de signalisation majeures et principaux produits de transcription chez les plantes en reponse au stress osmotique (Diop, 2002).

Fig 7 : Formes redox de l’ascorbate (Potters et al., 2002).

Fig 8 : Oxydation de deux molecules de GSH conduisant a l’etablissement d’un pont disulfure et la formation de GSSG.

Fig 9 : Cycle Asada-Halliwell-Foyer (Potters et al. 2002).

Fig 10 : Vigueur des grains des differents genotypes de M. truncatula sous differentes condition de stress salin.

Fig 11 : Valeurs moyennes du ratio (Tige / racine) chez les differents genotypes de M. truncatula sous differentes concentrations de stress salin

Fig 12 : Analyse des groupes des genotypes de M. Truncatula sous differentes concentrations de salinite pour le parametre ratio (Tige /Racine).

Fig 13 : Poids des graines seches des differents genotypes de M. truncatula.

Fig 14 : Teneur en proteines de reserves chez les differents genotypes de M. truncatula

Fig 15 : Analyse des groupes des genotypes de M. Truncatula pour la teneur en proteines de reserves.

Fig 16 : Relation entre la longueur de la Racine (RL) et le poids des graines seches (SDW) sous differentes concentration en stress salin chez les genotypes de M.truncatula.

Fig 17 : Relation entre la teneur en proteines de reserves (SPC) et le poids des graines seches (SDW) chez les genotypes de M.truncatula.

Fig 18 : Relation entre la teneur en proteines de reserves (SPC) et la longueur de la racine (RL) chez les genotypes de M.truncatula .

Fig 19 : Profiles des proteines de reserves chez les quatre genotypes de M. truncatula.

Fig 20 : Dendrogramme (UPGMA) base sur les profiles proteiques des proteines de reserves chez M. Truncatula.

Fig21 : Resultatsdu taux de germination desdeuxgenotypesde M. truncatula Tru 131, tolerantet Jemalong, moins tolerant) sous l’effetNaCl

Fig 22 : Indice de tolerance des deux genotypes de M. truncatula (Tru 131, tolerant et Jemalong, moins tolerant) sous l’effet NaCl.

Fig 23 : Poids frais des jeunes plants des deux genotypes de M. truncatula Tru 131, tolerant et Jemalong, moins tolerant) sous l’effetNaCl.

Fig 24 : Teneur en proteines solubles des jeunes plants chez les deux genotypes contrastes de M. trunacatula (Tru 131, tolerant et Jemalong, moins tolerant) sous differentes concentration NaCl

Fig 25: Croissance des plantules de deux genotypes contrastes de M. truncatula (Tru 131 et Jemalong) sous differentes concentration NaCl.

Fig 26 : Cinetique de germination des graines des deux genotypes de Medicago truncatula en condition temoin

Fig 27 : Cinetique de germination des graines des deux genotypes de Medicago truncatula a une concentration de NaCl faible (68mM)

Fig 28 : Cinetique de germination des graines des deux genotypes de Medicago truncatula a une concentration de NaCl moderee (102mM) Fig 29 : Cinetique de germination des graines des deux genotypes de Medicago truncatula a une concentration de NaCl maximale (137 mM)

Fig 30 : Longueur racinaire (RL) chez les deux genotypes contrastes de M. truncatula, Tru 131 et Jemalong, exposes au stress salin

Fig 31 : Poids frais individuel racinaire (RW) chez les deux genotypes contrastes de M. truncatula, Tru 131 et Jemalong, exposes au stress salin.

Fig 32 : Potentiel hydrique des racines des deux genotypes contrastes de M. truncatula, T 131 et Jemalong, exposes au stress salin.

Fig 33 : Activite de l’enzyme Guaiacol peroxydase exprimee en (nmols/mg prot/min) dans les racines des deux genotypes contrastes de M. truncatula T131 et Jemalong exposes aux differents traitements par NaCl.

Fig 34 : Contenu en proteines solubles exprimes en mg /g poids sec racinaire des deux genotypes de M. truncatula exposes au stress salin.

Fig 35 : Contenu racinaire en pools d’Ascorbate ASC+DHA chez les deux genotypes contrastes de M. truncatula T131(T) et Jemalong (S) exposes aux differents traitements par NaCl.

Fig 36 : Contenu racinaire en pool de Gluthatione GSH+GSSG chez les deux genotypes contrastes de M. truncatula T131(T) et Jemalong (S) exposes aux differents traitements par NaCl.

Fig 37 : Developpent des plantules des deux genotypes contrastes de M. truncatula T131(T) et Jemalong (S) traites aux differentes concentration de NaCl.

Fig 38 :. Representation generale des parametres etudies pour chaque amorce (primer) / locus EST-SSR.

Fig 39 : Profiles des marqueurs EST-SSR des differents ecotypes de M. truncatula generes par l’amorce MTIC 044.

Fig 40 : Dendrogramme UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic means) chez les differents ecotypes de M. Truncatula base sur le marqueur EST-SSR (MTIC 044)

Fig 41 : Profiles des marqueurs EST-SSR des differents ecotypes de M. truncatula generes par l’amorce MTIC 124.

Fig 42 : Dendrogramme UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic means) chez les differents ecotypes de M. Truncatula base sur le marqueur EST-SSR (MTIC 124)

Fig 43 : Profiles des marqueurs EST-SSR des differents ecotypes de M. truncatula generes par l’amorce MTIC 077.

Fig 44 : Dendrogramme UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic means) chez les differents ecotypes de M. Truncatula base sur le marqueur EST-SSR (MTIC 077)

Fig 45 : Profiles des marqueurs EST-SSR des differents ecotypes de M. truncatula generes par l’amorce MTIC 335.

Fig 46 : Dendrogramme UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic means) chez les differents ecotypes de M. Truncatula base sur le marqueur EST-SSR (MTIC 335)

Fig 47 : Dendrogramme UPGMA chez les differents ecotypes de M. Truncatula base sur les quatre marqueurs EST- SSR.

Fig 48 : Courbe d’etalon utilisee lors du dosage des proteines solubles

Fig 49 : Spectrophotometre a UV visibles utilise pour le dosage des proteines.

Fig 50 : Principales etapes de l’electrophorese SDS-PAGE

Fig 51 :Testde qualite d’ADN a partir de jeunes plants des differentes accessions de Medicago truncatula.

Fig 52 : Potentiel hydrique (^w) des differentes solutions d’NaCl employe pour imposer le stress hydrique sur les jeunes plants de M. truncatula

Fig 53 : Poids sec (matiere seche) des jeunes plants des deux genotypes de M. truncatula sous differents traitements de NaCl.

Fig 54 : Materiel vegetal et germination des differentes graines de M. truncatula

Fig 55 : Semis des differentes graines d’accessions de Medicago truncatula

Fig 56 : Differences Agro-morphologiques entre T131 and Jemalong

Fig 57 : Principe de l’electrophorese capillaire

LISTE DES SCHEMAS

Schema 1 : Protocole experimentale pour les analyses biometriques et biochimiques de 4 genotypes de M. truncatula a differentes concentrations de NaCl.

Schema 2 : Etapes de germination des graines sur le dessus de papiers absorbants dans des boites de Petri.

Schema 3 : Protocole d’extraction et analyse des proteines de reserves par electrophorese SDS PAGE

Schema 4. Protocole experimentale pour les analyses biometriques et biochimiques des genotypes : Tru 131, tolerant et Jemalong, moins tolerant, sous differentes concentration de NaCl.

Schema 5 : Protocole experimentale pour les analyses biometrique, physiologique et biochimique au niveau racinaire, de 2 genotypes Tru 131et Jemalong, sous differentes concentration de NaCl.

Schema 6 : Etapes de mesure du potentiel hydrique (¥w) racinaire des 2 genotypes de M. truncatula a differentes concentration de NaCl

Schema 7 : Mesure de l’activite GPX au niveau des racines des 2 genotypes de M. truncatula aux differents traitement par NaCl.

Schema 8 : Extraction et dosage des proteines solubles racinaires de 2 genotypes de M. truncatula (Tru 131 et Jemalong) a differentes concentration de NaCl

Schema 9 : Extraction et analyse des antioxydants de 2 genotypes de M. truncatula a differentes concentrations de NaCl.

Schema 10: Protocole experimentale pour l’analyse moleculaire de la diversite genetique de 11 ecotypes de M. truncatula utilisant les marqueurs EST-SSR

Schema 11 : Extraction et Amplification d’ADN par a partir de jeunes plants des differentes accessions de M. truncatula

Resume

La salinite des sols est l'un des facteurs limitant la production vegetale. L’introduction et l’amelioration des legumineuses comme le genre Medicago, s’avere tres important dans l’amelioration de la productivite pour la fertilisation naturelle des sols.

Avant d’entamer la partie experimental de la these, nous avons effectue une recherche bibliographique qui decrit l’approche biologique de l’adaptation a la salinite de Medicago truncatula Gaertn., du point de vue genetique et physiologique.

Dans cette etude, nous avons evalue la variabilite de quatre genotypes appartenant a la plante modele M. truncatula sous quatre concentrations de stress salin ( 0 , 68 , 102 et 137 mM ) de NaCl. Afin d'evaluer le degre de sensibilite de la radicule, on a mesure la longueur de la radicule par rapport a longueur de la tige. Les resultats ont montre que les genotypes Tru 131 et Tru 673, sont plus tolerants au stress salin que les genotypes juges sensibles Tru 26 et Jemalong qui ont un ratio eleve et avec une faible teneur en proteines de reserves. Nous avons conclu que le genotype tolerant Tru 131 au stress salin, riche en proteines et avec un poids eleve de graines peut etre cultive dans les zones salines et semi-arides en Algerie et la Mediterranee afin d’ameliorer la productivite de ces legumineuses. Bien que le genotype Tru 673 avait une vigueur tres faible des graines, il semble tolerant (un ratio faible) alors qu’il provient de «graines agees ». Ces donnees supplementaires ont montre l'influence de la qualite des graines sur la vigueur des semences et la croissance des racines car les graines contiennent toutes les ressources genetiques de la plante.

Les proteines de reserves de ces quatre genotypes ont ete separees par electrophorese en SDS-PAGE afin d’identifier les bandes proteiques comme marqueurs de tolerance au stress salin. Au total, 20 bandes proteiques de poids moleculaire allant de 10 a >80 kD ont ete enregistre. Parmi ces genotypes, le genotype tolerant Tru 131 represente un maximum de bandes proteiques. Le regroupement (clustering) par UPGMA a revele une variabilite entre les genotypes etudies et sont assembles en trois groupes. La variabilite des profils proteiques suggerent que les genotypes selectionnes peuvent etre une source d’amelioration des cultures au travers des programmes d’hybridation.

L’analyse de l’aptitude germinatif durant la croissance des jeunes plants chez les deux genotypes contrastes appartenant a l’espece modele M. truncatula, a montre un taux de germination et un indice de tolerance eleve chez Tru 131 par rapport a Jemalong. L’analyse des proteines solubles, a presente une synthese elevee en proteines solubles durant l’application du stress salin chez le genotype tolerant Tru 131 par rapport a Jemalong.

L’etude et l’analyse de la partie racinaire a ete etudiee chez ces deux genotypes. Elle a montre que le genotype tolerant T131 exprime une meilleure croissance racinaire par rapport a celui de Jemalong et une activite gayacol peroxydase elevee, cet enzyme a un role protecteur contre les molecules (ROS) accumulees lors d’un stress oxydatif. Enfin, l’analyse des antioxydants dans le cas d’une salinite elevee montre une augmentation des quantites d’Ascorbate (ASC-DHA) et de Glutathion (GSH-GSSH) chez le genotype tolerant T131.

Au niveau moleculaire et afin de positionner 9 nouvelles accessions appartenant a l’espece modele Medicago truncatula par rapport aux deux genotypes contrastes au stress salin (Tru 131 et Jemalong), une analyse moleculaire en utilisant quatre marqueurs EST-SSR a ete effectuee. Les resultats ont montre une diversite genetique moderee chez les differentes accessions de Medicago truncatula, etudiees. Ce travail necessite une caracterisation agronomique vis-a-vis du stress salin afin de trouver des relations entre les marqueurs EST-SSR et le phenotype pour la tolerance au stress salin.

Mots cles :

Medicago truncatula Gaertn. - Stress salin - Germination - Antioxydants (ASC,GSH) - Marqueurs Moleculaires EST-SSR

Summary

Soil salinity is an important abiotic stress which significantly affects seedling growth and seed quality. Legumes are very important plants both ecologically and agriculturally because they are able to interact symbiotically with rhizobia for biological nitrogen fixation.

Before beginning the experimental part of the thesis, we conducted a bibliographic search that describes the biological approach to adaptation to salinity of Medicago truncatula Gaertn., Genetic and physiological standpoint.

In order to have more information on early seedling development under salinity stress, it will be interesting to examine radicle growth in comparison to plumule elongation under different salinity stress conditions. In this study, we assessed the variability of four genotypes of the plant model Medicago truncatula under four levels of salt stress (distilled water as control 0, 68, 102 and 137 mM) of sodium chloride (NaCl) solution. In order to evaluate the degree of radicle sensitivity, we measured the plumule length to radicle length ratio. Also, we investigated the relationship between storage protein content, seed weight and salinity tolerance degree. The results show that Tru 131 and Tru 673 genotypes, with a low ratio and high storage protein content, are more tolerant to salinity stress than the sensitive genotypes Tru 26 and Jemalong. We concluded that the most tolerant genotype Tru 131 with rich protein and high seed weight can be cultivated in saline and semi-arid areas in Algeria and Mediterranean regions to improve the legumes productivity. Although, the genotype Tru 673 that had a low seed vigour, appear tolerant (low ratio) despite coming from ‘aged seeds’. This additional data shows the influence of ‘aged seeds’ on seed vigour and root growth because seeds contain all of the genetic resources of the plant.

Seed storage proteins from four genotypes of the plant model Medicago truncatula were electrophoretically separated by SDS-PAGE in order to find protein bands as markers for genotypes characterization in relation to salt stress. A total of 20 protein bands with molecular weight ranging from 10 to > 80 kD were recorded. Among the genotypes, the tolerant genotype (Tru 131) represented maximum number of protein bands. The clustering by UPGMA showed variability between the genotypes studied and are assembled into three groups. The variability of protein profiles suggested that these selected genotypes can be a good source for crop improvement through hybridization programs.

The data analysis of germination aptitude showed that the Tru 131 genotype had the best germinatif ability, compared to (Jemalong). The soluble protein analysis, showed a high protein synthesis during salt stress application in the tolerant genotype compared to the sensitive one (Jemalong).

The results showed also that the tolerant genotype T131 expresses a better root growth compared to Jemalong with a high guaiacol peroxidase activity, which has a protective role against the molecules (ROS) accumulated during oxidative stress. The analysis of antioxidants in the case of high salinity shows increasing quantity of ascorbate (ASC-DHA) and Glutathione (GSH-GSSG) in the tolerant genotype T131.

At the molecular level and in order to position 9 new accessions of the model species Medicago truncatula compared to the two contrasting genotypes to salt stress (Tru 131 and Jemalong), molecular analysis using four EST-SSR markers was performed. The results showed a moderate genetic diversity among different accessions of Medicago truncatula studied. This work requires an agronomic characterization with salt stress in order to find relationship between the EST-SSR markers and phenotype for salt stress tolerance

Keys words :

Medicago truncatula Gaertn.- Salt Stress - Germination - Antioxydants (ASC,GSH) - Molecular Markers (EST-SSR)

INTRODUCTION GENERALE

La luzeme est une plante herbacee de la famille des Fabacees (Papilionacees). Elle est cultivee essentiellement pour la production de fourrage, en culture pure ou en melange, le plus souvent avec des graminees (dactyle, fetuque ou brome).

Medicago truncatula Gaertn est une legumineuse modele annuelle originaire du pourtour mediterraneen (Prosperi et al. 1993). Cette espece est l'une des plantes fourrageres les plus repandues dans le monde avec 33 millions d'hectares en culture pure. Sa culture presente un interet agronomique important qui repose sur un bon rapport production / valeur nutritive du fourrage.

La capacite a pouvoir fixer l'azote atmospherique via la mise en place d'une symbiose avec Rhizobium meliloti au niveau racinaire fait que cette culture ne necessite pas d'engrais azote (Spaink, 2000 ; Perret et al. 2000). Sa composition en acides amines est en outre bien equilibree. Les acides amines essentiels pour l'alimentation animale sont tous presents dans la matiere azotee de cette plante. Enfin, et de maniere plus recente, elle est utilisee pour la production de molecules d'interet pharmacologique lui conferant un attrait industriel non negligeable.

La salinite des sols est l'un des facteurs limitant la production vegetale. L’introduction et l’amelioration de ces legumineuses, s’avere tres important pour la fertilisation naturelle des sols.

En particulier, le rendement de cette legumineuse presente differents degres de sensibilite au stress salin. Bien que les effets des stress dependent du stade de developpement de la plante, des techniques culturales et des conditions climatiques et edaphiques, plusieurs criteres physiologiques, biochimiques et moleculaire ont ete proposes pour un tri a grande echelle avant les essais de mise en culture en champ. Ceci, correspond a des tests qui reposent sur certains traits precis biochimique, physiologique et moleculaire qui sont directement correles a la tolerance aux stress abiotiques.

Medicago truncatula est largement utilise comme une plante legumineuse modele pour comprendre la tolerance aux stress abiotiques (Young et Udvardi, 2009). Ainsi, la longueur de la racine et de la tige fournissent des indications importantes de la reponse de la plante au stress salin (Jamil et Rha, 2004). La comprehension de la relation entre le developpement des jeunes plants, les conditions environnementales et la qualite des graines au niveau physiologique et agronomique sont des objectifs fondamentaux de la science des semences (Blaha et Pazderu, 2013).

Les proteines qui s'accumulent dans les plantes dans des conditions salines peuvent fournir une forme de stockage de l'azote qui est reutilisee plus tard (Singh et al, 1987 ; Pareek et al. 1997), et jouent un role dans l'ajustement osmotique. Il est interessant de rechercher une relation entre la teneur en proteines de reserves et la tolerance au stress salin.

Les graines de Medicago truncatula accumulent une large quantite de proteines a la maturite jusqu’a 32 - 42 % du poids sec (Djemel et al. 2005). Ce genre de proteines sont consideres comme des facteurs influenqant sur la diversite genetique (Rodrigues-Quijano et al. 2001) . Ils sont polymorphes et extremement stables (Valero et al. 2009). La methode SDS-PAGE est une technique adequate pour differencier les varietes et sont utilises avec succes dans revaluation de la diversite genetique (Sharma and Maloo, 2009).

La salinite elevee affecte les plantes causant un stress hyper-osmotique et un desequilibre ionique, generant des effets secondaires comme l’accumulation des elements (ROS : reactive oxygen species) tres toxique pour la plante (Hasegawa et al. 2000, Zhu 2001). Les enzymes antioxydants jouent un role crucial dans la protection des tissus des plantes sous condition de stress abiotiques (Fotopoulos et al. 2010). L’etude au niveau racinaire de ces enzymes antioxydants est importante dans la comprehension de la tolerance a la salinite chez Medicago truncatula.

Au niveau moleculaire, des methodes fondees sur l’amplification enzymatique in vitro de fragments d’ADN specifiques par la technique PCR, ont ete appliquees chez les « Medics » pour l’analyse du polymorphisme sur l’ensemble du genome, qu’il soit ou non traduit en proteines. Les microsatellites (SSR) sont les plus utilises en genetique. Recemment, on utilise les etiquettes de sequences exprimees de microsatellites appeles EST-SSRs. Ce sont des ressources importantes pour l’investigation de la diversite genetique et le developpement moleculaire. Ce sont des marqueurs utiles pour des applications divers en genetique et amelioration des plantes car ces marqueurs montrent une variation dans la partie exprimee dans le genome. Les amorces EST-SSR sont connues d’etre moins polymorphes compares avec les SSRs genomiques dans le domaine vegetale a cause de la grande conservation des sequences d’ADN dans les regions transcrites (Scott et al. 2000).

Notre travail a pour objectif de selectionner le genotype le plus tolerant au sel parmi differents genotypes de l’espece Medicago truncatula Gaertn. L’etude a pour but egalement de rechercher un eventuel marqueur physiologique, biochimique (Analyse des antioxydants) et moleculaire (EST-SSR).

Notre these s’organise en six chapitres :

Le premier chapitre est une synthese bibliographique relative a la biologie de l’adaptation a la salinite de Medicago truncatula Gaertn. qui comprend cinq facettes : Les legumineuses, le modele Medicago truncatula Gaertn., l’adaptation des legumineuses au stress hydrique et salin, variabilite genetique des plantes, aspect genomique de Medicago truncatula Gaertn.

Dans le deuxieme chapitre, nous abordons l’effet du stress salin sur le developpement des jeunes plants des differents genotypes de Medicago truncatula, et rechercher une relation entre le poids et la teneur en proteines de reserves des graines de depart et la tolerance au stress.

Le troisieme chapitre a pour objet l’analyse de la diversite genetique des proteines de reserves par electrophorese.

Le quatrieme chapitre, est consacre a l’analyse du comportement de deux genotypes contrastes de Medicago truncatula vis-a-vis du stress salin

Dans le cinquieme chapitre, nous tontons la caracterisation physiologique et biochimique de la racine chez les deux genotypes contrastes de Medicago truncatula sous stress salin.

Enfin, le sixieme chapitre, fait l’objet d’une analyse de la diversite genetique de differents ecotypes de Medicago truncatula par des marqueurs moleculaires de type EST-SSR. Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Chapitre 1 Biologie de l’Adaptation a la Salinite de Medicago truncatula Gaertner : Revue bibliographique

Biologie de l’Adaptation a la salinite de Medicago truncatula Gaertner

Afin de contribuer efficacement a la lutte contre les changements climatiques, la culture des legumineuses s’avere une bonne alternative pour contrer les aleas de l’environnement tels que les stress biotiques et abiotiques. Comme reine des fourrageres, la luzerne annuelle (Medicago truncatula Gaertner) est l'une des plantes modeles les plus repandues dans le monde. Nous allons aborder dans ce chapitre, les caracteristiques biologiques de ce genre de legumineuse et leurs interet agronomique, ainsi que les mecanismes d’adaptation a la salinite des sols qui touche beaucoup notre pays et le aussi le pourtour mediterraneen.

1. Les legumineuses

Les legumineuses (Fabacees) sont une grande famille tres diversifiee qui comprend des plantes herbacees annuelles jusqu’a des arbres perennes (Fig 1). Ces plantes sont des composantes essentielles dans les ecosystemes terrestres du a leur capacite a fixer l’azote atmospherique dans les nodules symbiotiques, et elles sont donc d’excellents colonisateurs des environnements pauvres en azote.

Le partenaire bacterien de cette symbiose, appartenant a la famille des Rhizobiacees reduit l’azote a l’interieur des nodules grace a la nitrogenase. L’activite de cette enzyme est inhibee par l’oxygene d’ou la presence dans les nodules fonctionnels de la leghemoglobine regulant les taux d’oxygene libre. L’interet agronomique des legumineuses a son origine dans cette fixation symbiotique de l'azote qui leur permet de produire en abondance des proteines en l’absence de fertilisation azotee.

Les legumineuses avec plus de 18,000 especes sont la troisieme plus grande famille de plantes superieures et la deuxieme plus importante pour les paturages d’interet agricoles, apres les poacees (graminees) qui incluent la canne a sucre et les cereales tels mais, riz, ble, orge, avoine, seigle et millet (Young et al. 2003 ; de Faria et al. 1989). La capacite de differencier des nodules sur leurs racines hebergeant des bacteries symbiotiques capables de fixer l’azote a ete demontree pour 88% des especes examineesjusqu’a cejour (de Faria et al. 1989).

Depuis le debut de la civilisation, les graines et gousses (fruits specifiques des legumineuses) ont joue un role tres important dans l’alimentation humaine, car elles constituent une source de proteines (legumineuses proteagineuses : le pois, la feverole, le haricot, le pois chiche, les lentilles) et de lipides (legumineuses oleo-proteagineuses : le soja et Farachide). Les legumineuses sont aussi une source importante de fourrage pour les animaux (luzerne, trefle).

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Fig I : Classification de la famille des Papilionoideae (Zhu et al. 2005)

1.1. L’azote dans la nutrition des plantes

L’azote est l’un des elements majeurs de la vie. C’est le quatrieme constituant des plantes qui est utilise dans l’elaboration de molecules importantes comme les proteines, les acides nucleiques et la chlorophylle. C’est le constituant principal de l’atmosphere terrestre sous forme d’azote gazeux (N2) mais les plantes n’ont pas la capacite de l’assimiler directement. Les plantes absorbent l’azote dans le sol sous forme de nitrates (NO3") et d’ammonium (NH4+). L’importance relative de chacune de ces formes depend de l’espece vegetale et des conditions du milieu. Mais les legumineuses peuvent aussi acquerir l’azote grace a leur aptitude a etablir une symbiose avec des bacteries du sol collectivement appelees Rhizobium. Dans ce cas, elles ne necessitent pas l'apport d'engrais azotes, a la difference des cereales ou des oleo-proteagineux comme le colza et le tournesol. La fertilisation azotee des plantes joue donc un role important dans l'accroissement de l'effet de serre. Cela est ruineux economiquement tout en creant une pollution importante car souvent les nitrates sont lessives lors des pluies et atteignent la nappe phreatique (Link et al. 2006). La culture des Legumineuses represente donc le meilleur moyen de produire des proteines tout en respectant l'environnement: c’est un bel exemple de culture dans le cadre d’une agriculture durable. Chez les especes fourrageres, et plus particulierement chez la luzerne, les acides amines sont consideres comme etant le pool d'azote le plus rapidement mobilisable, tandis que les proteines solubles forment le pool d'azote quantitativement le plus important (Ourry et al. 1994).

1.3. Teneur en proteines

Dans l’alimentation humaine, les legumineuses et les cereales constituent deux sources de proteines complementaires. En effet les proteines provenant des cereales sont deficientes en Lysine, et les legumineuses a graines sont deficientes en acides amines sulfures et en tryptophane (Wang et al. 2003). C’est pour cette raison que dans la majorite des centres de domestication, les legumineuses et les cereales ont ete associees (Gepts, 2004). Graham et Vance (2003) estiment que les legumineuses fournissent pour l’Homme environ le 1/3 des proteines alimentaires. Pour le cheptel, les legumineuses fourrageres representent une source d’alimentation riche en proteines, fibres et energie. Elles sont a la base de la production de lait et de viande (Russelle, 2001). La luzerne (Medicago sativa L) represente le fourrage le plus repandu dans les zones a climat tempere (Russelle, 2001). Cette plante apporte de nombreux elements a la ration donnee aux animaux. Elle leur fournit d'abord une part importante des proteines necessaries a leur croissance, de la Betacarotene et des fibres indispensables a la digestion chez le ruminant. D’autres especes sont aussi importantes pour le paturage dans les zones temperees comme les trefles (Trifolium spp.), le lotier (Lotus corniculatus L), le melilot (Melilotus spp.) et la vesce (Vicia spp.). Ces especes sont largement representees autour du Bassin Mediterraneen. Certaines d’entre eux peuvent jouer un role important dans l’amelioration de la production pastorale et/ou fourragere. Lotus creticus presente une bonne resistance au sel et peut supporter les eaux saumatres (Foury, 1954).

1.4. Les legumineuses dans les systemes de culture

Utilisees en rotation ou en association dans les systemes de culture, les legumineuses apportent une certaine contribution en azote en fixant et en integrant une partie de l’azote atmospherique. Les residus des legumineuses sont plus riches en azote et contribuent a enrichir le sol en cet element. Les cultures succedant aux legumineuses peuvent aussi beneficier indirectement de l’azote fixe par l’entremise des residus laisses par la legumineuse (Chalck, 1998). Il est maintenant bien etabli que les precedentes legumineuses augmentent generalement les rendements des cultures non fixatrices d’azote mais cet apport d’azote atmospherique n’explique pas toujours les rendements souvent tres eleves des cultures succedant aux legumineuses. D’autres effets benefiques des legumineuses semblent intervenir dans l’accroissement des rendements et certains auteurs comme Chalck (1998) preferent le terme ‘effet rotation’ pour designer cet effet positif des legumineuse sur la culture suivante. Certains auteurs attribuent l’effet benefique des rotations a l’amelioration des proprietes physiques et biologiques des sols et a la capacite de quelques legumineuses a solubiliser des phosphates de calcium et le phosphore par leurs exsudats racinaires.

2. Le modele Medicago truncatula Gaertn.

La plus vieille reference connue de culture de la luzeme cultivee (Medicago sativa L) date de 1300 ans avant J.C en Turquie. Mais son extension en Europe n’a debute reellement qu’avec l’empire romain (Genier et al. 1992), meme si les pheniciens l’ont introduite dans le bassin mediterraneen occidental. A la fin du XVIII siecle, sa zone de culture est mondiale (Michaud et al. 1988). Le genre Medicago fait partie de la famille des Papilionacees. Il existe plus specialement sur l’ensemble du pourtour mediterraneen vingt autres especes de luzernes perennes a allogamie non stricte, diploides ou tetraploides, et trente quatre especes annuelles ou « Medics » toutes autogames, et diploides a l’exception de deux d’entre-elles (Lesins et Lesins. 1979). Jusqu'aux annees 1990s, il n’existait que deux plantes modeles. La premiere plante modele Arabidopsis thaliana (L.) Heynh ; de la famille des cruciferes, a permis des progres considerables dans la connaissance des bases moleculaires de la biologie des plantes. Le sequenfage de son genome (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000), a permis d’avoir des outils de genetique et de genomique disponibles pour accelerer la recherche. Arabidopsis thaliana au fait de sa petite taille, son petit genome nucleaire, son cycle phenologique et sa tres grande production de graines. La deuxieme plante modele fut le riz pour les monocotyledones (cereales) qui sont le groupe de plantes cultivees le plus largement. Cependant, ces deux especes ne sont pas suffisantes pour representer toute la diversite biologique du monde vegetal (Adam, 2000). Il fallait surtout trouver une plante representative d'un des taxons vegetaux les plus importantes : les legumineuses. Ni Arabidopsis ni le riz ne font des symbioses fixant l’azote atmospherique.

De plus, contrairement a la majorite des especes vegetales, Arabidopsis est incapable d’etablir une symbiose mycorhizienne. Dans l’objectif d’avoir un systeme genetique simple pour les legumineuses, Medicago truncatula a ete choisie comme espece modele par de nombreux laboratoires. Au contraire de la majorite des legumineuses, M. truncatula est bien accessible aux outils moleculaires et aux analyses genetiques. Elle est donc adaptee a l’etude des mecanismes biologiques des grandes fonctions specifiques aux legumineuses.

La luzerne tronquee (Medicago truncatula Gaertn. = Medica. Tribuloides Dsr.) est une espece vegetale herbacee des regions mediterraneennes. Elle appartient a la famille botanique des Fabacees, plus couramment nommees Legumineuses ou Papilionacees. Cette famille rassemble environ 650 genres et 20.000 especes (Doyle et Luckow, 2003). Ces plantes peuvent etre des arbres (ex :Cytise), des arbustes (Genet), des lianes (Glycine) ou des plantes herbacees (Trefle). Le regroupement en famille est etabli par phylogenie moleculaire basee sur la variabilite de marqueurs chloroplastiques. La proximite genetique induit une morphologie commune.

Elle a d’ailleurs ete le premier critere de classification des especes vegetales, etabli par Linne au XVIIIe siecle.

C’est une plante annuelle herbacee, ramifiee au port souvent rampant de 15 a 80 cm de long. Elle porte des feuilles trifoliolees. Ses petites fleurs jaunes de 5 a 8 mm donnent apres autofecondation des gousses cylindriques tres dures, renfermant 4 a 6 graines. Les spires jointives de la gousse portent des epines recourbees perpendiculaires au plan des spires. Les graines de cette plante ont une duree de vie importante superieure a 40 ans, et une dormance qui peut etre levee facilement (Lesins et Lesins, 1979). Selon ces memes auteurs, M truncatula a un cycle de vie court qui varie de2a3 mois. C’est une espece prolifique puisque chaque plante produit 500 a 1000 graines. Elle peut etre egalement multipliee aisement par bouturage. Cette espece possede un habitat variable. Elle predomine au niveau des stations seches, des sols lourds, marneux ou argileux.

Chez les Legumineuses, l’organe reproducteur est commun a toutes les especes : la fleur presente une corolle papilionacee et evolue en fruit de type gousse. Une particularite importante des Legumineuses est leur relation vis-a-vis de l’azote. De maniere generale, les plantes utilisent l’azote mineral puise dans le sol, essentiellement sous forme nitrique (N03). En plus de cette source, les legumineuses fixent l’azote gazeux atmospherique (N2). Plus exactement, ce sont les bacteries telluriques du genre Rhizobium, vivant en symbiose avec la plante qui sont capables de cette fixation. La plante cree un micro-habitat favorable au developpement bacterien. Les bacteries sont abritees dans les tissus racinaires, le tout formant des nodosites. Communiquant directement avec les vaisseaux conducteurs, les bacteries refoivent les elements carbones issus de la photosynthese.

Elles fournissent a la plante l’azote reduit sous forme ammoniacale (NH4), issu de l’activite de l’enzyme nitrogenase. Le fonctionnement de cet enzyme est favorise par la reduction de la teneur en dioxygene au niveau des nodosites, grace a la presence de la leghemoblobine (LegHb), hemoproteine typique proche de l’hemoglobine, qui fixe le dioxygene. La partie proteique de la LegHb est synthetisee par la plante et l’heme par la bacterie.

D’un point de vue economique, les Legumineuses occupent une place importante. Les pois, les haricots et les lentilles, par exemple, sont consommes pour leur interet nutritionnel, qui consiste notamment en apport proteique. Les oleoproteagineux tels que l’arachide et le soja sont une source d’huile et de tourteau proteique pour l’industrie agroalimentaire. La luzerne et le trefle sont utilises dans l’alimentation animale comme fourrage. En agriculture, dans un systeme de rotation de culture, les Legumineuses permettent de fertiliser les sols en azote, limitant les apports d’engrais industriels / artificiels / polluant la nappe phreatique.

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Fig 2 : Fleurs, feuilles, gousses et graines chez la legumineuse modele Medicago truncatula Gaertn. (http://www.tela-botanica.org/)

2.1. Interet Biologique

Recemment, l’interet fut focalise sur M. truncatula comme systeme pour examiner la grande richesse de production de metabolites secondaires par les legumineuses (Gepts et al. 2005) et la resistance aux maladies (Frugoli et Harris 2001). Cette plante est aussi largement etudiee pour analyser le determinisme des symbioses endomycorhiziennes lui permettant de prelever le phosphore du sol (Journet et al. 2001).

2.2. Interet Agronomique

Les especes annuelles du genre Medicago presentent un interet economique tres important. Ces plantes fourrageres sont souvent utilisees dans les systemes de rotation. L’Algerie se trouve parmi les pays qui presentent un besoin reel en fourrage. Le remplacement de la jachere par une culture fourragere sans doute assurera une meilleure integration de l’elevage a l’agriculture. Hormis le role de fixation d’azote atmospherique, ces especes possedent un systeme racinaire tres puissant qui permet l’utilisation des elements fertilisants sur une profondeur rarement atteinte par d’autres cultures. La luzerne est consideree comme une culture ameliorante de la structure et de la texture du sol. La plupart des especes annuelles de Medicago sont originaires du bassin mediterraneen (Prosperi et al. 1993). Elles possedent un interet agronomique majeur pour la production fourragere en zone seche et pour la suppression ou la diminution de l’epandage d’engrais azotes. Leur interet est etroitement lie a leur capacite a se ressemer naturellement d'une annee a une autre. Cette propriete peut aboutir a une installation perenne adaptee aux aleas climatiques des zones mediterraneennes diminuant ainsi le phenomene d’erosion des sols. Par ailleurs, de nombreuses especes et sous-especes de Medicago presentent aussi des caracteres d'interet agronomique, qu'il serait souhaitable d'introduire dans la luzerne cultivee, tels que la tolerance au paturage (capacite d’enracinement et de repousse), la resistance a la secheresse, a la salinite et aux maladies.

2.3. Interet pour la Recherche en Genetique Fondamentale

De nombreuses recherches focalisees sur la plante modele Arabidopsis thaliana ont permis des progres considerables dans la connaissances des bases moleculaires de la biologie des plantes ; avec l’achevement du sequenfage du genome d’Arabidopsis, la palette complete des outils de genetique et de genomique maintenant disponibles devrait encore accelerer le rythme des decouvertes. De son cote, le riz fait l’objet de rapides developpements genomiques en tant que modele pour les monocotyledones.

Cependant, il est clair que ces deux especes ne suffisent pas pour representer le monde vegetal dans toute sa diversite biologique ; Ce fait est particulierement bien illustre par le cas des legumineuses (Fabacees) qui represente l’un des taxons les plus importants, tant du point de vue de la biologie et de l’ecologie fondamentales que du point de vue agronomique et environnemental.

C’est pourquoi Medicago truncatula est actuellement une plante modele pour la genetique moleculaire des symbioses avec les microorganismes du sol comme les bacteries Rhizobium pour la symbiose fixatrice d’azote (Journet et al. 2001). Historiquement, le choix de Medicago truncatula resulte d’un programme INRA (1985-1986) dont l’objectif etait de definir une espece modele a l’interieur du genre Medicago, afin de l’associer a Shinorhizobium meliloti, le microsymbiote bien etudie de la luzerne et constituer un systeme symbiotique modele plante- bacterie.

M. truncatula est une legumineuse annuelle originaire du pourtour mediterraneen et proche de la luzerne cultivee M. sativa. Elle est diploide (2n=16) et autogame, produit des graines en abondance avec un temps de generation de 10 a 12 semaines (de graine a graine). La taille de son genome est d’environ 500 mega-bases/ une cellule, c'est-a-dire trois a quatre fois superieure a celle d’Arabidopsis thaliana et equivalente a celle du riz. La biodiversite de l’espece M. truncatula est caracterisee par une forte variabilite morphologique et genetique intra et inter populations et par une importante homozygotie au niveau individuel.

Le partenaire bacterien de cette plante modele est le plus etudie parmi les bacteries rhizobiales et le sequenfage du genome de la souche de reference de S. meliloti 1021 a ete acheve (Capela et al. 2001). M. truncatula a permis d’identifier un grand nombre de genes relies a la symbiose dont certains ont deja ete isoles, sequences et leur expression etudiee (Gamas et al. 1996; Ane et al. 2002 ; Amor et al. 2003 ; Levy et al. 2004).

2.4. Correlation entre la diversite moleculaire et phenotypique

La question de base est: la variation moleculaire est-elle correlee avec la variation genetique quantitative observee dans les populations biologiques ? Les EST-SSRs sont associes avec differents locus qui codent pour des elements fonctionnels de proteines et servent comme elements de transcription (Kashi et al. 1997). Ils presentent un haut niveau de mutations spontanees du nombre de repetitions, ce qui peut causer une variation quantitative dans la fonction des proteines et l’activite des genes. La valorisation des ressources genetiques passe par une accumulation de donnees prealables sur les bases genetiques de caracteres agronomiques cibles. Ainsi, plusieurs techniques de phenotypage rapide (ex chez Arabidopsis) sont developpees pour etudier un grand nombre de genotypes avec des moyens reduits (Loudet et al. 2007).

II est etabli que Medicago truncatula peut etre utilisee pour des approches multidisciplinaires reliant des domaines tres divers. A long terme, un impact des recherches integrant les informations genetiques et fonctionnelles est attendu pour etendre les connaissances appliquees a la recherche agronomique des legumineuses economiquement importantes.

Ces connaissances permettront une meilleure caracterisation et identification des genes et caracteres impliques dans des resistances aux maladies et lies a une amelioration de la productivite des cultures sous differentes contraintes environnementales.

2. 5 . Biologie de la graine chez Medicago truncatula

La graine est un des facteurs de dissemination des especes vegetales. Elle est issu de reproduction sexuee allogame (fecondation croisee entre deux individus) ou autogame (autofecondation). L’individu forme est donc different de la plante mere. Chez beaucoup d’especes, la reproduction vegetative complete voire supplante la reproduction sexuee. Elle se fait alors a partir de tiges specialisees (stolons de fraisier, rhizomes de begonia, tubercules de pomme de terre), ou bien de bulbilles, qui se developpent sur les cote des bulbes (ail, oignon, tulipe...), ou enfin a partir de racines drageonnantes, racine horizontales sur lesquelles se developpent des tiges dressees (framboisier, prunellier). En revanche, pour de nombreuses especes annuelles, la graine est l’unique vecteur de propagation. C’est le cas notamment pour les plantes cultivees que sont le ble, le mais, le soja... etc. La graine est constituee de plusieurs types de tissus d’origines differentes : l’embryon, l’albumen et les teguments (Fig 3). L’embryon et l’albumen sont issus de la fecondation. L’embryon, qui represente l’element principal de la graine, est totalement reconvert de l’albumen. Ce dernier constitue, chez les cereales, la zone de stockage des reserves necessaries au developpement de la plantule avant l’acquisition de l’autotrophie. C’est le cas egalement pour certaines especes dicotyledones (graines albuminees, ex : ricin) mais pour les autres, ce sont les cotyledons de l’embryon qui assument ce role (graines exalbuminees).

A la peripherie de la graine, on retrouve les teguments, enveloppes protectrices plus ou moins resistantes. Elles sont d’origine maternelle et derivent des tissus de l’ovaire (Fig 3).

La nature des reserves energetiques varie selon les especes. Elles peuvent-etre glucidiques du type amidon, chez le riz par exemple, lipidiques (colza, tournesol...), proteiques (luzerne), oleo-proteiques (arachide) ou gluco-proteiques (pois). L’interet nutritionnel ou industriel des plantes cultivees pour leurs graines reside dans leur capacite a produire des substances de reserve. Beaucoup de travaux de recherche ont pour objectif l’amelioration de la qualite et de la quantite de ces reserves. La graine est alors consideree comme un produit final et non comme une semence, point de depart crucial dans le developpement d’une nouvelle plante.

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2.5.1. Phase de maturation de la graine

Apres l’etape de l’embryogenese survient l’etape de maturation de la graine qui correspond a des processus de preparation a la quiescence et a la germination. La maturation debute vers 12 jours apres la pollinisation chez Medicago. Elle se caracterise par une croissance exercee par extension cellulaire et non plus par proliferation. Les graines verdissent, temoignant de l’accumulation de chlorophylle, les cotyledons subissent une endopolyploi'disation, les substances de reserves sont synthetisees et stockees dans les tissus. La maturation correspond egalement a l’acquisition du pouvoir germinatif et de la mise en place de la tolerance a la dessiccation. Ces evenements ont lieu respectivement vers 14 JAP et 16-20 JAP chez Medicago (Boudet et al. 2006). Les principales proteines de reserve chez les Legumineuses sont la legumine (11S) et la viciline (7S). Elles sont codees par une famille multi-genique qui comprend au moins quarante membres chez le pois (Casey et al., 1986). Elles sont accumulees dans des corps proteiques qui integrent les vacuoles de stockage proteiques (PSV) originaires du Golgi principalement dans les cotyledons mais aussi dans l’axe embryonnaire chez le mais, le soja, le pois et le coton (Alekseeva et Kobarskaya, 1979; Tsai, 1979; Alekseeva et al. 1989 ; Vigil and Fang, 1995).

L’accumulation de ces proteines est regulee dans l’espace mais aussi dans le temps. Chez Medicago truncatula, les transcrits de la viciline apparaissent avant ceux de la legumine A (Abirached-Darmency et al. 2005). L’accumulation d’ARNm est visible des 12 jours apres pollinisation (JAP). A 16 JAP, l’expression des genes est forte et se repartit de maniere heterogene dans les cotyledons, les cellules adaxiales montrant une plus forte accumulation.

Il existe en effet un gradient de differentiation dans les tissus embryonnaires : les cellules cotyledonaires adaxiales, en comparaison avec les cellules abaxiales, sont les premieres a ralentir leur proliferation et a entrer en differentiation. L’accumulation des proteines dans les graines depend de l’azote disponible. La glutamine et / ou l’asparagine circulant dans le phloeme sont metabolisees dans les teguments de la graine (Lanfermeijer et al. 1990 ; Rochat et Boutin, 1991) et les acides amines distribues principalement sous forme glutamine, threonine et alanine (Lanfermeijer et al. 1990). Toutes les graines n’ont pas une capacite identique de tolerer la dessiccation. Les graines peuvent perdrejusqu’a 90 % de leur contenu en eau avant d’atteindre le stade de dormance (absence d’activite du metabolisme). Cet etat leur permet de survivre a des conditions extremes (ex : hiver) et de favoriser la dispersion de l’espece. Cependant, cette tolerance est perdue des que la germination se met en place.

Des graines de nombreuses especes ont fait l’objet d’etudes approfondies, telles que Arabidopsis thaliana (Parcy et al. 1994), le coton (Gossipium hirsutum ; Baker et al. 1988), l’orge (Hordeum vulgare ; Espelund et al. 1995), le mai's (Zea mays ; Pages et al. 1993), le ricin (Ricinus communis ; Han et Kermode, 1996) et le riz (Orysa sativa ; Mundi et Chua, 1988). Un des problemes majeurs de ce type de systeme est d’arriver a dissocier les genes impliques dans la tolerance de ceux impliques dans le developpement.

Des mecanismes de protection sont mis en place dans les tissus des graines au cours de la maturation afin de proteger les structures cellulaires des dommages causes par le retrait de l’eau. Il y a une accumulation de sucres, des composes amphiphiles et de proteines specifiques : Heat Shock Protein (HSP) et Late Embryogenesis Protein (LEA). Le metabolisme cellulaire est egalement ajuste pour eviter l’accumulation de composes reactifs de l’oxygene (ou ROS : Reactive Oxygen Species) et d’acetaldehyde. Une des decouvertes majeures liees a l’utilisation de ce type de systeme sont les proteines LEA (Late Embryogenesis Abundant). Les proteines LEA sont, comme leur nom l’indique, accumulees au cours des phases tardives de la maturation des semences (Dure et al. 1981; Galau et al. 1986). Les ARNm de ces proteines apparaissent des le debut de la deshydratation des graines et sont accumules jusqu’a leur maturation, pour devenir au final la population de messagers la plus abondante dans les tissus deshydrates.

La quantite de ces ARNm diminue quelques heures apres la rehydratation de l’embryon (Han et Kermode, 1996). Elles le sont aussi en reponse a divers stress abiotique et a l’ABA (Kermode, 1990 ; Skriver et Mundy, 1990 ; Ramanjulu et Bartels, 2002) et chez l’organisme anhydrobiote Craterostigma plantagineum (Bartels et al. 1990; Piatkowski et al. 1990). Les proteines HSP ont ete identifies chez les graines soumises a un stress thermique (Abernethy et al. 1989). Elles sont accumulees a la fin de la maturation comme les proteines LEA.

2.5.2. Phase de germination de la graine

Apres la phase de quiescence, voire de dormance, et lorsque les conditions de l’environnement sont favorables, le developpement de l’embryon reprend. L’axe embryonnaire s’allonge alors dans les deux sens. L’hypocotyle, qui presente un gravitropisme negatif, amene le meristeme apical et les cotyledons hors de terre. Les cotyledons fournissent les reserves energetiques qui sont alors mobilisees pour la croissance. Ils verdissent, signifiant l’acquisition de l’activite photosynthetique avant la mise en place des premieres feuilles a partir du meristeme apical. La radicule, elle, possede un gravitropsime positif et permet au meristeme racinaire de s’enfoncer pour developper des racines. Elle est la premiere a se developper au cours de la germination chez Medicago truncatula.

Entre le stade de graine seche quiescente et le developpement de la plantule existe une phase transitoire qui se termine lorsque la radicule perce les teguments.

A ce moment, la graine est consideree comme germee. La germination est done definie comme la phase transitoire entre le stade graine seche et l’apparition de la radicule (Bewley et Black, 1994). Elle debute avec l’imbibition des tissus. Il est possible de suivre cette phase par mesure de la prise d’eau des graines. On distingue alors trois etapes caracteristiques. La premiere correspond a une imbibition rapide au cours de laquelle les tissus se rehydratent rapidement. Cette etape est marquee par une forte reprise de l’activite metabolique.

Les structures et les enzymes necessaries a cette reprise d’activite sont suppose avoir resiste a la deshydratation et etre presentes dans les graines seches (Bewley, 1997).

La deuxieme etape se caracterise par un ralentissement de la prise d’eau et de l’activite respiratoire. C’est a ce stade que se preparent les evenements metaboliques associes a l’allongement de la radicule. L’emergence de la radicule clot cette deuxieme etape et coincide avec la perte de la tolerance a la dessiccation.

La troisieme et derniere phase correspond a l’allongement de la radicule, une nouvelle absorption d’eau et une intensification de l’activite respiratoire due a la biogenese de mitochondries. Cette derniere phase, dite de croissance, amorce la mobilisation des reserves et le developpement de la plantule ; elle n’est pas consideree comme faisant partie de la germination au sens strict. La germination est soumise aux conditions de l’environnement. La presence d’eau est necessaire pour l’hydratation des tissus et pour la croissance des organes. Neanmoins, si l’eau vient a manquer apres l’imbibition, la graine est capable de subir un nouveau processus de deshydratation et d’attendre un prochain afflux d’eau. La capacite germinative reste identique, et lorsque les conditions redeviennent favorables, la croissance est plus rapide et, au sein d’un lot de graines, la germination est plus homogene. Ce phenomene est exploite en agronomie (« amorfage » ou priming) mais presente l’inconvenient d’une diminution de la longevite, surtout si les graines ont ete sechees rapidement (Soeda et al. 2005).

En revanche, des que la radicule a perce les teguments, un retour en arriere est impossible et une restriction d’eau conduit a la mort de la plantule (perte de la tolerance a la dessiccation). La teneur en oxygene est egalement importante pour la reprise de l’activite metabolique. Meme si l’embryon s’est developpe dans une atmosphere appauvrie en oxygene, a ce stade, la croissance n’est plus possible dans des conditions hypoxiques. Le riz represente cependant une exception. Cette espece germe sous l’eau en developpant un coleoptile qui emerge a la surface et permet l’apport d’oxygene, les processus fermentaires etant prolonges jusqu'alors (Magneschi et Perata, 2009). La cinetique de germination est regulee par la temperature, l’optimum variant d’une espece a l’autre selon le milieu auquel elle est adaptee. Pour Medicago truncatula, cet optimum se situe a21°C environ.

La germination est egalement influencee par l’eclairement. Selon les especes, cette influence est le plus souvent positive.

La lumiere est perfue par la graine au niveau des phytochromes qui sont impliques dans la modulation des hormones endogenes GA et ABA (Seo et al. 2009). Chez Medicago, la condition optimale est l’obscurite et la lumiere diminue la vitesse de germination.

2. 6. Mobilisation des reserves chez les plantes

A la germination des graines, qui requiert une activite enzymatique tres importante pour la mobilisation des reserves et le developpement de l’embryon, on assiste a une reprise des syntheses d’enzymes et parallelement a une synthese de gibberellines. Des la fin de la phase d’imbibition, les reserves de l’albumen ou des cotyledons sont mobilisees. Les enzymes necessaries a cette mobilisation sont alors synthetisees en abondance. L’exemple type est celui de la liberation des sucres a partir de l’amidon de l’albumen des cereales sous l’action des gibberellines, laproduction d’amylase est fortement stimulee (Heller et al.1993).

Au cour de la germination des graines (oleagineuses, amylacees et proteagineuses), il y a mobilisation des reserves par differentes hydrolases, lipases et / ou proteases dans une chronologie qui reste a determiner. Selon les especes, ces reserves peuvent etre majoritairement de nature glucidique, lipidique et/ ou proteiques. Chez les oleagineuses les travaux ont surtout concernes les lipases degradant les lipides de reserves, enzymes qui ne s’expriment pas ou peu durant les premiers 24 heures d’imbibition et devenant actives de fafon intense durant la periode de germination sensu stricto (Khemiri. H et al. 2004). Turk et al. (2002), ont montre l’interet de l’analyse proteomique des graines d’Arabidopsis thaliana pour la comprehension du processus de germination.

L’etude de la cinetique de germination a montre que l’embryon stocke des proteines et des ARN messagers, l’expression des proteines a ete etudiee et differentes proteines sont definies : des proteines de niveau constant, des proteines dont le niveau s’accroit ou diminue lors de la germination et celles dont le niveau varie lors de la protrusion de la radicule. De maniere generale, apres un jour de germination, les proteines du cytosquelette augmentent; par la suite, les niveaux enzymatiques s’accroissent, les proteines impliquees sont en majorite des enzymes du metabolisme, de meme, il est observe une augmentation des proteines du stress.

3. Adaptation des legumineuses au stress hydrique et salin

Le climat mediterraneen est caracterise par des periodes de secheresse erratiques imprevisibles, ce qui limite considerablement les productions vegetales (Adda et al. 2005).

Dans cette section, il sera fait une revue des caracteres utilisables pour ameliorer l’efficacite de la selection pour l’adaptation a la secheresse suivant deux approches. La premiere approche correspond au cadre d’etude decrit par Kramer (1980), Levitt, (Levitt, 1980), puis Turner (1986, 2000) sous l’appellation de Drought Resistance Framework. Elle identifie classiquement trois grands types de mecanismes : l’esquive (drought escape), l’evitement (avoidance ou dehydratation postponement) et la tolerance (dehydratation tolerance). Chacun des grands mecanismes decrits dans cette classification est sous la dependance d’un certain nombre de caracteres plus ou moins complexes et plus ou moins faciles a identifier. L’interet pour la selection varietale d’une recherche cognitive sur les reponses des plantes au niveau des organes, des cellules et des molecules est incontestable (Baker, 1989). Cependant l’amelioration individuelle des caracteres associes a l’adaptation ne conduit pas toujours a des rendements augmentes en conditions de deficit hydrique (Turner et al. 2001 ; Ludlow et Muchow, 1990). La selection, pour etre efficace, doit s’operer en priorite sur les caracteres dont la «valeur» (pour l’elaboration du rendement) est forte relativement a d’autres caracteres de resistance (Bluma, 1996).

C’est la base de la deuxieme approche appelee Yield Component Framework. L’indice de recolte et les caracteres affectant l’efficience l’utilisation de l’eau par la plante (Passioura, 1977 ; Fisher, 1981) ont ete identifies comme les facteurs principaux d’un modele d’elaboration du rendement en condition de deficit hydrique. Le Yield Component Framework decompose le rendement en composantes physiologiques theoriquement independantes, chacune integrant des processus complexes.

3.1. Mecanismes de resistance et criteres de selection

Ces mecanismes decrits dans le Drought Resistance Framework sont les memes pour toutes les especes vegetales. Cependant, la variabilite genetique qu’ils presentent est dependante de l’espece. Or, la question de la variabilite genetique est centrale pour un programme de selection intraspecifique. Certains caracteres comme le developpement racinaire et la regulation stomatique ont une valeur adaptative universelle, d’autres comme l’accumulation d’ABA ou de proline (Madhusudhan et al. 2002) paraissent presenter moins d’interet, d’autres encore comme l’ajustement osmotique semblent varier beaucoup moins chez les legumineuses que chez les cereales(Subbarao et al. 1995).

Les principaux caracteres impliques dans les trois grands mecanismes principaux de l’adaptation a la secheresse, leur efficacite pour ameliorer le rendement et leur facilite d’utilisation pour la selection des legumineuses. Les principales observations experimentales ayant conduit a cette synthese font l’objet des paragraphes qui suivent:

3.1.1. L’esquive

L’esquive permet a la plante de reduire ou d’annuler les effets de la contrainte hydrique par une bonne adequation de son cycle de culture a la longueur de la saison des pluies. La variabilite genetique pour la longueur de cycle est generalement importante dans les plantes et plus particulierement chez les especes a floraison indeterminee comme l’arachide. Le rendement de nombreuses varietes a ete ameliore grace au raccourcissement des longueurs de cycle (precocite) et ceci chez pratiquement toutes les especes cultivees annuelles (Turner, 2001), sur les legumineuses (Subbarao et al. 1995), comme sur les cereales (Fukai et Cooper, 1995). Ce mecanisme est particulierement efficace dans les environnements avec deficits hydriques frequents en fin de cycle, schema habituel dans les pays saheliens.

3.1.2. L’evitement

Trois grands types de reponses permettent a la plante d’eviter ou, plus exactement, de retarder la deshydratation de ses tissus (Turner et al. 2001). Ce mecanisme est appele « evitement », en anglais avoidance ou parfois dehydratation post-ponement. Le premier groupe de caracteres est lie a l’efficacite de l’extraction de l’eau du sol par les racines. L’aptitude des racines a exploiter les reserves en eau du sol sous stress est une reponse particulierement efficace pour l’elaboration de la production de graines (Passioura 1977). Le deuxieme type de reponse est constitue par la regulation de l’ouverture fermeture des stomates, il conditionne les echanges entre C02 et H20 et par consequent la croissance et la productivite des cultures (Ludlow et Muchow, 1990 ; Turner, 1977). Le troisieme correspond a l’ajustement osmotique que les plantes realisent en reponse au deficit hydrique (Turner, 1986). Lorsque le potentiel hydrique foliaire decroit, le potentiel de turgescence et la conductance stomatique sont maintenus grace a une accumulation intracellulaire de solutes permis par ce mecanisme. La pertinence des caracteres correspondant a ces reponses pour la selection sera discutee pour chacune des trois formes d’evitement definies :

3.1.2.1. La capacite d’extraction de l’eau par le systeme racinaire

Un systeme racinaire capable d’extraire l’eau du sol est un trait essentiel pour la resistance a la secheresse. Cette caracteristique revet une importance particuliere sur les cultures qui subissent regulierement des deficits hydriques de fin de cycle (Khalfaoui, 1990 ; Subbarao et al.1995).

Son impact sur le rendement est particulierement eleve car elle intervient directement dans l’efficience de l’utilisation de l’eau en conditions de stress, un des trois termes de l’equation de Passioura (1977). Cependant, deux types de raisons limitent beaucoup l’utilisation des criteres racinaires par les selectionneurs : L’impraticabilite du criblage au champ pour cette caracteristique sur une grande echelle et la difficulte de correler des observations au champ a celles qui sont faites en pots.

L’absence d’une comprehension precise du role exact des racines en conditions de ressources hydriques limitees (Passioura, 1994) est un autre facteur limitant a la mise en place d’un systeme de criblage econome et efficace.

3.1.2.2. La regulation stomatique

Situee a l’interface entre l’interieur (plus ou moins turgescent) et l’exterieur (plus ou moins sec) des tissus foliaires, les stomates jouent un role fondamental dans la regulation des pertes en eau de l’appareil foliaire. La regulation de l’ouverture-fermeture des stomates depend du potentiel hydrique foliaire et de l’humidite de l’air au champ (Turner, 1977). Une faible conductance conduit a une fermeture des stomates rapide en conditions de deficit hydrique. Les genotypes a faible conductance sont plus sensibles au deficit de vapeur et a la baisse du potentiel hydrique foliaire que les genotypes a forte conductance. Une faible conductance est generalement proposee comme un trait favorable a l’adaptation a la secheresse. Cependant la fermeture stomatique reduit l’assimilation du C02 et conduit inevitablement a une reduction de l’activite photosynthetique.

En consequence, l’interet d’une reponse stomatique plus ou moins rapide au deficit hydrique resulte d’un compromis entre la reduction de l’assimilation du C02 et la necessite d’eviter la deshydratation (Ludlow et Muchow, 1990). Des differences intervarietales existent chez les legumineuses. La mesure de la conductance stomatique et de la transpiration par porometrie exige une homogeneite parfaite des conditions environnementales incompatible avec les mesures sur un grand nombre de genotypes au champ. L’evaluation des reponses des stomates par porometrie n’est donc generalement pas retenue par les selectionneurs pour le criblage de genotypes (Clavel et al. 2004).

3.1.2.3. L’ajustement osmotique

Ce mecanisme permet de maintenir la conductance stomatique et la photosynthese a des potentiels hydriques bas, il intervient aussi en retardant la senescence foliaire et en ameliorant l’extraction de l’eau par les racines (Turner et Jones, 1980). Le niveau d’ajustement osmotique realise par les legumineuses est modeste compare a celui des cereales (Subbarao et al. 1995). La variabilite genetique presente a ete utilisee pour selectionner des lignees de ble et de sorgho (Morgan, 1986).

3. 2. La notion de tolerance au stress hydrique et stability des membranes cellulaires

En reaction a une limitation hydrique, la plante limite l’extension de son feuillage, accroit la profondeur de son enracinement. Une fermeture plus ou moins precoce des stomates s’opere afin de reduire les pertes en eau de la plante par transpiration. Cette regulation stomatique conditionne le statut hydrique des feuilles qui restent turgescentes si les stomates se ferment tres vite.

Le mecanisme de tolerance des membranes cellulaires s’exprime lorsque ces dispositifs peripheriques de protection des cellules ne sont plus efficaces. Le caractere de tolerance sensu stricto le plus connu est la resistance membranaire ou resistance protoplasmique. Elle est le plus souvent mesuree par la methode des efflux d’electrolytes apres choc osmotique au polyethyleneglycol (Blum, 1981).

La tolerance membranaire s’exprime a un niveau particulierement important chez les plantes dites de resurrection qui peuvent reconstituer leurs membranes apres des periodes de plusieurs semaines de deshydratation (Gaff, 1980). Chez les cereales, l’existence d’une relation entre degats membranaires et tolerance a la secheresse semble dependre des genotypes utilises. Elle a ete observee sur les reponses de croissance et la productivite au champ de varietes de ble dur (Bajji et al. 2002). L’hypothese que les plantes resistantes a la secheresse au niveau cellulaire sont souvent capables de garder leurs stomates ouverts et ont donc un fort potentiel d’assimilation du C02 lors de severes deficits hydriques a ete emise lors d’une etude portant sur Phaseolus vulgaris (Costa Franfa et al. 2000). Au niveau moleculaire, un ralentissement du metabolisme proteique et une augmentation du catabolisme des proteines cellulaires en reponse a la contrainte hydrique ont ete observes (Vasquez-Tello et al. 1990) sur Vigna unguiculata. Sur arachide, une relation entre le niveau de tolerance membranaire de differents cultivars et le niveau d’acyl-lipide des membranes a ete mise en evidence (Lauriano et al. 2000).

Certaines enzymes hydrolytiques impliquees dans la reponse des plantes a la secheresse ont ete precisees. Il s’agit d’acylhydrolases (Sahsah et al. 1998 ; Matos et al. 2001), d’une ascorbate peroxydase (Ferrari-Iliou, 2001) d’endoproteases (Cruz et al. 2001) et de phospholipases (El Maarouf et al. 1999). Roy-Macauley (1992) a montre qu’il existe une relation entre le deficit hydrique, le degre de sensibilite de la plante et les activites endoproteolytiques chez les cultivars de V. unguiculata testes. La plante s’autodetruit de fafon plus ou moins regulee via diverses hydrolases pour mieux survivre au stress. Cette hypothese est renforcee par de recents resultats sur la tolerance au stress de l’appareil photosynthetique obtenus grace a l’utilisation de la fluorimetrie.

3.3. Les mecanismes moleculaires de la reponse a la contrainte hydrique

Ces dernieres annees, un nombre important de genes a ete decrit comme repondant a la secheresse au niveau transcriptionnel (Bray, 1997 ; Yamaguchi-Shinozaki et al. 2002). Les produits de ces genes interviennent non seulement dans la tolerance au stress mais aussi dans la regulation de l’expression des genes et dans la transduction des signaux de la reponse au stress (Fig 4). Ces produits de genes induits par la secheresse, ou, plus generalement, par le stress osmotique (stress hydrique, salin et du au froid) peuvent etre classes en deux groupes : les proteines fonctionnelles et les proteines de regulation (fig 5).

La premiere etape de l’activation de ces genes correspond a la perception du signal emis lors de la deshydratation, elle est suivie par une cascade de messagers secondaires qui modifient la concentration du Ca2+ intracellulaire (Fig 6). Differents recepteurs ou senseurs non specifiques repondent a differentes contraintes abiotiques. Ils induisent tous une augmentation du Ca2+ dans le cytoplasme, la production d’antioxydants (Knight, 2000) et une serie de phosphorylations qui activent des proteines impliquees dans la protection cellulaire ou leurs facteurs de transcription.

Par exemple, les voies d’activation des genes codant pour des proteines de type LEA (Late Embryogenis Abundant) ont ete trouvees sur certaines plantes tres resistantes en reponse au stress hydrique (Ingram et Bartels, 1996, Thomashow, 1999). L’activation des LEA pourrait representer les voies de reparation des dommages. La contrainte osmotique induit en particulier des changements dans la composition en phospholipides precurseurs de la production de messagers secondaires via les phospholipases (Fig 6). La phospholipase D (PLD) par exemple est activee par la secheresse (El Maarouf et al. 1999). Elle est impliquee dans une cascade de signaux conduisant a la fermeture des stomates (Jacob et al. 1999). L’existence de cette tres grande variete de genes induits par le stress osmotique suggere des reponses complexes au niveau de la plante (Yamaguchi-Shinozaki et al. 2002). 3. 3.1. Activation transcriptionnelle des genes

De la meme maniere que les fonctions des genes impliques dans la reponse au stress sont tres variees, l’activation de ces genes est sous la dependance de nombreux facteurs. L’acide absicissique (ABA) est produit sous l’influence du stress hydrique et son implication dans la modulation de la teneur en ARNm correspondant a nombreux genes a ete demontree (Bray, 1997). Les voies d’activation des genes induits par la contrainte osmotique sont soit dependantes soit independantes de l’ABA (Shinozaki et Yanaguchi-Shizonaki, 2000). Les genes induits par l’ABA sont souvent des proteines de type LEA ou dehydrine mais peuvent etre aussi des genes impliques dans la synthese des osmolytes, la permeabilite membranaire, le catabolisme ou la reparation cellulaire (Fig 6). L’expression de tous les genes de type LEA est regulee de fafon transcriptionnelle et sous le controle de l’ABA (Wang et al. 2003).

L’induction des genes non gouvernes par l’ABA est modulee par des facteurs de transcription dont les sequences, les plus connues sont de type DRE (Dehydration Responsive Element). Ces sequences ont ete caracterisees et sont activees par le stress osmotique (Lux et al. 1998). La surexpression des genes codant pour des proteines de regulation de type DRE augmente la tolerance des plantes transgeniques correspondantes au froid, au sel et au deficit hydrique (Thomashow, 1999). La regulation de ces genes par certaines enzymes fortement impliquees dans le «turn over » des proteines comme la cysteine proteinase est donc importante pour la tolerance aux contraintes. Cependant, l’utilisation de ces genes pour la transformation doit etre consideree avec prudence car de nombreux metabolites sont produits par la plante en conditions de stress et des modifications sont possibles au niveau post-transcriptionnel et de la traduction (Wang et al. 2003).

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Fig 4 : Representation schematique des reponses moleculaires a la secheresse dans une cellule vegetale (Yamaguchi-Shinozaki, 2002).

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Fig 5 : Genes induits par le stress hydrique et leur fonction possible dans la reponse a la tolerance au stress osmotique (Yamaguchi-Shinozaki, 2002).

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Fig 6 : Representation schcmatiquc des principales voies de signalisation majeures et principaux produits de transcription chcz les plantes en rcponsc au stress osmotiquc. R : rcccpteurs, ΕΛΟ : espcccs activees de l'oxygene, PI-PLC : phospholipase C, PLD : phospholipase D, ΛΒΛ : acide abscissiquc, LEA : « Late Embryongcnis Abundant »,(Diop, 2002).

Au cours de leur existence la plupart des plantes sont soumises a des diminutions de leur contenu relatif en eau et sont capables de produire des structures hautement resistantes a la dessiccation tels que les graines, le pollen ou les spores. Au niveau physiologique, un deficit hydrique peut se produire lors d’une secheresse, d’un froid ou en presence de milieux salins. La plupart des dommages au niveau intra-cellulaire, ainsi que les mecanismes lies a la resistance a ce type de stress, sont encore peu connus. De nombreuses donnees moleculaires, permettent cependant d’elucider les principaux mecanismes cellulaires mis en place par la plante lors d’un stress hydrique. On peut resumer les processus qui surviennent lors d’un stress hydrique selon trois grandes etapes :

- Une decroissance accompagne au niveau cellulaire d’une diminution du nombre de polysomes, d’un ajustement osmotique, d’une modification de l’extensibilite des parois et d’une alteration du metabolisme du carbone et de l’azote.
- Une diminution de la photosynthese, reliee a une augmentation du taux d’ABA et aux dommages dans les thylakoides. En parallele, la transpiration diminue (fermeture des stomates) en meme temps que les solutes compatibles s’accumulent.
- Enfin, une activation des mecanismes lies a la tolerance tels que l’accumulation de dehydrines, de lea, de disaccharides ou d’enzyme impliquee dans la detoxication s’opere. La regulation de la reponse au stress ainsi que sa perception restent encore plus obscures. La encore, des signaux de transduction impliquant l’ABA, des facteurs de transcription et certains elements des promoteurs commencent a etre caracterises. La tolerance a un deficit d’alimentation en eau a ete largement etudiee chez les plantes selon trois strategies basees sur l’etude de systemes tolerants de type « graines » ou « plantes reviviscentes », de mutants provenant de plantes modeles (Arabidopsis), et de l’effet du stress sur des plantes de grandes cultures.

Les systemes tolerants correspondent a certaines categories de graines (Leprince et al. 1993), mais aussi a des plantes telles que Craterostigma plantagineum ou Mesembryanthemum crystallinum (Cushman et al. 1989). Une analyse moleculaire detaillee de ce type de systeme peut permettre de reveler des genes particuliers pouvant contenir l’information necessaire a une resistance accrue face a la dessiccation. Dans un premier temps, nous verrons comment les graines passent par un etape de deshydratation poussee. Dans un second temps, nous aborderons les plantes reviviscentes qui survivent a de longues periodes de secheresse. Enfin nous aborderons les modeles genetiques, qui reposent sur l’analyse de mutants hypersensibles ou resistants au stress hydrique, ainsi que les modeles qui reposent sur des etudes en conditions naturelles.

L’expression des genes en reponse a un deficit hydrique fait intervenir une cascade de transduction du signal extremement complexe qui peut etre divisee en plusieurs etapes. La perception du stimulus, implique l’amplification et l’integration du signal qui va reguler l’expression des genes. Peu de donnees sont disponibles concernant la perception du signal, bien que la variation de la turgescence ait ete proposee comme un signal physique possible. Au niveau moleculaire, Urao et al. (1999) ont identifie chez A. thaliana une proteine membranaire (AtHKl) qui intervient dans la perception du stress hydrique. Cet osmosenseur est essentiellement present au niveau des membranes racinaires en condition normale de croissance, et y est fortement accumule au cours d’un stress hydrique. Il semblerai que cet osmosenseur soit directement relie a une cascade de transduction du signal, faisant intervenir des MAP-kinases. Un modele de choix pour l’etude de la transduction du signal est la levure (S. cerevisiae). En effet cet eucaryote unicellulaire possede les memes types de signaux de transduction que ceux presents chez les eucaryotes superieurs. Maeda et al. (1994 et 1995) ont par exemple isole des osmosenseurs (recepteurs membranaires) qui interviennent dans la regulation de MAP-kinase, enzymes impliquees dans la transduction du signal. Les hormones peuvent elles aussi etre impliquees dans la transmission du signal.

L’augmentation du niveau d’ABA endogene est une caracteristique d’un etat de stress hydrique chez de nombreuses especes. De nombreux genes induits par l’ABA ont ete identifies. Cependant, tous les genes qui repondent au stress hydrique ne sont pas forcement induits par l’ABA. Il existe donc deux types d’inductions, l’une ABA dependante et l’autre ABA independante. Nous abordons dans les paragraphes suivant comment s’opere la regulation de l’expression des genes au cours du stress hydrique, au niveau de l’ADN genomique, des promoteurs, des molecules impliquees dans la signalisation du stress, et des modifications post- transcriptionnelles et post-transcriptionnelles.

3. 3. 2. Regulation au niveau de l’ADN genomique

L’accessibilite de l’ADN genomique joue un role tres important dans la regulation de la transcription. En effet, l’ADN genomique est une molecule dynamique qui subit des modifications organisationnelles et structurales en reponse aux stimuli. Une des modifications epigenetiques, fait intervenir la methylation de certaines portions du genome. Il a par exemple ete montre une augmentation de 16 % du taux de methylation de l’ADN genomique sur des cultures cellulaires de pomme de terre soumises a un stress salin (Sabbah et al. 1995).

L’implication de ces modifications dans l’expression des genes au cours d’un stress hydrique a par exemple ete mise en evidence pour le gene codant pour la grande sous-unite de la rubisco (ou ribulose-1,5-diphosphate carboxylase / oxygenase), dans des feuilles de colza. Minati et Johnson-Flanagan (1998) ont analyse le niveau d’expression de ce gene et celui de la quantite de proteine correspondante dans des feuilles de plants acclimates a un stress froid, compare a celles de plants non acclimates.

Ils ont mis en evidence une diminution de la quantite de proteine presente dans les feuilles matures de plants acclimates. Cependant, l’accumulation de la proteine reste plus forte que celle du transcrit. Une analyse des profils de restriction de la grande sous-unite de la rubisco, au niveau de l’ADN genomique, a permis de mettre en evidence des differences de methylation induites par l’acclimatation au froid qui semblent impliquees dans la variation de l’expression du transcrit. Les histones jouent un role dans la condensation de l’ADN ainsi que dans la regulation de l’expression des genes en modulant l’accessibilite de l’ADN (Spencer et Davie, 1999). De nombreuses etudes ont montre des variations d’expression pour differents types d’histone au cours d’un deficit hydrique et/ou en reponse a l’ABA (Croston et al. 1991 ; Wei et O’Connell, 1996 ; Deuleu et al. 1999). Bray et al. (1999), ont par exemple isole chez la tomate une histone H1 qui est accumulee au cours d’un stress osmotique (polyethylene glycol) et qui semble impliquee dans la regulation de la transcription au cours du stress.

3. 3. 3. Etude des Promoteurs de Genes

Les nombreux changements dans les niveaux des ARNm lors du stress hydrique sont le reflet d’activation ou d’inactivation de la transcription. Comme nous l’avons vu precedemment, l’ABA peut intervenir dans ces changements d’expression. De nombreuses etudes ont ete realisees afin de definir les elements en cis et trans qui sont impliques dans l’activation des genes par cette hormone. Il existe des sequences regulatrices particulieres telles que les sequences ABRE (ABA Responsive Element, Marcotte et al. 1989) qui interviennent dans la regulation de l’expression de certains genes. Lors d’un stress hydrique, la production d’ABA stimule l’expression de facteurs de transcription qui vont se fixer sur ces courtes sequences nucleotidiques (Mundy et al. 1990 ; Chaudhary et Crossland, 1996). La transcription des genes correspondants est alors activee.

Un autre type de sequences regulatrices directement reliees au stress mais independantes de l’ABA a egalement ete mis en evidence. Il correspond au motif DRE (Dehydration Responsive Element; Yamaguchi-Shinozaki et Shinozaki, 1994). Les sequences regulatrices ABRE et DRE peuvent etre situees sur le meme promoteur et induire de maniere differentielle l’expression des genes, en fonction de l’intensite et de la duree du stress.

Chez Arabidopsis, Yamaguchi-Shinozaki et Shinozaki (1994) ont isole un gene nomme rd 29A qui est induit par la secheresse, le froid ou un stress salin. Ce gene comporte au niveau de son promoteur un motif DRE qui intervient dans la reponse rapide au stress independamment de l’ABA, et un motif ABRE qui intervient dans une reponse plus tardive via l’ABA. Enfin, les proteines impliquees dans l’activation des genes (les facteurs de transcription) presentent elles aussi des variations d’expression en fonction du stress hydrique. Il a par exemple ete isole chez Arabidopsis un gene nomme Atmyb2, qui appartient a la famille des MYB, dont l’expression est induite par la secheresse ou le stress salin (Urao et al. 1993).

L’etude de ce facteur de transcription a permis de mettre en evidence que les motifs ABRE ou DRE n’etaient pas les seuls a reguler de maniere specifique l’expression des genes lors d’un deficit hydrique. A contrario, Li et Chen (2001) ont isole chez le riz une nouvelle classe de facteurs de transcription (OsZFP1) dont la quantite du messager diminue au cours du stress hydrique. Cette diminution peut etre due a une inhibition de la transcription et/ou a une diminution de la stabilite des messagers. Ce resultat montre que l’adaptation au stress passe aussi par la repression specifique de genes, et notamment de certains facteurs de transcription.

3. 4. Tolerance au sel des legumineuses

La tolerance au sel a ete beaucoup etudiee chez les halophytes (des vegetaux adaptes aux milieux hypersales ou par extension aux milieux a pression osmotique importante), pour comprendre les mecanismes developpes pour leur adaptation (Munns 2002). Cependant les succes notes pour la production de varietes de plantes cultivees tolerantes au sel se sont averes tres limites. Seuls 25 cultivars tolerants a la salinite appartenant a 12 especes ont ete enregistrees (Flowers et Yeo, 1995). On peut citer l’exemple d’un cultivar pour la luzerne (Al-Doss et Smith, 1998) et un pour le Soja (Owen et al. 1994). Flowers et Yeo (1995) en ont conclu que la complexite du processus etudie et l’absence d’une urgence environnementale imminente sont les causes du manque d’interet accorde a la creation de varietes adaptees. Abdelguefi.A (1978), montre que M.truncatula est une espece qui semble preferer les sols assez calcaires mais pauvres en sodium et pourtant, elle tolere les teneurs elevees en sodium (400 ppm).

3.4.1. Probleme de la salinite des sols

Plusieurs contraintes environnementales sont limitantes pour la croissance et le developpement des legumineuses. La salinite et la secheresse sont consideres comme deux facteurs majeurs influant l’agriculture dans les zones arides et semi arides. Approximativement 40 % des surfaces sur terre sont caracterises par la presence d’un probleme potentiel de salinite (Zahran, 1997).

Les sols salins sont caracterises par un niveau toxique des chlorures et sulfates de sodium, la conductivite electrique des solutions de sols satures en sel est superieure a 4 dS / m, l’equivalent de 40 mM NaCl (Shirokova et al. 2000). En Algerie, 3.2 millions d’hectares de terres agricoles sont menaces par la salinite (Belkhodja et Bidai, 2004)

Les regions du bassin mediterraneen sont fortement touchees par ce fleau. D’un autre part, essayer de lutter contre la secheresse par l’irrigation, rajoute aux sols une contrainte de salinisation dite secondaire. Dans ce contexte, ameliorer la tolerance des plantes a la secheresse et la salinite constitue une proposition attractive pour les agriculteurs. De nos jours, la pression devient plus forte pour chercher a combattre et trouver une solution a la salinite des sols pour les plantes cultivees. Cette urgence suggere que des methodes efficaces soient requises pour ameliorer la tolerance au sel pour de nombreuses varietes plantes cultivees.

De nombreuses techniques puissantes se sont developpees pour alterer des genes et leur expression dans des plantes. Mais ces techniques n’ont pas ete utilisees pour l’amelioration de la tolerance aux stress abiotiques. En effet cette tolerance montre generalement une heritabilite quantitative.

3.4.2. Effet de la salinite sur les plantes

La salinite affecte differents mecanismes physiologiques et la necessite de survivre dans un environnement salin necessite de multiples mecanismes d’adaptation pour les plantes (Yeo et Flowers 1986). L’evolution de ces mecanismes adaptatifs implique un ensemble complexe de parametres parmi lesquels beaucoup ne sont pas encore connu. Cette question est la question de depart que se pose un ameliorateur des plantes: Comment determiner les facteurs limitant ou bien les elements des mecanismes qui font balancer les plantes vers une resistance ou une tolerance ?

Une approche comparative entre des plantes sensibles et resistantes doit etre adoptee pour les detecter. Mais il est important que cette difference de comportements soit reliee a une difference de tolerance et pas a d’autres differences entre plantes comparees. En litterature, des comparaisons entre especes et au sein de la meme espece ont ete faites avec une comparaison physiologique. Par exemple, le cas du mat's (Maiti et al. 1996) et le riz (Yeo et al. 1990). Cependant, la comprehension des differences de mecanismes physiologiques est loin d’aboutir a une explication genetique, vu que les liens entre les genes et la physiologie restent inaccessibles chez les plantes. Il est necessaire donc de decouvrir les bases genetiques reliees aux differences phenotypiques liees a la tolerance au sel.

3.4.3. Strategies d’adaptations au stress salin

Les tolerances au Nacl des plantes varient beaucoup d’une espece a l’autre, jusqu'a 100 mM de NaCl dans l’eau du sol, les rendements de l’orge, de la canne a sucre et du coton sont peu affectes, mais le Mai's, les haricots et la luzerne presentent deja des limitations importantes dans la production de matiere seche. Les plantes halophiles ou halophytes qui frequentent les sols sales ou «halomorphes », c'est-a-dire charge de chlorure de sodium et accessoirement d’autres sels, presentent des adaptations morphologiques « xeromorphoses » et des adaptations physiologiques (Laval-Martin et Mazliak., 1995). On peut classer les plantes en quatre categories :

- Les plantes sensibles, qui commencent a etre affectees « baisse de rendement de 20% pour des concentrations de 2 a 3 g / l: qui correspond a 1.5 g / Kg de sol», par exemple : le haricot (glycophyte tres etudie), pois, feve, melon, lentille.
- Les plantes assez resistantes qui tolerent de 3 a 5 g/l, exemple : luzerne agee, trefle d’Alexandrie, carotte.
- Les plantes resistantes: qui acceptent jusqu’a 10 g / l, comme la tomate, le mai's, l’avoine, ble, seigle, l’orge.
-Les plantes tres resistantes: d’un interet special pour la culture en sol sale : epinard, betterave, choux, asperge,jusqu’a 18g /l (Heller, 1993).

Les plantes tolerent le sel en elevant leur propre pression osmotique interne a l’aide d’osmoregulateurs (Heller, 1993).

L’evitement qui permet le maintien du potentiel hydrique eleve dans la plante peut etre obtenu par une reduction de la transpiration par la fermeture des stomates qui limitent l’assimilation du gaz carbonique et la photosynthese, cette fermeture des stomates est sensible a des messages emis par les racines et transmis aux feuilles via le xyleme, messages informant ces dernieres de la reduction des disponibilites en eau du sol; l’acide abscissique apparait, ainsi comme une composante majeure mais non exclusive de cette signaletique racinaire (Monneveux, 1997).

Singh et al. 1985 ont etudie l’expression genique induite par le sel dans des cultures de cellules en suspension et dans des systemes racinaires intacts, les racines etant les premiers organes, qui sont confrontes aux augmentations de salinite. Il a ete observe que des concentrations importantes de plusieurs polypeptides s’accumulent dans des cultures de cellules de tabac soumises a de fortes concentrations de NaCl et de polyethylene glycol (PEG). Un polypeptide de 26 KDa en particulier est induit a la fois par le NaCl et le PEG. Ce polypeptide a ete appele osmotine, en raison de son apparition dans des conditions de faible potentiel hydrique, ou de chocs osmotiques provoques par toute une serie de facteurs (Singh et al. 1987).

3.5. Les mecanismes antioxydants chez les plantes

Les plantes sont constamment soumises a des variations environnementales ou stress abiotique, tels que la secheresse, le froid, des temperatures elevees, mais aussi des stress de type biotique. L’ensemble de ces facteurs peut provoquer une forte production des ROS, pour Reactive Oxygen Species (Price et al. 1995 ; Noctor et Foyer, 1998 ; Schutzendubel et Polle, 2002) , parmi lesquelles des radicaux libres comme les radicaux superxoydes (O2."), les radicaux hydroxyles (OH'), et les radicaux peroxydes (RO'), ainsi que des formes non radicales comme hydrogenes de peroxydes (H2O2). Ces elements sont produits pendant la reduction de l’oxygene par les cytochromes de la chaine respiratoire. Le chloroplaste constitue le compartiment de la photosynthese associe a une forte energie de transport d’electrons, et donc une reserve d’oxygene, qui peut etre a l’origine de la formation des ROS (Asada, 1999). En cas d’exces, l’augmentation de radicaux libres de l’oxygene dans les cellules provoque des dommages cellulaires irreversibles, tels que la peroxydation des lipides ainsi que la denaturation oxydative des acides amines et des bases azotees. Ces ROS a de fortes concentrations peuvent donc etre fatals pour les cellules, par l’alteration des fonctions et des structures cellulaires. Cependant les plantes ont developpe tout un systeme de defense pour se proteger contre le stress oxydatif. Ainsi, les cellules possedent des antioxydants et des enzymes antioxydatives pour faire face aux cascades de reactions declenchees par le stress oxydatif dans les organes cellulaires.

Parmi ces enzymes antioxydatives, les plus importantes et les plus etudiees sont la Superoxyde dismutase (SOD), l’Ascorbate peroxydase (APX), la Catalase (CAT), et la Glutathion peroxydase. Il existe aussi un ensemble de molecules antioxydantes, de faibles masses moleculaires telles que l’ascorbate, le glutathion, les composes phenoliques et les tocopherols.

3.5.1 Les oxydases alternatives (AOX)

La production de ROS, au niveau des thylakoi'des et des mitochondries, peut etre reduite par un groupe d’enzymes appelees oxydases alternatives (AOX). Ces enzymes membranaires derivent le flux d’electrons pour reduire l’O2 en H2O par un mecanisme tres efficace ne generant pas de ROS (Maxwell et al. 1999; Yoshida et al. 2006). La presence de ces AOX reduit la production d’O2 au niveau des CTE en limitant la saturation de ces chaines, mais aussi en diminuant la teneur en O2 a proximite de celles-ci.

3.5.2 Les antioxydants

3.5.2.1 Dfinition

Peut eetre consideree comme antioxydante une molecule qui, etant presente en une faible concentration par rapport a celle d’un substrat oxydable, retarde ou empeche significativement l’oxydation de ce substrat (Halliwell et Whiteman, 2004).

3.5.2.2. Les principaux systemes non enzymatiques

3.5.2.2.I. L’ascorbate ou vitamine C

L’acide L ascorbique (ASC) est un des principaux acides faibles de la cellule vegetale. Aux pH physiologiques, il se dissocie en anion ascorbate. L’ascorbate est essentiellement utilise au niveau cellulaire comme un donneur d’electrons. Le premier produit de la reaction d’oxydation de l’ascorbate est le radical monodehydroascorbate (MDHA ; Fig 7). Du fait de son electron libre tres excentre, le MDHA n’est pas tres reactif avec les autres molecules biologiques (Navas et al. 1994). De plus, etant relativement instable, il se transforme spontanement en ASC et dehydroascorbate (DHA) a une vitesse comprise entre 105 et 2,8.106 M-1.s-1 a pH 7 (Heber et al. 1996). Le DHA est egalement une molecule instable et subit rapidement une hydrolyse conduisant a la formation d’acide 2,3-diketogulonique (DKG ; Deutsch, 1997, 2000).

L’ascorbate est present dans tous les compartiments cellulaires, ainsi que dans la matrice extracellulaire. Contrairement aux cellules animales, la concentration en ASC est tres elevee dans les cellules vegetales (plusieurs millimolaires) ce qui en fait un composant incontournable chez les plantes. Il interviendrait notamment dans la regulation du cycle cellulaire et dans l’extension de la paroi (Horemans et al. 2000). L’ascorbate est toutefois beaucoup plus connu pour ses proprietes antioxydantes (Navas et al. 1994 ; Mehlhorn et al. 1996 ; Horemans et al. 2000 ; Turcsanyi et al. 2000; Potters et al. 2002; Pignocchi et Foyer, 2003 ; Chen et Gallie, 2004 ; Foyer et Noctor, 2005 a). En effet, il reagit rapidement avec l’anion superoxyde et l’oxygene singulet, ou encore avec le peroxyde d’hydrogene, mais cette derniere reaction est catalysee par l’ascorbate peroxydase (APX). L’ascorbate est indispensable par sa capacite a reduire d’autres antioxydants oxydes comme lavitamine E ou les carotenoi'des (Asada, 1994).

3.5.2.2.2 Le glutathion

Le glutathion est un thiol tres abondant se retrouvant de fafon ubiquitaire chez les plantes, les animaux et les vegetaux. Le glutathion est presque present dans tous les compartiments cellulaires, principalement le cytosol et le chloroplaste. Il possede deux formes redox distinctes. La forme reduite (GSH) est un tripeptide (y-Glu-Cys-Gly), stable, a fort pouvoir reducteur et tres soluble dans l’eau. Toutes ces caracteristiques en font un donneur d’electrons adequat dans les reactions physiologiques. L’oxydation du glutathion entraine la formation d’un pont disulfure entre les cysteines de deux GSH. Cette forme oxydee du glutathion est appelee GSSG (Fig 8). En conditions non stressantes, les cellules maintiennent un ratio GSH/GSSG tres important, superieur a 100 dans le cytosol et la mitochondrie (May et al., 1998 ; Noctor et al. 1998).

La concentration en GSH est tres importante dans les cellules vegetales, et en particulier dans les chloroplastes ou elle peut atteindre 5 mM (Noctor et al. 1998). Le glutathion joue de nombreux roles physiologiques chez les vegetaux (May et al. 1998 ; Noctor et al. 1998). Il represente une forme importante de stockage de sulfure reduit, et participe a l’allocation en sulfure des differents compartiments cellulaires et des differents organes (Herschbach et Rennenberg, 1991 ; Lappartient et Touraine, 1996). C’est egalement un regulateur de l’expression genique (Wingate et al. 1988 ; Baier et Dietz, 1997) et le precurseur des phytochelatines (PC) jouant un role predominant dans la sequestration des metaux chez les vegetaux (Grill et al. 1989 ; Clemens, 2006 b ; Clemens, 2006 a). Le GSH sert egalement de substrat pour la glutathion S-transferase (GST) qui catalyse sa conjugaison avec des xenobiotiques, participant ainsi a leur detoxication (Marrs, 1996). Il est implique dans la regulation redox du cycle cellulaire (Gyuris et al. 1993 ; Noctor et al. 1998). Du fait de sa forte concentration dans les tissus vegetaux et de son fort pouvoir reducteur, le GSH participe au statut redox cellulaire enjouant le role de tampon redox dans les cellules (Noctor et al. 1998 ; Foyer et Noctor, 2000 ; Foyer et al. 2001; Foyer et Noctor, 2003 ; Foyer et Noctor, 2005 b, a ; Noctor, 2006). La synthese de GSH est stimulee lors des differentes situations de stress et son accumulation est souvent concomitante avec celle des ROS (May et al. 1998 ; Noctor et al. 1998 ; Potters et al. 2002). Le GSH peut directement reduire l’H2O2 mais egalement d’autres ROS, des hydroperoxydes organiques et des peroxydes lipidiques :

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Un autre role important du GSH dans la regulation des ROS est son implication dans la regeneration de l’ascorbate via le cycle enzymatique dit ascorbate /glutathion.

3.5.2.3. Les principales enzymes antioxydantes

En sus des differentes molecules antioxydantes, les cellules vegetales possedent de nombreuses voies de degradation enzymatique des ROS. Certaines enzymes n’utilisent pas de co-substrat pour reduire les ROS. Au contraire, d’autres utilisent plusieurs co-substrats dont certains antioxydants que nous venons de voir (ASC, GSH).

3.5.2.3.1 Les enzymes du cycle Asada-Halliwell-Foyer

Le cycle Asada-Halliwell-Foyer est un cycle compose de quatre enzymes conduisant, par des reactions d’oxydoreduction successives, a la reduction de l’H2O2 par l’ascorbate peroxydase (APX) via l’oxydation d’ascorbate, et la regeneration du pool d’ascorbate (Fig 9).

L’APX (EC 1.11.1.11), peroxydase de classe I, est une metallo-enzyme contenant un groupe ferriprotoporphyrine IX. Elle est presente dans tous les compartiments cellulaires, dans le cytosol et dans l’apoplaste, sous forme soluble ou liee aux membranes (Asada, 1999 ; Foyer et Noctor, 2000 ; Mittler, 2002 ; Asada, 2006). L’APX catalyse la reduction du peroxyde d’hydrogene en utilisant l’ascorbate comme co-substrat. Le MDHA issu de cette reaction peut ensuite etre pris en charge par la monodehydroascorbate reductase (MDHAR ; EC 1.6.5.4) catalysant sa reduction en ASC en utilisant du NAD(P)H :

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Neanmoins, la situation est un peu plus compliquee, puisque le MDHA est aussi un accepteur d’electrons pouvant etre reduit directement par derivation des electrons de la Chaine de Transport d’Electrons (CTE) chloroplastique (Miyake et Asada, 1994). Le MDHA rentre en competition avec le NADP+ pour accepter l’electron libere par la ferredoxine au niveau du PSI:

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Comme nous l’avons vu precedemment, le MDHA est une molecule instable se dismutant en ASC et dehydroascorbate (DHA). La deuxieme enzyme intervenant dans la regeneration de l’ascorbate, la dehydroascorbate reductase (DHAR ; EC 1.8.5.1), catalyse la reduction du DHA en ASC, via l’oxydation de deux molecules de GSH :

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La derniere reaction de ce cycle est la reduction du GSSG par une flavoproteine, la glutathion reductase (GR ; EC 1.8.1.7), utilisant pour cela du NAD(P)H comme cofacteur :

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L’ensemble des enzymes de ce cycle se retrouvent sous forme soluble dans le stroma du chloroplaste, dans les mitochondries ou dans le cytosol (Low et Merida, 1996 ; Bartosz, 1997 ; Sies, 1997 ; Wojtaszek, 1997; Inze et Montagu, 2001 ; Arora et al. 2002; Langebartels et al. 2002). Ces differentes enzymes, a l’exception d’une MDHAR liee a la membrane plasmique, semblent absentes de l’apoplaste, zone ou, pourtant, la quantite d’ROS produite est importante (Horemans et al. 2000 ; Potters et al. 2002 ; Pignocchi et Foyer, 2003). A notre connaissance, une seule etude effectuee sur des feuilles de pruniers infectes par un virus, fait etat de la presence d’APX dans l’apoplaste (Diaz-Vivancos et al. 2006).

3.5.2.3.2. Les peroxydases (POX)

Les POX (EC 1.11.1.x) sont une large famille multigenique d’enzymes hemiques catalysant la reduction d’un substrat oxyde en utilisant de nombreux co-substrats comme donneurs d’electrons. Pour la majorite de ces enzymes, le substrat optimal est le peroxyde d’hydrogene, mais elles peuvent facilement reduire des hydroperoxydes organiques ou des peroxydes lipidiques :

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Dans certaines conditions, une partie des POX (classe I et III) peut avoir une activite similaire a la catalase (catalase-like), c’est-a-dire qu’elles possedent la capacite de reduire l’H2O2 en absence de co-substrat (Mika et al. 2004).

Au niveau cellulaire, la repartition des POX est tres nette. Les POX de classe III se trouvent dans l’apoplaste sous forme soluble ou liees aux parois et membranes. Les POX de classe I, dont l’APX est la representante majoritaire, sont presentes uniquement a l’interieur des cellules. Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

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Fig 7 : Formes redox de l’ascorbate
(Potters et al. 2002).

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Fig 8 : Oxydation de deux molecules de GSH conduisant a l’etablissement d’un pont
disulfure et la formation de GSSG.

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Fig 9 : Cycle Asada-Halliwell-Foyer
(Potters et al. 2002).

4. Variabilite Genetique des Plantes

4.1. L’origine de la diversite genetique

La diversite genetique est une composante essentielle de la biodiversite. Elle decrit la variabilite des genes entre ou a l’interieur des especes et de leurs populations. L’interet actuel porte a la biodiversite montre a quel point il est necessaire de veiller au maintien d’une ressource genetique suffisamment large pour garantir l’adaptation des organismes face aux changements environnementaux directs (les exploitations forestieres et les changements d’usage des terres par exemple) et indirects sur le long terme (changements climatiques globaux). En effet, cette diversite genetique est tres importante car elle represente le support de base sur lequel peut agir la selection. Il est admis que plus la diversite est grande dans un groupe d’individus (sous- population, population, espece) plus il sera facile pour certains individus de s’adapter a de nouvelles conditions environnementales. En plus de permettre une plus grande adaptabilite des individus, elle permettra egalement de reduire la depression de consanguinite et diminuera ainsi le risque d’extinction (Frankham, 2003).

L’etude de la diversite genetique a differents niveaux hierarchiques d’organisation peut apporter une aide precieuse a la biologie des populations et a la biologie evolutive ; deux disciplines importantes pour la biologie de la conservation. La diversite genetique est alors devenue un outil primordial pour definir des buts, des methodes et des priorites dans des programmes de conservation (Stockwell et al. 2003). Le polymorphisme genetique est a la base de la diversite genetique, il correspond a des variations de sequences d'ADN au sein d'un groupe d’individus. Ces variations naturelles sont dues a des mutations successives au cours de revolution qui permettent de caracteriser la diversite genetique entre individus et populations.

En general, la majorite des polymorphismes sont neutres (Kimura 1968, 1983), mais une partie de ces variations peut influencer les differences phenotypiques observees entre individus qui pourront leur permettre d’avoir une meilleure fitness dans leur environnement. Le polymorphisme peut nous renseigner sur les differents processus qui fafonnent la variabilite genetique. Ils peuvent etre de nature demographique (taille des populations, migrations) et selectif (lie a l’environnement). L’etude de l’importance relative de ces differentes composantes fafonnant le polymorphisme permet de mieux comprendre l’histoire evolutive des populations et des especes. Le niveau de diversite genetique des populations et des variations de frequences alleliques depend de l’action respective de quatre forces evolutives pouvant interagir les unes avec les autres : la mutation, la selection, la migration et la derive. Elles sont a l’origine de la structure de la diversite genetique et de son evolution.

4.1.1. La Diversity Genetique en Agriculture

La diversite genetique dans les ecosystemes agricoles peut etre subdivisee en deux categories :

- La diversite planifiee : qui comprend la diversite genetique parmi les especes de plantes cultivees (Vandermeer et al. 1998). Ces ressources tant vegetales sont a la base de la production agricole.
- La diversite associee : qui comprend la diversite entre les especes vegetales presentes dans les ecosystemes agricoles (Biala et al. 2005).

Par rapport a ces definitions, les prairies pluriannuelles et les paturages, tels qu’on les rencontre frequemment en Europe centrale, occupent une position intermediate. Ils sont bien exploites, au sens agricole du terme, mais leur diversite genetique n’est influencee par les agriculteurs qu’au commencement. Par la suite, cette diversite est influencee de fafon preponderate par l’environnement et par le mode d’exploitation. On constate qu’une forte intensite d’exploitation peut exercer des effets negatifs sur la diversite genetique (Peter-Schmid et al. 2008). La diversite genetique, la variete des genes et des alleles a l'interieur d'une espece, definit l'element de base de la biodiversite. C'est une condition essentielle pour la productivite et la durabilite des systemes de production agricole

4.1.2. Determination de la diversite genetique

Au cours des dernieres decennies, une intensification generale des pratiques agricoles a fortement reduit la diversite planifiee parmi les especes vegetales et animales. Ainsi, en Allemagne ou en Finlande par exemple, presque toutes les varietes locales de cereales cultivees autrefois ont disparu (Hammer et Diederichsen 2009) ; en Hollande, le nombre des races locales de bovides a diminue de quelque 90 % au cours des 30 dernieres annees (Buiteveld et al. 2009). Bien que des etudes isolees documentent ces pertes, il manque des methodes fiables et simples qui permettent de suivre revolution de la diversite genetique dans l’agriculture. Pour cette etude, a ete mis au point et utilise un questionnaire qui permet une evaluation grossiere de la diversite genetique de varietes de plantes et de races d’animaux. En plus, il a ete determine l’influence du mode d’exploitation et celle de facteurs environnementaux sur la diversite genetique du dactyle (Dactylis glomerata), une espece que l’on rencontre frequemment dans les prairies et les paturages, au moyen de marqueurs genetiques moleculaires. herbageres differentes.

La diversite genetique de 60 populations provenant des trois etudes de cas regionales a ete determinee au moyen de 29 marqueurs SSR (simple sequence repeat) (Last et al. 2013). Les profils des marqueurs SSR de chaque plante ont ete compares entre eux et la diversite genetique a ete definie a l’interieur des populations, entre les populations et entre les regions etudiees.

Comme mesure de la diversite genetique dans les populations, on a pris en compte l’heterozygotie moyenne attendue (HE) et la diversite genotypique selon Shannon (HG). L’influence du mode d’exploitation a ete examinee a l’aide d’analyses de correlation et de statistiques multivariables.

4. 2. Notion de vulnerability et erosion genetique

La vulnerability genetique a ete definie comme «la situation que l’on observe lorsqu’une plante de grande culture est constamment sensible aux attaques des ravageurs, d’un agent pathogene ou au risque ecologique du fait de sa constitution genetique, ce qui cree des possibilites de pertes importantes de cultures^. L’erosion genetique, d’autre part, a ete definie comme «la perte de genes individuels et de combinaisons de genes (par exemple, de groupes de genes) telles qu’on les retrouve dans les varietes adaptees aux conditions locales. Le terme ‘erosion genetique’ est parfois utilise stricto sensu, c’est-a-dire la perte de genes ou d’alleles, et parfois lato sensu pour indiquer la perte de varietes en general»» Ainsi, bien que l’erosion genetique n’implique pas necessairement l’extinction d’une espece ou d’une sous-population, elle signifie par contre la perte de variabilite et, par consequent, la perte de flexibilite (Heywood et Dulloo, 2005). Ces definitions prennent en compte les deux aspects de la question de la diversite, c’est-a-dire la richesse et l’homogeneite. La richesse concerne le nombre total d’alleles et l’homogeneite, la frequence relative des differents alleles.

4.2.1. Indicateurs de la vulnerability et de l’erosion genetique

Au cours de la derniere decennie, l’interet pour la mise en place d’indicateurs directs et indirects de la vulnerabilite et de l’erosion genetiques a augmente, en raison, au moins en partie, du manque de preuves concretes des deux processus. Le Programme 2010 d’indicateurs de biodiversite, regroupe un grand nombre d’organisations internationales pour elaborer ces indicateurs qui permettent de surveiller les tendances de la diversite genetique. Cependant, a ce jour, il n’y a pas vraiment d’indicateurs pratiques, instructifs et generalement acceptes, pour l’erosion genetique qui soient disponibles. Par consequent, leur developpement devrait etre une priorite. Plusieurs qualites sont importantes pour que ces indicateurs soient efficaces:

- etre sensibles aux changements dans la frequence des alleles importants, et etre en mesure de leur donner plus de poids qu’aux alleles moins importants: la perte d’un allele dans un locus de microsatellites hautement polymorphiques, par exemple, est probablement d’une importance moindre par rapport a la perte d’un allele de resistance aux maladies;
- fournir la mesure de l’ampleur de la perte potentielle, par exemple en evaluant la fraction d’information genetique en danger par rapport a la diversite totale;
- permettre d’estimer la probability de la perte tout au long d’une periode de temps specifique, en l’absence d’intervention humaine.

Les indicateurs pour revaluation de la vulnerability genetique devraient prendre en compte non seulement l’etendue de l’uniformite genetique en soi, mais considerer egalement les possibles interactions genotype avec environnement. Un genotype donne (population ou variete) pourrait succomber face a un stress biotique ou abiotique de fafon differente selon l’environnement.

Quelques indicateurs utiles de la vulnerabilite genetique pourraient etre les suivants :

- le degre de la diversite genetique des genes qui conferent la resistance ou la tolerance face aux principaux ravageurs et maladies, tant reels que potentiels, ou face aux stress abiotiques;
- le degre de la diversite dans les interactions hote - microorganismes et la presence de reponses differentielles aux differents biotypes de ravageurs et de maladies: cet indicateur fournirait des informations sur la variete des mecanismes d’adaptation disponibles pour faire face a une situation et, par consequent, sur la probabilite d’un changement de la population pathogene donnant lieu a une virulence generalisee;
- la presence de graves goulots d’etranglement genetiques lors de la domestication, de la migration ou de la selection: les indicateurs d’un goulot d’etranglement genetique pourraient provenir des donnees moleculaires, des informations historiques ou des analyses genealogiques;
- le degre de domination de chaque variete sur de grandes surfaces pourrait representer un premier indicateur utile pour revaluation de la vulnerabilite genetique, en supposant que la vulnerabilite genetique est plus elevee lorsque de grandes surfaces sont cultivees avec une seule variete;
- les distances genetiques entre les lignees parentales d’une variete pourraient etre un indicateur suppletif, dans certaines circonstances, du degre d’heterogeneite et, par consequent, de vulnerabilite de la variete.

4.3. Approches de la diversity moleculaire

4.3.1. Marqueurs moleculaires pour l'etude de la diversite genetique

La valeur phenotypique d’un individu depend du genotype (facteurs genetiques) mais aussi des conditions environnementales. La genetique quantitative a permis de modeliser la transmission genetique de caracteres ayant une distribution quantitative. L’utilisation de marqueurs moleculaires lies aux facteurs genetiques controlant l’expression de caracteres d’interet agronomique, et le developpement de cartes genetiques a haute densite permettent d’acceder a des informations precises : le nombre et l’effet des genes intervenant dans l’expression d’un caractere, leur localisation sur les chromosomes et leur mode d’action. Un marqueur moleculaire est un locus genetique qui renseigne sur le genotype de l’individu (utilisation en genetique des populations) ou sur le genotype des locus voisins (utilisation en selection assistee par marqueurs). Il existe plusieurs types de marqueurs, que l’on peut classer en fonction du polymorphisme qu’ils detectent.

Certaines techniques ont l’avantage de reveler de nombreux fragments simultanement, ce sont des techniques de revelation « en masse » de polymorphisme. Il existe aussi des strategies permettant de detecter du polymorphisme de fafon individuelle. L'etude de la diversite ou polymorphisme genetique est liee au developpement de la biologie qui a permis le developpement de plusieurs marqueurs a savoir les marqueurs morphologiques, les marqueurs biochimiques et les marqueurs moleculaires.

Les marqueurs morphologiques et biochimiques ont largement contribue aux etudes de la diversite chez les plantes. Ces marqueurs presentent des limites majeures en comparaison avec les marqueurs moleculaires. Les marqueurs morphologiques etant polymorphes, peuvent interferer avec d'autres caracteres et sont parfois influences par le milieu. Les marqueurs biochimiques quant a eux presentent l’inconvenient d’etre faiblement polymorphes.

Les marqueurs moleculaires dont le nombre ne cesse de croitre avec le developpement des techniques de biologie moleculaire (depuis les RFLP, RAPD, AFLP, SSR, ISSR jusqu’aux SNP) ont fait un large consensus en matiere de genetique selon leurs avantages respectifs. L'utilisation de ces marqueurs est basee sur la notion du bon marqueur moleculaire qui doit etre: Polymorphe, codominant, non epistatique et independant du milieu. Le choix d'un bon marqueur par le chercheur est aussi base sur la technicite et le cout de l'experience qui doivent etre abordables en vue d'une manipulation a grande echelle. Les marqueurs moleculaires ont ete largement utilises chez les animaux et les plantes pour des etudes de base ainsi qu'appliquees.

L'une des utilisations majeurs des marqueurs moleculaires etant l'elaboration physique et genetique des cartes chromosomiques. Ces marqueurs ont contribue aux travaux d'amelioration des plantes (Lefort-Buson et al. 1990 a et 1990 b) en assurant une selection indirecte moyennant des marqueurs moleculaires lies a des caracteres d'interet ou quantitative traits loci (QTL).

Ces marqueurs presentent l’avantage d’etre independants a l'environnement d’ou la possibility de les caracteriser a differents stades de developpement de la plante. Ces marqueurs ont ete aussi adoptes pour toutes les etudes de genetique des populations et d'ecologie (Haig, 1998) permettant l'analyse de la structure et du niveau de la diversite des populations; l'elaboration d'hypotheses sur le flux des genes et la selection des especes. Les marqueurs moleculaires sont actuellement tres utilises pour la caracterisation des germplasmes et l'identification genetique des especes en particulier dans le but de la trafabilite.

4.3.2. Les marqueurs Microsatellites

Les microsatellites ou sequences simples repetees (SSR) sont polymorphes constitues de sequences repetees en tandem (1-6 bp). La variation du nombre de repetitions du motif de base qui emane des erreurs survenues lors de la replication d’ADN (Jarne et Lagoda, 1996), ce qui constitue la base du polymorphisme. Ces differences sont revelees sur gel polysaccharide ou les motifs en tandem migrent en fonction de leur poids. Par ailleurs, ces marqueurs sont adaptes aux etudes de populations etroitement apparentees et permettent meme les comparaisons entres individus ou cultivars (Takezaki et Nei, 1996 ; Westman et Kresovich, 1997 ; Hokanson et al. 1998). Grace a leur grand contenu informatif, 10 a 20 loci suffissent pour distinguer des genotypes tres proches. Ils ont ete utilises aussi bien dans l’etude de la diversite genetique que dans l’elaboration des cartes genetiques du ble, de l’orge et du soja (Roder et al. 1995 ; Peakall et al. 1998 ; Ramsay et al. 2000).

Les SSR sont ''ubiquitaires''chez les procaryotes et les eucaryotes et sont presents meme dans les genomes bacteriens les plus petits (Field and wills, 1996 ; Hancock, 1996). Les microsatellites peuvent etre presents au niveau des sequences non codantes et aussi codantes. La technique SSR se base sur l'amplification par PCR de l'ADN genomique moyennant des amorces specifiques flanquant les sequences repetees et la separation des amplifias par electrophorese sur gel de polyacrylamide.

Les SSR se sont reveles des marqueurs moleculaires tres utiles dans la selection assistee par marqueurs, l'analyse de la diversite genetique et l’analyse de la genetique des populations chez plusieurs especes (Gupta 2000, Budak et al. 2003). En plus, ce sont de marqueurs multi- alleliques d’ou leur usage dans les etudes phylogenetiques et de revolution des especes. Ainsi, Mhameed et al. (1997) utilisant ces marqueurs ont pu etablir un arbre phylogenetique compose de Persea americana et ses especes sauvages.

4.4. Analyse de la variability genetique

L'etude de la variability moyennant les marqueurs moleculaires cites precedemment permet de generer des resultats sous forme de tableaux complexes avec un ensemble de variables nombreuses et souvent de typologie diverses. Les methodes statistiques uni- ou multi variees permettent l'analyse de la similarite et de la diversite entre les entites etudiees ainsi que le calcul des parametres genetiques des differentes populations. Les resultats obtenus peuvent etre aussi resume et classes en groupes grace a des techniques descriptives telles que les analyses factorielles et les methodes de classifications.

4.1.1 Methodes de classification

La classification hierarchique ou hierarchical clustering permet le regroupement ou le clustering d'un ensemble d'echantillons en se basant sur la notion de distance afin d’etablir un dendrogramme. En effet, le clustering consiste en le regroupement des echantillons en groupes / sous-groupes ou clusters partageant des caracteristiques communes. Les methodes de classification sont des methodes non parametriques ne considerant qu'une seule hypothese qui stipule que plus deux entites sont similaires plus elles ont de chance a faire partie du meme groupe. Pour realiser un bon clustering nous devons choisir le coefficient ou indice de similarite adequat. Celui-ci, depend essentiellement du type de donnees a analyser. On distingue ainsi les indices de similarites binaires traitant les donnees discretes de type (presence / absence) et les indices de similarites quantitatifs. Ces indices sont aussi classes selon qu'ils traitent ou pas la co­occurrence du zero ou double absence comme etant une ressemblance. On parle ainsi d'indices symetriques pour le cas des indices qui considerent la double absence comme de la double presence, par opposition aux autres indices asymetriques.

4.4.1.1. Indices de similarites binaires symetriques :

L'indice representant cette categorie est l'indice de SOKAL et MICHENER qui represente le nombre de presences ou d’absences simultanees divise par le nombre total de releves.

4.4.1.2. Indices de similarites binaires asymetriques :

Les indices representant cette categorie sont l'indice de Jaccard et Sorensen. L'indice de JACARD, le plus utilise, represente le nombre de cas de presences simultanees des deux echantillons consideres, divise par le nombre de cas ou au moins l’un des deux est present. L'indice de SORENSEN (S) est assez similaire a l'indice de JACARD, avec une ponderation par 2 du terme de co-occurrence. A partir des indices de similarites binaires on peut deduire les indices de distances D comme suit: D=1-S.

5. Aspect Genomique de Medicago truncatula Gaertn

5. 1. Outils genetiques et genomiques disponibles

M. truncatula, avec un petit genome approximativement de 500 Mbp, a ete largement acceptee comme plante modele pour des aspects multiples de la genetique de legumineuse et de genomique (Cook, 1999). Plusieurs projets a grande echelle sur la genomique de M. truncatula ont ete lances par la communaute international et des outils essentiels sont developpes pour la genomique structurale et fonctionnelle suite au developpement des ressources bioinformatiques (Frugoli et Harris 2001). L’analyse genetique d’un organisme exige la mise en reuvre de methodes et techniques diverses qui vont permettre d’ordonner les genes, de les localiser sur le genome et enfin de les cloner. La creation de cartes genetiques et genomiques est donc indispensable. En outre, l’analyse comparative de ces cartes d’organismes differents permet d’etudier revolution de leurs genomes (Zhu et al. 2005).

Parmi les marqueurs possibles disponibles, les microsatellites sont generalement utilises pour de nombreux projets genetiques en raison de leur grande reproductibilite et de la facilite d’identifier des alleles. Les microsatellites sont des sequences d'ADN repetees en tandem dont l'unite de repetitions varie d’une a six pb. Dans la litterature, on les appelle aussi: simple sequence repeats (SSR), short tandem repeats (STR), ou variable number tandem repeats (VNTR). Les principales contraintes des SSRs, en tant que marqueurs moleculaires, sont l’effort et le cout exige pour leur developpement. Pour cette raison leur utilisation a ete limitee a quelques especes importantes sur le plan agricole.

La recherche des SSRs a ete recemment centree sur les EST (Expressed Sequence Tag) - SSRs, qui sont relativement peu couteux compares au developpement de SSRs genomiques (Gupta et al. 2003) puisqu’ils sont identifies dans des sequences nucleotidiques. Ces marqueurs sont plus transmissibles aux genres etroitement lies puisqu'ils sont ancres dans des regions conservees transcrites (Decroocq et al. 2003).

5. 2. La genomique structurale et fonctionnelle

Actuellement, Fun des defis majeurs du chercheur est la comprehension des mecanismes complexes chez les organismes vivants. Les phenomenes tels que la croissance, le developpement et Fadaptation aux stress en particulier le stress hydrique necessitent une bonne comprehension et analyse de Finformation portee par le genome. Ceci implique deux disciplines piliers de la biologie moleculaire : la genomique structurale et la genomique fonctionnelle. La genomique structurale nous permet de dechiffrer et extraire Finformation portee par le genome et par les proteines. La genomique fonctionnelle nous permet par contre de comprendre les modalites de regulation et d'interaction de cette information.

5. 3 La genomique structurale

Cette discipline est basee essentiellement sur le sequenfage et l'identification des genes. La definition des structures introns-exons et regions inter- geniques est une etape cruciale de la genomique structurale. Cette identification s'effectue par comparaison des sequences avec les sequences d'ADNc et aussi par l'utilisation de certains programmes bioinformatiques de prediction. Depuis la decouverte de l'ADN double helice par Watson et Crick en 1953, les etudes portant sur l'ADN se sont succedees. Et depuis le sequenfage du premier genome d'Haemophylus influenzae en 1995, plusieurs organismes ont ete sequences.

5. 3 .1. Le sequenfage systematique

Le sequenfage est un moyen de decodage des acides nucleiques permettant la decouverte des genes d'un organisme. Le sequenfage de l'ADN a ete invente aux annees 70 par deux equipes travaillant separement, l'equipe de Walter Gilber et l'equipe de Frederick Sanger. L'equipe americaine et allemande ont refu le prix Nobel de la chimie en 1980. Les methodes de sequenfage proposees sont basees sur des techniques differentes. En effet, La methode de Sanger est basee sur la synthese enzymatique selective alors que celle de Gilbert est basee sur la degradation chimique selective. Actuellement la majorite des sequenfages realises se basent sur la methode de Sanger. Le sequenfage de genomes tire avantage des techniques de biologie moleculaire ainsi que des outils de la bioinformatique. Ainsi, on reconnait deux grandes techniques de sequenfage basees essentiellement sur la fragmentation partielle du genome et le clonage des fragments genomiques dans des vecteurs de clonage. Selon que les clones sont ordonnes avant ou apres le sequenfage on distingue:

- La methode de sequenfage par ordre hierarchique: cette technique est basee sur le sequenfage de fragments digeres apres leurs classements. Les fragments genomiques digeres sont de grande taille 50-200 kb et sont clones dans des vecteurs artificiel comme les chromosomes artificiels bacteriens (BAC).
- La methode globale ou shotgun est basee sur le sequenfage des fragments genomiques dans un ordre aleatoire : Les sequences des differents clones seront ordonnees par chevauchement a l'aide des programmes bioinformatiques. Cette technique a ete popularisee par le sequenfage de genomes bacteriens, du genome de la drosophile et du genome humain. La technique shotgun presente l'avantage d'etre plus rapide et moins couteuse que la premiere technique.

5. 4 . Sequenfage d’etiquettes de sequences exprimees (EST)

Le sequenfage d'EST est une variante du sequenfage ciblant en particulier les sequences codantes et ignorant les sequences non transcrites. Cette technique permet d'avoir de l'information independamment de la taille du genome etudie. En comparaison avec le sequenfage systematique, le sequenfage d'EST permet d'acceder aux sequences codantes avec un effort et un cout moindres. En pratique on clone les ADNc issus de la retro- transcription des ARNm dans des vecteurs plasmidiques de clonage formant ainsi des banques d'ADNc. Les clones sont partiellement sequenfes sur l'une des extremites 3' ou 5'. Les sequences obtenues sont classees en groupes correspondant au meme gene on parle de "contigs". Ainsi, on peut obtenir la sequence complete d'un gene par la combinaison des sequences de plusieurs clones. Actuellement, la banque de genes GenBank avec sa division speciale pour la banque de donnees EST comprend pres de 52 millions d'EST (Adams et al. 1991). D'autres bases de donnees pour les EST contigs sont disponibles sur le web, citons :

5 .5 . Interet de l’utilisation des ESTs

La methode la plus efficace pour avoir acces a des sequences codantes est le sequenfage systematique de fragments de genes exprimes. Ces fragments, de longueur excedant rarement 1000 pb, sont generalement appeles des etiquettes de sequences exprimees ou ESTs (Expressed Sequence Tags). Il existe plusieurs banques de donnees, generales comme Genbank (Benson et al.2003) ou specifiques d’un organisme comme TAIR pour Arabidopsis (Rhee et al., 2003), MaizeGDB pour le mai's (Lawrence et al. 2004), Gramene pour les graminees (Ware et al. 2002) et SGN pour les Solanacees (http://www.sgn.cornell.edu).

Les ESTs constituent une source remarquable de donnees pour l’identification de genes et le developpement de marqueurs moleculaires. Lorsque du polymorphisme est trouve dans des ESTs, leur cartographie permet d’etablir des cartes genetiques fonctionnelles utiles dans l’identification de regions genomiques controlant des caracteres d’interet.

Les ESTs etant constituees de sequences codantes, elles sont donc relativement bien conservees entre les differentes especes vegetales. Pour cette raison, il est facile de les utiliser pour comparer des especes phylogenetiquement proches. Un tel avantage peut etre exploite dans le cas de Medicago truncatula, ou les travaux concernant la cartographie genetique sont en evolution continue.

5. 6. La genomique fonctionnelle

Le marquage de l’ADN ne permet aucune interpretation sur l’action individuelle des genes et de leurs interactions. En genomique fonctionnelle, en revanche, c’est la connaissance de la fonction de ces genes et l’analyse de leur expression qui est visee. L’expression (ou transcrit) plus ou moins importante du gene est accessible a travers les changements d’ARNm eux-memes traduits en proteines, qui sont en general des enzymes dont la fonction metabolique est connue. L’objectif de ces etudes peut etre la mise au point d’un test de reponse varietale ou bien, le plus souvent, d’inclure dans le genome de l’espece cultivee des genes interessants. Ces techniques de genie genetique sont moins developpees sur les legumineuses que sur les cereales (Klueva et al. 1998).

5. 7. Le role regulateur des facteurs de transcription sous divers stress abiotiques

Les stress salin et hydrique diminuent le potentiel hydrique des cellules vegetales. Des etudes se sont focalisees sur les reponses moleculaires des plantes et les mecanismes de transduction des signaux lors d’un stress hydrique. Chez les plantes, beaucoup de genes sont induits par la secheresse, la salinite et le froid (Shinozaki et al. 1996, Bray. 1997), ces inductions de l’expression de ces genes sont reparties en deux groupes selon la fonction de leur produits (Liu et al. 2000) :

- Les produits des genes du premier groupe sont les proteines fonctionnelles qui protegent les macromolecules et les membranes (les proteines LEA, osmoticum, proteines anti-gel, chaperons,...), qui maintiennent le mouvement hydrique a travers les membranes comme :
- Les canaux proteiques hydriques et les transporteurs membranaires.
- Les enzymes catalysant la biosynthese d’une grande variete d’osmoregulateurs comme la proline, betaine et les sucres,.
- Les enzymes qui detoxifient et permettent un maintien a un niveau normal, la physiologie des cellules ainsi que leur metabolisme biochimique comme, la glutathion- s- transferase, soluble epoxyde hydrolase, catalase, superoxyde dismutase et la peroxydase ascorbique.

* Les produits des genes du second groupe sont:

-les facteurs transcriptionnels comme les DREB « Dehydration responsive element binding protein ».
-Les proteines kinases « proteine kinase ribosomale, proteine kinase de la regulation de la transcription,.).
-Les proteinases «phosphoesterase, phospholipase C,.. » qui sont impliquees dans les mecanismes de transduction des signaux dus aux stress et le controle de l’expression des genes de tolerance aux stress.

Deux genes ont ete trouve chez Arabidopsis thaliana, et chez N. tabacum qui codent pour une proteine kinase et qui sont: ATRR1 et ATRR2 qui sont induits par la secheresse, la salinite et le froid. (Zhang et al. 1999).

Un gene nomme rd 29A a ete identifie chez Arabidopsis soumise a la secheresse, l’expression de ce gene est induite d’une fafon differentielle sous condition stressante comme le froid, la salinite et la secheresse, ou sous un traitement par l’acide abscissique exogene (ABA). Ceci suggere que le promoteur du gene rd 29A a au moins deux genres d’elements agissant en cis, l’un implique dans une reponse associee a l’ABA et l’autre dans une reponse independante de l’ABA. L’expression du gene rd 29A est differente par rapport aux autres genes rd (responsive dehydration: sensible a une deshydratation), leurs promoteurs contiennent des elements DRE activant en cis, impliques dans la voie rapide d’expression du gene rd 29A, et des elements ABRE (elements sensibles a l’ABA) implique dans la voie lente de l’expression du gene rd 29A sous condition de stress (Liu et al. 2000).

En conclusion, Medicago truncatula Gaertner, proche de la luzerne cultivee, a ete choisi comme une legumineuse modele grace a sa grande diversite genetique. Elle est diploi'de et autogame, avec un petit genome. C’est un modele utilise pour les etudes genetiques et moleculaires dans la comprehension des mecanismes de l’adaptation aux stress abiotiques et biotiques. Sa capacite de a pouvoir fixer l’azote atmospherique fait que cette culture ne necessite pas d’engrais azote qui polluent l’atmosphere. Enfin, cette plante proteagineuse presente un interet agronomique important qui repose sur un bon rapport production / valeur nutritive du fourrage, des besoins en traitements phytosanitaires faibles et une adaptation a des conditions pedo-climatiques variees.

Chapitre 2 Analyse de la Tolerance au Stress Salin de Medicago truncatula Gaertn. en relation avec le Poids et la Teneur en Proteines de Reserves des Graines

Analyse de la Tolerance au Stress Salin de Medicago truncatula Gaertn. en relation avec le Poids et la Teneur en Proteines de Reserves des Graines

La salinite est l’un des stress abiotiques qui affecte de maniere significative la croissance des plantes et la qualite des graines. Les legumineuses sont des plantes tres importantes sur le plan ecologique et agricole car ils sont capables d'interagir en symbiose avec des rhizobiums pour la fixation biologique de l'azote (Spaink, 2000 ; Perret et al. 2000), ce qui evite l'utilisation d'engrais chimiques, qui affectaient la rhizosphere et polluent les nappes phreatiques. Parmi les especes annuelles du genre Medicago, l’espece Medicago truncatula est largement utilise comme plante legumineuse modele pour comprendre la tolerance aux stress abiotiques (Young et Udvardi, 2009). Ce type de legumineuses ont un grand interet pour l'agriculture durable. La croissance des plantules au stade precoce de nombreuses plantes cultivees est tres sensibles aux stress environnementaux (Penmetsa et Cook, 1997). La longueur de la racine et de la tige fournissent des indications importantes de la reponse de la plante au stress salin (Jamil et Rha, 2004). Chez certaines plantes, la radicule peut etre plus longue que la tigelle et, par consequent, ce rapport peut etre inferieure par rapport a d'autres plantes (Snapp et Shenman, 1992). La comprehension de la relation entre le developpement des jeunes plants, les conditions environnementales et la qualite des graines au niveau physiologique et agronomique sont des objectifs fondamentaux de la science des semences

(Blaha et Pazderu, 2013). Les proteines qui s'accumulent dans les plantes dans des conditions salines peuvent fournir une forme de stockage de l'azote qui est reutilisee plus tard (Singh et al. 1987), et peuvent etre nouvellement (de novo) synthetises en reponse au stress salin. Elles sont presentes de maniere constitutive a faible concentration (Pareek et al. 1997). Il serait tres interessant de trouver une association entre la teneur en proteines de reserves graines et la tolerance au stress salin.

Le but de notre etude est d'evaluer la reponse de la croissance des jeunes plants au stress salin et surtout la croissance de la radicule chez quatre genotypes de M. truncatula en relation avec le poids des graines et la teneur en proteines de reserves afin de rechercher une correlation entre l'accumulation de ces proteines et les parametres de croissance sous stress salin. La determination du genotype le plus tolerant avec une teneur eleve en proteines de reserves est d’un grand interet pour l'agriculture durable et l'ecologie afin d'ameliorer la productivite de cette legumineuse tres importante sur le plan economique et environnemental (fixation de l'azote). Une deuxieme approche de cette etude etait d'utiliser des graines agees d’un genotype appartenant au M. truncatula afin d'evaluer l'influence de la qualite des graines sur les differents parametres de croissance en relation avec la tolerance a la salinite .

Materiels et Methodes

1. Materiel

Nous avons utilise des graines recoltees en (2010) provenant de genotypes de M. truncatula, fournies par differents instituts. Jemalong, qui est le genotype de reference, Tru 131 de IDGC de Sidi Belabbes, Tru 26 (35° 23’ 17” N; 1° 19’ 22.16” E) qui provient de l’ENSA El Harrach (Alger), respectivement, et le genotype Tru 673 qui est represente par des graines agees d’une ancienne collection (24/06/1977) de l'ICARDA a Alep (Syrie).

2. Methodes

Les quatre genotypes ont ete utilises a quatre niveaux de traitement par NaCl (Eau distillee comme temoin 0, 68, 102 et 137 mM) de chlorure de sodium

(Amouri et Fyad Lameche, 2012). Le genotype Tru 673, caracterise par une faible vigueur des graines (Fig 10), a ete utilise pour etudier l'impact des graines agees sur la reponse de la radicule et la tigelle a la salinite. Les graines ont ete scarifies et sterilisees pendant 10 minutes dans l’hypochlorite de sodium (6%) puis rincees trois fois a l'eau distillee pendant deux minutes. Dix graines ont ete semees dans des boites de Petri et mises a germer sur du papier-filtre imbibe dans l'eau distillee et dans les differentes solutions de chlorure de sodium. Les graines des differents genotypes de M. truncatula ont ete mises a germer dans des boites de Petri (50 mm) sur deux couches de papier filtre dans un incubateur maintenu a l'obscurite a 25 ± 2 °C. Les papiers filtres ont ete changes apres 48 heures, afin d'eviter l'accumulation du sel (Rahman et al. 1996). Pour evaluer l'effet des differents niveaux de concentrations de NaCl sur les differents genotypes, le dispositif experimental est un dispositif bloc randomise avec quatre repetitions, l’emergence de la radicule est le critere de la germination.

Pendant dix jours de germination, la longueur de la radicule (RL), la longueur de la tigelle (PL) et la longueur des jeunes plants (SL) ont ete mesures. Le pourcentage final de germination (FGP), le rapport longueur tige et racine et la vigueur des graines (SV) ont ete calcules comme suit: PL : RL = rapport longueur tige ( cm ) / longueur racine (cm ) et la vigueur des graines germees (SV) = FGP ( % ) * SL (cm). Dans cette etude, nous avons considere les genotypes comme tolerants ceux qui ont un faible ratio, c'est a dire que leurs racines sont plus resistantes que leurs tiges. 2. 1. Determination de la teneur en proteines de reserves des graines

La teneur en proteines de reserves des graines (SPC) a ete determinee par la methode decrite par Bradford (1976) en utilisant de l'albumine du serum bovin comme temoin. Quatre graines pour chaque genotype, ont ete melangees avec un tampon d'extraction (50 mM Tris -HCl (pH: 6,8 ), 2 % de SDS, 2 ,5 % de beta -mercaptoethanol, 10 % glycerol). Apres broyage, les echantillons ont ete centrifuges a 14000 rpm pendant 15 minutes et le surnageant a ete isole et utilise pour le dosage des proteines.

L'intensite de la couleur bleue developpee a ete enregistree a 595 nm a l’aide d’un spectrophotometre a UV visibles et la concentration en proteine a ete mesuree en utilisant de l'albumine du serum bovin comme temoin. La teneur des graines en proteines de reserves (SPC: mg g- 1) a ete calculee en fonction du poids des graines seches (SDW : mg ) pour chaque genotype .

2. 2. Analyse statistique

Tous les tests statistiques ont ete realisees en utilisant le logiciel Statistica version 6.1. L'analyse statistique a ete effectuee en utilisant l’ANOVA a deux facteurs ( P < 0.01 etP< 0,05). Base sur les resultats d'analyse de variance, la comparaison multiple de moyennes a ete realisee selon la methode de Duncan, pour un intervalle de confiance de 95 %, afin de determiner les variations significatives entre les differents traitements (Duncan, 1955). Dans le Tableau 3, les differentes lettres apres les valeurs a l'interieur de la meme colonne et pour chaque caractere, representent les differences significatives existantes. Les Traits etudies (rapport tige et racine : PL / RL) et la teneur en proteines de reserves (SPC) ont ete soumis respectivement a l'analyse de classification hierarchique utilisant la procedure de « Wards minimum variance » comme un algorithme de clustering. «Wards methode minimum » est une procedure de classification hierarchique dans lequel la similitude est utilise pour rejoindre des groupes et est calcule comme la somme des carres entre les deux groupes sommes sur toutes les variables (Hair et al. 1998). Le regroupement des genotypes donne des informations sur leur similitude et difference dans les reponses aux stress salin qui facilitent le choix des genotypes utilises dans les programmes de selection.

Cette partie experimental a ete realisee au sein du Laboratoire d’Amelioration des plantes a l’universite d’Oran 1.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Schema 1 : Protocole experimental pour les analyses biometriques et biochimiques de 4 genotypes de M. truncatula a differentes concentrations de NaCl.

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Schema 2 : Etapes de germination des graines sur le dessus de papiers absorbants dans des boites de Petri.

Resultats et Interpretation

Dans ce chapitre, nous presentons nos resultats en 3 points :

1. Influence du stress sel sur les differents parametres du developpement des jeunes plants

Les resultats presentes ici indique des differences dans la vigueur des graines germees, la longueur de la racine et de la tige chez les quatre genotypes etudies. Les donnees de l’analyse de variance (ANOVA) a un facteur et deux facteurs (Tab 1 et 2), ont montre une difference tres significative entre les genotypes en interaction avec le traitement salin pour l'ensemble des parametres de croissance etudie et qui diminuent avec l'augmentation de la concentration en NaCl (Tab 3). Par rapport au temoin, la longueur de la radicule et la tige diminuent avec la meme vitesse (2.9 a 1.17 cm et 3.1 a 1.15 ), respectivement. Le rapport tige / racine (PL : RL ratio) a diminue (de 1,17 a 0,76) ainsi que la vigueur des graines germees selon le gradient de salinite (de 5,47 a 2). Dans cette etude, nous avons utilise le parametre (rapport tige / racine PL : RL ratio) pour avoir plus d'informations sur la reduction de la longueur de la racine par rapport a la longueur de la tige (Fig 11).

Les resultats ont enregistre un faible ratio chez les genotypes Tru 131 et Tru 673 pour la majorite des traitements. Ces donnees confirment que la partie radiculaire est plus resistante a la salinite que la tige chez les genotypes tolerants. Cependant, ce ratio (tige / racine) augmente chez les genotypes juges sensibles Tru 26 et Jemalong, c'est a dire que la partie de la radicule etait plus sensible que la tige chez les genotypes sensibles (Fig 11). Les resultats de l'analyse des regroupements, methode de variance minimum de Ward des differents genotypes de M. truncatula pour le parametre (rapport tige / racine = PL : RL ratio) sous differents niveaux de stress salin, ont montre qu’il ya deux groupes de genotypes (Fig 12). Le premier groupe comprend les deux genotypes tolerants (Tru 131 et Tru 673) avec des valeurs faibles pour le ratio et une distance minimale (d = 1,08; Tab 4). Le deuxieme groupe comprend les genotypes sensibles (Tru 26 et Jemalong) qui ont une valeur elevee du ratio avec une distance minimale (d = 1,12).

Tab 1 : ANOVA a un facteur de l’effet du stress salin sur les differents parametres de developpement des jeunes plants chez les genotypes de M.truncatula

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RL : longueur de la radicule. PL: longueur de la tigelle. PL /RL Ratio. SL: longueur de la plantule. FGP: pourcentage de germination/ Final germination pourcentage. VS: Vigueur des graines. Niveau de signification * P < 0.05, ** P < 0.001, ns: Non significative, F: coefficient of Snedecor-Fisher

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Tab 2 : ANOVA a deux facteurs de l’effet du stress salin sur les differents parametres de developpent des jeunes plants chez les genotypes de M. truncatula

Niveau de signification * P< 0.05, ** P < 0.001, ns: Non significative, F: coefficient of Snedecor-Fisher

Tab 3 : Classification des moyennes des differents niveaux des stress salin sur les differents parametres de developpement chez M. Truncatula.

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Les moyennes mentionnees avec la meme lettre pour chaque trait n’est pas significative a 5% selon le test de Duncan.

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Fig 10 : Vigueur des grains des differents genotypes de M. truncatula sous differentes condition de stress salin. Les resultats sont des moyennes ± S.E (n = 4 repetitions).

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Fig 11 : Valeurs moyennes du ratio (Tige / racine) chez les differents genotypes de M. truncatula sous differentes concentrations de stress salin. Les resultats sont des moyennes ± S.E (n = 4 repetitions).

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Fig 12 : Analyse des groupes des genotypes de M. Truncatula sous differentes concentrations de salinite

pour le parametre ratio (Tige /Racine). Analyse du poids et de la teneur en proteines de reserves des graines

Les donnees du poids des graines seches (SDW) represente sur la figure 13, montrent que le genotype tolerant (Tru 131) avait un poids eleve (5,67 mg/graine) et le genotype sensible (Tru 26) avec un poids faible (2,27 mg/graine). A propos de la teneur en proteines de reserves (CPS), le genotype tolerant (Tru 131) qui a une teneur superieure en proteine de reserves (CPS = 0,31 mg g"1) que celles des genotypes sensibles (Jemalong et Tru 26 ) (CPS : 0,15 mg. g'1 et 0,077 mg g"1), respectivement (Fig 14). L’analyse des clusters pour la teneur en proteines de reserves (CPS) organise les genotypes de M. truncatula en deux groupes (Fig 15). Ce resultat est le meme obtenu a partir de l’analyse du cluster sur le rapport tige/ racine (Fig 12). Le premier groupe comprend les deux genotypes tolerants (Tru 131 et Tru 673) avec une distance minimum (d = 1,01). Le deuxieme groupe comprend ceux qui sont sensibles (Tru 26 et Jemalong) avec une distance minimum (d = 1,00 ; Tab 5). Ces donnees suggerent que les genotypes avec une haute teneur en proteines de reserves sont plus tolerants que chez les genotypes sensibles .

2. Relation entre les differents parametres du developpement des jeunes plants sous stress salin avec le poids des graines et la teneur en proteines de reserves

Il existe une relation positive et hautement significative entre le poids sec des graines (SDW ) et la longueur de la radicule (RL) avec un coefficient de correlation (r = 0,95* ; Tab 6). La figure 16, illustre cette association, par exemple, le genotype tolerant (Tru 131) qui a un plus haut poids des graines (SDW) a une longueur racinaire eleve (RL) et une meilleure croissance radiculaire. En outre, nous avons constate un coefficient de correlation positive ( r = 0, 92) entre la teneur en proteines et le poids ges graines (SPC et SDW ; Tab 6). La figure 17, illustre cette relation et le genotype le plus tolerant (Tru 131) a une valeur eleve que chez la plus sensible (Tru 26). Une autre donnee interessante, est l’association entre la teneur en proteines de reserves (SPC) et la longueur radiculaire (RL) avec un coefficient de correlation (r = 0, 84 ; Tab 6). La figure 18 montre cette association pour le genotype le plus tolerant (Tru 131) qui a la longueur la plus eleve des racines et une teneur superieur en proteines de reserves par rapport a la sensible (Jemalong) sous differentes concentrations de salinite.

Tab 4 : Matrice des distances entre les genotypes de M. truncatula sous differents niveaux de stress salin pour le ratio (Tige /Racine).

*Graines agees

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Tab 5 : Matrice des distances entre les genotypes de M. truncartula pour la teneur reserves.

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*Graines agees

Tab 6 : Coefficients de correlation (r) entre differents parametres de developpement desjeunes plants sous differentes concentration des salinite, poids des graines seches et la teneur en proteines de reserves chez M.truncatula.

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RL : longueur de la radicule. PL: longueur de la tigelle. PL /RL Ratio. SL: longueur de la plantule. FGP: pourcentage de germination. VS: Vigueur des graines. SPC: Teneur en proteines de reserves des graines. SDW: poids sec des grains. Niveaux de signification de correlation * P < 0.05

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Genotypes of M. truncatula

Fig 13 : Poids des graines seches des differents genotypes de M. truncatula. Les resultats sont des moyennes ± S.E (n = 4 repetitions)

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Fig 14 : Teneur en proteines de reserves chez les differents genotypes de M. truncatula. Les resultats sont des moyennes ± S.E (n = 4 repetitions)

Distance

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Fig 15 : Analyse des groupes des genotypes de M. Truncatula pour la teneur en proteines de reserves.

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Fig 16 : Relation entre la longueur de la Racine (RL) et le poids des graines seches (SDW) sous differentes concentration en stress salin chez les genotypes de M.truncatula.

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Fig 17 : Relation entre la teneur en proteines de reserves (SPC) et le poids des graines seches (SDW) chez les genotypes de M.truncatula.

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Fig 18 : Relation entre la teneur en proteines de reserves (SPC) et la longueur de la racine (RL) chez les genotypes de M.truncatula.

Discussion

La croissance des plantules est l'etape critique pour l’etude du comportement des plantes dans des conditions salines (Bosque - Perez et al. 1998). Les resultats montrent qu’en general, tous les parametres de developpement mesures ont diminue avec l’augmentation de la salinite. La salinite elevee peut inhiber l'allongement de la racine et en ralentissant l'absorption de l'eau par la plante (Werner et Finkelstein, 1995). La capacite des plantes a tolerer le stress salin varie selon le stade du developpement durant leur cycle de vie (Khan et al. 2002) et l'emergence des plantules est essentielle pour la mise en place des populations vegetales ( Khan et Gulzar, 2003). La majorite des recherches indique que la plupart des cultures annuelles sont tolerantes au stade germination mais sensible au cours du developpement vegetatif precoce (Maas et Grattan, 1999). Par ailleurs, Les racines sont la partie la plus sensible de la plante et ont un role central sur le controle de la transmission rapide d'information aux autres parties de la plante (Blaha et Pazderu, 2013). Ainsi, il est interessant d'examiner la croissance radiculaire par rapport a l'allongement de la tige dans differentes conditions de stress salin. Les resultats ont enregistre un faible ratio chez les genotypes Tru 131 et Tru 673 pour la majorite des traitements. Ces donnees confirment que la partie radiculaire est plus resistante a la salinite que la tige chez les genotypes tolerants. Le genotypes Tru 26 et Jemalong ont montre une faible tolerance au stress salin. Recemment, des travaux ont montre que le genotype Tru 26 est sensible au stress par le froid. Zahaf et al. (2012), ont analyse le transcriptome de la partie racinaire chez deux genotypes de M. truncatula ayant des reponses contrastees au stress salin : TN1.11 (tolerant), echantillonne dans un sol tunisien salin, et Jemalong A17 genotype de reference (sensible). Ainsi, les genotypes tolerantes ont montre une croissance accrue des racines sous stress salin et une accumulation differentielle des ions de sodium par rapport a Jemalong A17. Les memes auteurs ont constate que les longueurs des racines chez ces deux genotypes contrastes ont ete significativement reduites apres 90-150 mM NaCl par rapport aux plantes non traitees. Dans notre etude, nous avons observe une reduction significative de la longueur des racines apres 68­102 mM de NaCl par rapport a des plantes temoins. Les resultats analysees confirment que le genotype Tru 673 (issues de graines agees) est associe au genotype tolerant Tru 131. Blaha et Pazderu (2013) ont rapporte que pendant une longue duree de conservation des graines, ces derniers perdent rapidement l'energie de germination (faible vigueur) et les graines agees peuvent influencer la croissance optimale des graines.

II semble que les changements les plus importants pendant une longue duree de conservation des graines, proviennent des conditions environnementales qui peuvent causer la degradation des proteines de reserves. D'autre part, des graines de qualite sont des graines non endommages qui ont un taux eleve de germination, qui produiront desjeunes plants uniformes et vigoureux (Dickson, 1980). Concernant le sensibilite de Jemalong, le meme resultat chez le genotype sensible Jemalong A17 sous stress salin a ete trouve par (Zahaf et al. 2012).

Les resultats obtenus ont montre que les genotypes avec une haute teneur en proteines de reserves sont plus tolerants (Tru 131 et Tru 673) que chez les genotypes juges sensibles (Tru 26 et Jemalong). Dornbos et al. (1991) ont constate que le stress hydrique reduit le poids moyen de la graine de 15% a 27°C, et de 22% a 33° C. Aussi, Erskine et Ashkar (1993), a explique la reduction du poids moyen des graines chez la lentille avec l'augmentation de la limitation de l'eau de la graine, peut etre entraine par la stimulation de la maturite des graines en situation de stress. La taille des graines est considere comme un facteur important que pendant les premiers stades de croissance (Ghassemi- Golezani ,1992) et il est interessant d'utiliser des graines d’un poids eleve, comme le cas des graines du genotype le plus tolerant (Tru 131) dans l’agriculture. Djemel et al. (2005) ont affirme que les graines de M. truncatula accumulent de grandes quantites de proteines de reserves jusqu'a 32-42 % du poids sec. Ceci suggere que le genotype le plus tolerant (Tru 131) a un potentiel genetique (genes) pour resister au stress salin. Les proteines qui s'accumulent dans les plantes dans des conditions salines peuvent fournir une forme de stockage de l'azote qui est reutilisee plus tard (Singh et al. 1987) et peuvent jouer un role dans l'ajustement osmotique. Leur fonction de protection consiste a stabiliser les structures membranaires (Tolleter et al. 2010). L’induction de la tolerance au stress est correle avec l'apparition a la fin de l'embryogenese des proteines (LEA) et aux proteines de choc thermique (HSP) qui s'accumulent lors de la maturation tardive des graines sous controle de l'acide abscissique (ABA) (Gallardo et al. 2001). Ces proteines qui sont impliquees dans la tolerance au deficit hydrique et sur la longevite des graines orthodoxes sont egalement induits par la salinite et peuvent agir comme osmoprotecteurs et antioxydants (Kalemba et Pukacka, 2007).

Les resultats ont montre que le genotype tolerant (Tru 131) qui a un plus haut poids des graines (SDW) a une longueur racinaire eleve (RL) et une meilleure croissance radiculaire. Toon et al. (1990) ont montre que la taille eleve des graines ont une meilleure qualite et un grand potentiel genetique pour la germination. Cependant, la qualite des graines peut etre liee a la variation de la teneur en nutriment de ces graines (Abidine et al. 1993) et aussi de le type de collection des graines (Bellari et Tani, 1993). Apres l’anthese et en cas de carence d'eau, une correlation positive a ete trouvee entre le poids des grains et l'indice de recolte chez le ble (Koocheki et al. 2006).

Les racines sont influencees par la qualite des graines au debut de la croissance des plantes. Generalement, on sait que la qualite biologique des graines est egalement l'un des facteurs fondamentaux qui influence sur la croissance et le developpement des racines pendant la periode de vegetation (Blaha et Pazderu, 2013). En plus, les resultats analysees demontre que le genotype le plus tolerant (Tru 131) qui a la longueur la plus eleve des racines a aussi une teneur superieur en proteines de reserves par rapport a la sensible (Jemalong). (Ingram et Bartels, 1996) ont affirme que chez les plantes superieures, le stress osmotique induit plusieurs proteines qui sont lies aux proteines (LEA) et aux proteines du choc thermique (HSP). La correlation entre l’accumulation de ces proteines et la tolerance au stress salin indique le role de protecteur contre le stress hydrique et que la qualite des graines a augmente au cours des derniers stades de developpement, apres que les graines ont atteint un poids sec maximal (Sanhewe et al. 1996).

En conclusion, l'etude de l'effet du stress salin sur le developpement des plantules chez quatre genotypes de M. truncatula, montre une variabilite significative entre les differents genotypes. Un ratio faible (Tige / racine) a ete observee chez les genotypes tolerantes (Tru 131) et (Tru 673). Ceci explique la resistance racinaire au stress salin par rapport a la tige. En outre, cette etude montre l'influence de Page des graines de l’ecotype (Tru 673) sur le developpement de la racine et la croissance de la tige separement, mais pas sur le rapport tige : racine et la capacite a tolerer le stress salin. Cela peut s'expliquer par la presence des genes impliques dans la tolerance a la salinite. Le meme regroupement des genotypes a ete obtenu pour la teneur en proteines de reserves (CPS). Cela permet de conclure que les genotypes avec un rapport tige : racine eleve ont une teneur eleve en proteines de reserves chez les genotypes les plus tolerants (Tru 131 et Tru 673) que celles des genotypes sensibles (Tru 26 et Jemalong). Neanmoins, d'autres investigations sont necessaries pour evaluer l'accumulation de ce type de proteine en rapport avec la tolerance a la salinite.

Chapitre 3

Analyse de la Diversite Genetique des Proteines de Reserves par Electrophorese

Analyse de la Diversity Genetique des Proteines de Reserves par Electrophorese

Les graines de Medicago truncatula accumulent une large quantite de proteines a la maturite jusqu’a 32- 42 % du poids sec (Djemel et al. 2005). La salinite est un stress abiotique important qui affecte significativement la croissance des legumineuses en relation avec l’expression des proteines issues des proteines de reserves des graines. Ce genre de proteines sont consideres comme des facteurs influenqant sur la diversite genetique (Rodrigues-Quijano et al. 2001). Ils sont polymorphes et extremement stables (Valero et al. 2009).

La methode SDS-PAGE est une technique adequate pour identifier les varietes et sont utilises avec succes dans revaluation de la diversite genetique (Sharma et Maloo, 2009). La caracterisation des graines est necessaire pour revaluation des ressources genetiques et l’utilisation des genotypes interessants dans les programmes de conservation et d’amelioration (Hamrick et al. 1991; Crawford et al. 2001). L’evaluation du niveau et de la structure de la diversite genetique des proteines de reserves des graines chez M. truncatula est un acquis pour l’amelioration des plantes et les programmes de conservation des ressources genetiques.

Le but de notre etude est revaluation de la diversite genetique entre les differents genotypes de M. truncatula et la determination des bandes proteiques en relation avec la tolerance au stress salin.

Materiels et methodes

1. Materiel

Des graines appartenant aux quartes genotypes differents de M. truncatula, etudies dans le chapitre (2) ont ete utilises pour l’analyse de la diversite genetique des proteines de reserves.

2. Methodes

2. 1. Extraction des proteines de reserves et SDS-PAGE

Nous avons extrait les proteines de reserves des graines selon la procedure de Fyad Lameche (1998) modifiee. Les proteines sont extraites a partir de chaque graine pour chaque genotype et homogeneisees avec le tampon d’extraction (50 mM Tris-HCl (pH :6,8), 2% SDS, 2,5 % beta-mercaptoethanol, 10 % Glycerol). Les echantillons sont centrifuges a 14000 tours par minute durant 15 min et le surnageant est separe pour les differents essais. La procedure Laemmli (1970) a ete utilise pour l’analyse des proteines par l’electrophorese en SDS PAGE discontinu verticale (4,5 et 7,5 %). La methode de coloration standard et la decoloration a ete utilise pour visualiser clairement les fragments proteiques pour un scorer (scoring) des bandes : les gels ont ete colores dans 0.25 % de bleu de coomassie brillant blue - R250, decolores dans 50 % de methanol v/v, 40 % d’acide acetique v/v et 10% d’eau distillee.

2. 2. Analyse des donnees

Les electrophoregrammes de chaque genotype ont ete scores et la presence d’une bande (1) ou l’absence (0) a ete note. La presence ou l’absence d’une bande ont ete enregistre dans une matrice binaire et analyse par le logiciel Statistica (version 6.1), base sur le coefficient de similarite de Jaccard. Le dendrogramme est construit selon de la methode d'un groupe de paire non pondere avec les moyennes arithmetiques (UPGMA ; Fig 20).

Cette partie experimentale a ete realisee au sein du Laboratoire d’Amelioration des Plantes a l’universite d’Oran 1.

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Schcma 3 : Protocole d'extraction et analyse des proteines dc reserves par eleclrophorese SDS PAGE

Resultats et interpretation

1. Analyse du polymorphisme des profiles proteiques

Les profiles des proteines chez les differents genotypes de Medicago truncatula ont ete etudies et revelent des variation quantitatives et qualitatives en terme du nombre de bandes, leurs intensite et leurs poids moleculaire (Tab 7). En se basant sur le poids moleculaire des bandes, les profiles ont revele trois regions.

La region I (10 - 40 kDa) comprend 10 bandes. La region II (40 - 60 kDa) consiste en 5 bandes et la region III ( 60 - > 80 kDa) apparait avec 5 bandes. Les 20 bandes proteiques (polypeptides) de poids moleculaire divers allant de 10 a > 80 kDa ont ete identifies. Deux sont monomorphiques (bande 1 et 9) localisees dans la region I et II, respectivement, et sont commun chez tous les genotypes. Les genotypes montrent une considerable variation dans le nombre de bandes proteiques allant de 7 a 14 bandes. Parmi ces genotypes, le genotype tolerant Tru 131 montre un maximum de bandes proteiques (14), alors que le genotype sensible Tru 26 montre un minimum de 7 bandes. Les genotypes Tru 673 et Jemalong ont enregistre un nombre moyen de bandes, dix et onze respectivement. Les bandes 6, 11 et 15 sont absentes chez le genotype sensible (Tru 26). Cependant, la bande (4) est presente seulement chez Jemalong et les bandes 3,5,8,10 et 18 sont presents chez le genotype Tru 673, les bandes 7 et 20 chez le genotype Tru 131. Toutefois, les bandes 13 et 14 (region III) tres polymorphes, sont presents chez les genotypes tolerants (Tru 131 et Tru 673) mais non chez les genotypes sensibles (Tru 26 et jemalong). Ces bandes proteiques (polypeptides) peuvent etre consideres comme specifiques aux genotypes tolerants (Fig 19). En meme temps, on note la presence des bandes 16 et 17 hautement polymorphes chez le genotype tolerant Tru 131 et le genotype sensible. Ces bandes sont absentes chez les autres genotypes.

2. Recherche de similarites par analyse des clusters

L’indice de similarite pour les quatre genotypes varie de 13,3 a 66,7 %. Un haut pourcentage de similarite entre les genotypes Tru 131 et jemalong a ete enregistre et qui est de 66,7 %, malgre leurs difference pour la tolerance au stress salin, car il y a plus de bandes intenses (variation quantitatives) chez le genotype tolerant (Tru 131) que le genotype sensible (jemalong), alors qu’un minimum de similarite existe entre les genotypes (Tru 26 et Tru 673) avec des variation quantitatives majeurs. L’analyse du regroupement (Clustering) des genotypes base sur l’indice de similarite et UPGMA donne trois groupes differents (Fig 20). Le premier groupe comprend un genotype moderement tolerant (Tru 673). Le deuxieme groupe compose de deux genotypes contrastes Tru 131 et Jemalong vis-a-vis du stress salin mais avec des modifications quantitatives majeures (presence des memes bandes avec differentes intensites). Le troisieme groupe comprend un seul genotype (Tru 26),juge sensible au stress salin. Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

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Fig 19 : Profiles des proteines de reserves chez les quatre genotypes de M. truncatula. M: molecular weight marker (10 - 256 KDa: BioLabs). 1 : Tru 26. 2 : Tru 673. 3 : Tru 131.4 : Jemalong.

Tab 7 : Nombre et Type de bandes de la diversity genetique chez les quatre genotypes de Medicago truncatula.

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Tab 8 : Matrice de similarite basee sur le coefficient de Jaccard pour les proteines de reserves des graines chez les genotypes de M. Truncatula .

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Fig 20 : Dendrogramme (UPGMA) base sur les profiles proteiques des proteines de reserves chez M. Truncatula.

Discussion

Les profiles des proteines chez les differents genotypes de Medicago truncatula revelent des variation quantitatives et qualitatives. Les profiles proteiques des graines sont souvent specifiques des especes et hautement stables (Ladizinsky et Hymowitz, 1979). Ces memes auteurs rapportent la presence d’une variation dans le nombre et la position et l’intensite des bandes chez des accessions de M. truncatula, suggerant que ces bandes sont sous controle d’un systeme de genes quantitatives.

Les resultats decrits ci-dessus, montrent que la region III est plus polymorphe que les regions I et II. Ceci suggere que la region III est hautement polymorphe et sans la presence de bandes monomorphes. Cette region est peut etre implique dans le controle de la tolerance au stress salin chez Medicago truncatula. Fyad Lameche et al. (1996) affirment que la variation des bandes (absence ou presence) au sein des especes annuelles du genre de Medicago peut etre due a l’expression d’un seul locus, ou chaque bande est controle par un allele et chaque bande correspond a un monomere. Une autre suggestion signale par Shepherd (1968) et Kalinova (2006), que chaque bande est gouvernee par plusieurs genes localises sur differents chromosomes.

L’indice de similarite pour les quatre genotypes, nous a permis d’evaluer la degre de ressemblance et de diversite entre les profils proteiques de chaque genotype. Damerval et al. (1987) suggerent que les variations quantitatives dans les niveaux du produit d’un gene revele par la technique d’electrophorese est une base plus importante dans la detection des changements morphologiques et adaptatives que les variations classiques (presence /absence) de bandes. Dans le meme contexte, Malik et al. (2009), montrent que des accessions du soja a partir de sources variees different considerablement, indiquant qu’il n’y a pas une relation definie entre la diversite genetique et la diversite geographique. Des resultats similaires ont ete reporte par (Ghafour et al. 2003) chez le pois chiche. Le degre de lien genetique entre les genotypes, en se basant sur les informations obtenues du dendrogramme (pedigree) peut de fois etre imprecis ou incomplet (Maccaferri et al. 2003). Djabeur et al. 2008, ont montre que des modifications intraspecifiques existent dans les profiles proteiques de l’espece Lygeum spartum L, une graminee perenne. Ces modifications etaient concomitantes avec des facteurs externes climatiques. Le dendrogramme obtenu dans notre etude, revele une diversity genetique moderee car deux parmi les quatre genotypes sont dans differents groupes appartenant a la meme espece. Nos resultats suggerent que les deux genotypes contrastes (Tru 673 et Tru 26), montrent un meilleur demarquage des profiles proteiques pour leurs presence ou absence de bandes, mais l’intensite des bandes est tres recommandee pour une bonne discrimination entre les genotypes tolerants et sensibles, ceci est illustre par exemple, par la comparaison entre le genotype tolerant (Tru 131) avec une intensite des bandes elevee et le genotype sensible (Tru 26) avec une faible intensite.

En conclusion, la technique SDS-PAGE des proteines de reserves des graines peut etre utilise pour revaluation de la diversite genetique chez Medicago truncatula en relation avec les donnees sur la tolerance au stress salin. L’analyse des resultats a revele une variation moderee entre les genotypes, ainsi les bandes 13 et 14 sont specifiques des genotypes juges tolerants Tru 131 et Tru 673. Aussi l’intensite des bandes proteiques en relation avec le stress salin est vraiment recommandee pour discriminer entre les genotypes tolerant et ceux juges sensibles comme par exemple entre Tru 131 et Tru 26. Ces informations peuvent etre utilisees pour identifier specialement les nuances entre les differents genotypes sous stress salin chez l’espece modele Medicago truncatula.

Chapitre 4

Etude du Comportement de deux Genotypes contrastes de Medicago truncatula Gaertn vis-a-vis du Stress Salin

Etude du Comportement de deux Genotypes contrastes de Medicago truncatula Gaertn. vis-a-vis du Stress Salin

A un stade precoce de developpement des jeunes plants, la germination devient un facteur determinant pour le developpement de la plante sous Taction de la salinite. Ainsi, toutes les graines n'ont pas la meme capacite de tolerer la dessiccation. Les proteines qui s'accumulent chez les plantes en croissance sous l’effet du stress salin, jouent un role important dans l'ajustement osmotique (Singh et al. 1987). Il est donc interessant de trouver une association entre la teneur en proteines solubles au cours de l’ontogenese et la tolerance au stress salin, car, la diminution de la synthese des proteines et le polymorphisme dans les profiles proteiques est un phenomene commun pour les differentes plantes sous stress salin (Merril, 1990).

L’objectif de la presente etude, est d’evaluer la variabilite genetique au niveau phenotypique (aptitude de germination) et au niveau biochimique (synthese des proteines solubles) pour la tolerance au stress salin entre deux genotypes contrastes, l’un tolerant Tru 131 et l’autre sensible Jemalong.

Materiels et methodes

1. Materiel

Notre etude a porte sur deux genotypes contrastes de M. truncatula. Le tolerant (Tru 131) nous a ete fournis par l’IDGC Belabess et le genotype Jemalong «sensible», ont ete utilises a quatre concentrations de NaCl (0,68, 102 et137 mM).

2. Methodes

2.1. Condition de germination et parametres calcules

Pour chaque genotype, quarante graines scarifies apres desinfection sont reparties en quatre lots, le lot temoin et trois lots traites a differentes concentrations. Les graines sont mises a germer a l’obscurite en boite de Petri fermees et tapissees avec du papier filtre imbibe du milieu correspondant, dans une etuve a une temperature de 25 ± 2°C. Chez Medicago truncatula, la condition optimale est l’obscurite et la lumiere diminue la vitesse de germination (Gimeno Gilles, 2009). Les graines germees sont denombrees quotidiennement afin d’analyser la cinetique de germination, l’emergence de la radicule etant l’indicateur de la germination. Les boites de Petri sont arrosees tous les deux jours (3 ml par boite de solution des differentes concentrations de NaCl) pour maintenir les graines toujours imbibees.

Neuf jours apres le semis et a une temperature de 25 ± 2°C, le taux de germination (TG) est calcule afin d’analyser la capacite germinative, car apres cette duree, un taux eleve de graines germees est observe aux differentes doses de salinite. Ces taux representent le pourcentage de graines germees par rapport au total de graines semees.

Pour determiner la tolerance d’un genotype, un indice (I.T) egal au rapport de la valeur notee sous stress sur celle du temoin, est calcule. Il a ete considere que les plantes tolerantes ont un indice de tolerance plus eleve que les plantes sensibles. Afin de normaliser les deux variables (TG et I.T), les valeurs ont ete analysees apres transformation mathematique par (ArcsinVx) afin de normaliser les donnees (loi normale). Le dispositif experimental utilise est un dispositif bloc, echelonne dans le temps, completement aleatoire, avec trois repetitions (n = 3). Dans chaque repetition, chaque genotype est represente par dix individus.

2.2. Determination de la teneur en proteines des jeunes plants sous stress salin

La teneur en proteines de reserves a ete determinee par la meme methode decrite dans le chapitre 2. La teneur des jeunes plants en proteines solubles (mg / g) a ete calculee en fonction du poids frais desjeunes plants (mg) pour chaque genotype.

Cette partie experimental a ete realisee au sein du Laboratoire d’Amelioration des Plantes a l’universite d’Oran 1.

Resultats et interpretation

1. Etude de la variabilite de la tolerance a la salinite au niveau phenotypique et biochimique durant la germination

Le stress salin, quelle que soit la concentration en NaCl, diminue le taux de germination des graines. Le test de l’analyse de variance a deux facteurs, s’est revele hautement significatif pour l’effet traitement sur le taux de germination (Tab 9). Les taux de germination en absence de stress sont compris entre 90 et 100 %. Le genotype Tru 131 presente l’indice de tolerance le plus eleve pour le taux de germination quel que soit le traitement par rapport a Jemalong. Les indices de tolerance du taux de germination enregistres sur l’ensemble des trois repetitions de l’experience montre que le genotype Tru 131 est le plus vigoureux et qui tolere le mieux au stress salin, tandis que le genotype Jemalong, le moins vigoureux, tolere le moins l’effet de ce stress.

A la lecture du Tableau 9 sur l’analyse de variance a deux facteurs, ceci montre un effet genotype et traitement significatifs pour l’indice de tolerance (IT), et un effet traitement hautement significatif pour le poids frais des jeunes plants. Sous stress salin, le genotype Tru 131, montre un poids frais eleve des jeunes plants (Fig 23) et une teneur en proteines augmente par rapport a Jemalong (Fig 24).

2. Cinetique de germination

La cinetique de germination presente sur les Figures 27, 28 et 29, montrent que les courbes relatives aux taux de germination des graines sous stress salin, sont situees en dessous de celles du temoin (Fig 26). Elles diminuent au fur et a mesure que la concentration de NaCl augmente. En conditions temoins, les deux genotypes Tru 131 et Jemalong, presentent une capacite de germination elevee surtout pour Jemalong. Pour ce dernier, la capacite germinative se stabilise a partir du deuxieme jour (J2), alors que chez Tru 131, la vitesse se stabilise a partir du huitieme jour (J8). Sous stress salin, les resultats de l’essai montrent que les concentrations 68, 102 et 137 mM de NaCl reduisent la vitesse et la capacite germinative des graines. Toutefois, le genotype Tru 131, s’avere le plus tolerant, avec une capacite de germination plus elevee que celle de Jemalong (Fig 25).

40 graines chaquegeiioHpe (Tin 131 .Toleram et Jeuialong, sensible)

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Schema 4. Protocole experimental pour les analyses biometriques et biochimiques des genotypes : Tru 131, tolerant et Jemalong, moins tolerant, sous differentes concentration de NaCl.

Tab 9 : Resultats de l’analyse de variance a deux facteurs de l’effet traitement, genotype et leurs interaction pour les parametres : taux de germination et indice de tolerance, poids fTais et teneur en proteines

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Fig 21 : Resultats du taux de germination des deux genotypes de M. truncatula Tru 131, tolerant et Jemalong, moins tolerant) sous l’effet NaCl. Les resultats sont des moyennes ± S.E (n = 3 repetitions).

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Fig 22 : Indice de tolerance des deux genotypes de M. truncatula (Tru 131, tolerant et Jemalong, moins tolerant) sous l’effet NaCl. Les resultats sont des moyennes ± S.E (n = 3 repetitions).

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Fig 23 : Poids frais desjeunes plants des deux genotypes de M. truncatula Tru 131, tolerant et Jemalong, moins tolerant) sous l’effet NaCl. Les resultats sont des moyennes ± S.E (n = 3 repetitions).

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Fig 24 : Teneur en proteines solubles desjeunes plants chez les deux genotypes contrastes de M. trunacatula (Tru 131, tolerant et Jemalong, moins tolerant) sous differentes concentrationNaCl. Les resultats sont des moyennes ± S.E (n = 3 repetitions).

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Fig 25 : Croissance des plantules de deux genotypes contrastes de M. truncatula (Tru 131 et Jemalong) sous differentes concentration NaCl.

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Fig 26 : Cinetique de germination des graines des deux genotypes de Medicago truncatula en condition temoin

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Fig 27 : Cinetique de germination des graines des deux genotypes de Medicago truncatula a une concentration de NaCl faible (68mM)

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Fig 28 : Cinetique de germination des graines des deux genotypes de Medicago truncatula a une concentration de NaCl moderee (102mM)

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Fig 29 : Cinetique de germination des graines des deux genotypes de Medicago truncatula a une

concentration de NaCl maximale (137 mM)

Discussion

Les donnees obtenus apres une duree de traitement de neuf jours, indiquent que les taux de germination des graines diminuent considerablement avec l’augmentation de la salinite (Fig 21). Ainsi, toutes les graines n’ont pas une capacite identique de tolerer la salinite (Gimeno Gilles, 2009). Selon Prado et al. (2000), la diminution du taux de germination des graines soumises a un stress salin serait due a un processus de dormance osmotique developpe sous ces conditions de stress. Les resultats analyses, illustrent que le genotype Tru 131 qui est le plus vigoureux avec un poids frais eleve des jeunes plants et une teneur en proteines augmente, tolere le mieux le stress salin par rapport au Jemalong. Farissi et al. (2014) ont constate que la salinite affecte negativement la production fourragere des populations marocaines de luzerne. Il en est de meme pour divers parametres qualitatifs (rapport feuilles/tiges et teneurs des plantes en azote et en proteines). Chez Medicago sativa, le gene Alfinl code pour une famille de facteurs de transcription et leur expression est correlee avec la tolerance au sel (Winicov et Bastola 1999). Une teneur elevee en proteines solubles a ete observee chez des cultivars de riz tolerants au stress salin (Ashraf et Harris, 2004). Agastian et al (2000) ont rapporte que les proteines solubles augmentent a faible dose de salinite et diminuent a forte concentration chez des cultivars de muriers.

Il a ete reporte aussi que le stress salin declenche l’expression de plusieurs proteines osmo-sensible dans les tissus de riz et une correlation a ete trouvee entre l’accumulation de ce type de proteines chez les genotypes tolerants, par rapport aux genotypes de riz sensibles la salinite (Chourey et al. 2003 ; Kumar et al. 2009). Chez les vegetaux superieurs, le stress osmotique induit la synthese de plusieurs proteines dans les tissus vegetatifs, qui sont relies aux proteines LEA (late-embryogenesis-abundant proteins). La correlation entre l’accumulation de ce type de proteines et la tolerance au stress, indique le role protecteur de ces proteines sous deficit hydrique (Ingram et Bartels, 1996). Ainsi, le proteome qui contient des niveaux eleves en proteines LEA et en chaperons, ont un role important dans la tolerance au stress en relation avec la dormance des graines (Grobei et al. 2009). A forte dose de NaCl, chez les deux genotypes etudies, la synthese des proteines solubles est diminuee.

La cinetique de germination revele un ralentissement du processus de germination en fonction du stress salin. La cinetique de germination semble etre regulee par la temperature, l’optimum varie d’un genotype a un autre et d’une espece a l’autre selon le milieu auquel est adaptee (Gimeno Gilles, 2009). Une certaine precocite de germination a ete remarque chez Jemalong par rapport a Tru 131. D'apres Ben Miled et al. (1986). Ceci semble etre due a une difference dans le temps necessaire a la graine pour mettre en place les mecanismes lui permettant d’ajuster sa pression osmotique interne.

Aussi, on remarque qu’il y a une difference dans la vitesse de germination entre les deux genotypes. Ceci est en fonction de la temperature et de la reponse au deficit hydrique (Brunei Muguet, 2008).

Les plantes ont developpe des mecanismes complexes pour affronter les changements environnementaux. Au niveau moleculaire, ceci est illustre par de nombreux changements dans le transcriptome, observes chez les plantules, les feuilles, les racines (Kreps et al. 2002). De ce fait, il est possible de rechercher les bases genetiques qui expliquent le polymorphisme de reponse au stress salin au cours de la germination et durant l’ontogenese afin de determiner les genes responsables de la tolerance a la salinite.

En conclusion, la variation des capacites germinatives des graines permettent de bien discriminer les genotypes quant a leur tolerance ou sensibilite au sel au cours de la germination. Ainsi, le genotype Tru 131, presente la meilleure aptitude a la germination en conditions salines avec une teneur elevee en proteines, et peut etre considere comme le plus tolerant par rapport a Jemalong. La Culture de cette plante tolerante et son introduction dans les zones arides et semi- arides, semble presenter un grand interet agronomique (production fourrageres) et pedologique (fixation de l’azote atmospherique). Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Chapitre 5

Caracterisation Physiologique et Biochimique de la Racine de deux genotypes contrastes de Medicago truncatula Gaertn sous Stress Salin

Caracterisation Physiologique et Biochimique de la Racine de deux genotypes contrastes de Medicago truncatula Gaertn. sous Stress Salin

La salinite elevee affecte les plantes causant un stress hyper-osmotique et un desequilibre ionique, generant des effets secondaires comme l’accumulation des elements (ROS : reactive oxygen species) et une croissance ralentie (Hasegawa et al. 2000, Zhu 2001). Les enzymes antioxydants jouent un role crucial dans la protection des tissus des plantes sous condition de stress, principalement la salinite et la secheresse (Franca et al. 2007, Lima et al. 2002, Poli-doras et al. 2005, Fotopoulos et al. 2008, Fotopoulos et al. 2010). II a ete reporte que certaines especes peuvent developper une forte tolerance au stress salin car il y a une augmentation des enzymes antioxydants et d’autres composants (Lopez et al. 1996, Shalata et al. 2001). Divers etudes indiquent aussi la surexpression des genes antioxydants, entrainant des niveaux eleves en elements « ROS » qui ameliorent la tolerance aux stress abiotiques y compris le stress salin (Badawi et al. 2004, M’Hamdi et al. 2010, Tseng et al. 2007, Zhao et Zhang, 2006). L’etude de ces genes antioxydants ainsi que les enzymes et les composants qui offrent un certain degre de tolerance au stress salin peut etre un avantage dans la comprehension de la tolerance a la salinite et 1’amelioration des cultivars tolerants au stress abiotiques.

Le but de notre etude est d’evaluer Timportance de la defense antioydante dans la manifestation de la tolerance a la salinite et les alterations dans le statut oxydatif chez les deux genotypes contrastes etudies de M. truncatula (tolerant et sensible) au niveau racinaire. Materiel et methodes

1. Materiel vegetal

Notre etude a ete conduit sur deux genotypes contrastes de M. truncatula. Jemalong, le genotype de reference qui est moyennement sensible et le genotype tolerant T131 (Amouri et al. 2014).

2. Methodes

2.1. Condition de croissance sous le traitement par NaCl

Apres scarification et sterilisation, les graines sont placees a 4°C durant une joumee dans des boites de Petri afin d’homogeneiser la vitesse de germination, ensuite transferes dans differents traitements de NaCl ( Control : 0 mM, Tl: 68 mM, T2: 102 mM et T3: 137 mM). Apres 7 jours de traitement, les racines des jeunes plants sont sujettes aux differentes analyses physiologiques et biochimiques.

2. 2. Mesure des differents parametres biometriques (longueur et poids des racines)

La longueur de la racine a ete mesure chez 10 individu de plantules de chaque boite de Petri. En plus, chaque racine est pesee pour determiner le poids frais individuel (RW).

Le poids sec (DW) est determine apres sechage des echantillons de (5) racines a 70°C durant 48h. Notant que ce parametre est utilise pour le calcul de la masse moleculaire des antioxydants et le contenu en proteines solubles racinaires.

2. 3. Calcul du potentiel hydrique de la racine

Le potentiel hydrique des racines (*?«,) des deux genotypes et pour chaque traitement de NaCl, est mesure par un appareil appele osmometre (Annexel), ce potentiel est exprime en unite de pression (MPa). Des echantillons de cinq (5) racines de chaque boite sont utilisees pour mesurer le potentiel hydrique (Schema 6).

2. 4. Determination de l’activite Guaiacol peroxydase

L’activite Guaiacol peroxydase (EC 1.11.1.7) (GPX) a ete mesure selon 1’augmentation dans Pabsorbance a 470 nm en fonction de Poxydation du Guaiacol (Nickel et Cunningham, 1969). Le milieu reactionnel comprend 100 pL de I-LCL (1.5 %) + 100 pL de Guaiacol (20 mM). Les racines des deux genotypes pour les differents traitements sont incubees durant 6 h dans le milieu reactionnel a 4° C. L’absorbance a ete mesure a 1‘aide d’un spectrophotometre a UV visibles (Schema 7). L’activite enzymatique est exprimee en nmol de tetraguaiacol produit par mg de proteines par minute. 2. 5. Extraction et dosages des proteines solubles racinaires

L’extraction est faite a partir de 200 mg de racines trades et non trades par NaCl des deux genotypes etudies de M. truncatula. les echantillons sont homogeneises dans 50 mM du Tris Hcl (pH=7,8) (1/4, w/v) contenant 0,1 mM EDTA, 2mM ddhiothredol (DTT), 0,2 % (v/v) Triton X- 100 et ImM PMSF. Les homogenats sont fibres au travers une feuille de miracloth et centrifuges a 25000 x g durant 25mn a 4°C (Schema. 8). Le surnageant est recupere pour le dosage des proteines solubles par la methode de Bradford (1976).

2. 6. Extraction et determination de la masse moleculaire des antioxydants

Le Gluthatione (GSH) et l’Ascorbate (ASC) sont extraits a partir d’echantillons de racines conservees a froid et analysees, selon la methode decrite par (Zabala et al. 2006), et analyses par l’electrophorese capillabe a haute performance (Beckman Coulter Inc., USA).

L’extraction est faite a partir de 60 a 100 mg d’extremites de racines, homogeneisees avec de l’azote liquide et de l’acide metaphosphorique (2%), contenant ImM EDTA (1/3 ; v/v). Pour avoir la quantite du pool total du Gluthatione (GSH+GSSH) et de l’ascorbate (ASC+DHA), Les extraits des antioxydants sont trades avec le dithiothreitol (DTT). Les formes reduites sont directement mesurees a partir d’extraits de pointes de racines (Davey et al. 2003) apres calibration avec du GSH et ASC purifies (Schema. 9).

Nb : Pour chaque parametre etudie, les racines ont ete conservees dans l’azote liquide.

2. 7. Analyse statistique

Nous avons represente les resultats de tout les parametres en moyenne ± SE (erreur standard), pour chaque traitement, avec 3 repetitions de mesures. Tout les tests statistiques sont obtenus pax- le logiciel Statistica version 6.1 et Microsoft office Excel. Nous avons utilise l’analyse de variance a deux facteurs (ANOVA) afin d’etudier l’interaction entre l’effet traitement par NaCl et l’effet genotype (pour P< 0.01 et P<0.05).

Cette partie experimentale a ete effectuee au sein du Laboratoire de Physiologie Vegetale a l’Universite de NAVARA en Espagne. Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

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Schema 5 : Protocole experimentale pour Ics analyses biomelriquc, physiologiquc et biochimique au nivcau racinaire. de 2 genotypes Tru 13 let Jenialong. sous differences concentration de NaCI.

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Schema 6 : Eupes de mesure du potentiel hydrique (Ψw) rocinaire des 2 genotypes de M. truncatula a diferentes concentration de NaCI

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Schema 7: Mesure de l'activite GPX au niveau des racines des 2 genotypes de M truncatula aux differents traitement par NaCl

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Schéma 8 : Extraction et dosage des protéines solubles racinaires de 2 génotypes de M. truncatula (Tru 131 et Jemalong) à différentes concentration de NaCl

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Schema 9 : Extraction et analyse des antioxydants de 2 genotypes de M. truncatulci a differentes concentrations de NaCIResultats et interpretation

1. Effet du stress salin sur la longueur, le poids et le potentiel hydrique de la racine

Les resultats de l’analyse de variance (Tab 10) ne montrent pas des differences significatives concernant la longueur de la racine (RL), poids individuel des racines (RW), leur potentiel hydrique. Chez les jeunes plants traites au stress salin, la longueur de la racine diminue (Fig 30). En general, tout les parametres de croissance racinaire mesures diminuent avec F augmentation de la salinite.

Le potentiel hydrique des racines, diminue considerablement chez le genotype juge tolerant Trul31 par rapport genotype sensible Jemalong (Fig 32), ceci demontre la capacite des racines du genotype tolerant Tru 131, a absorber suffisamment de l’eau du milieu exterieur par rapport au genotype moins tolerant.

Concernant le poids sec des (DW), les resultats n’ont pas montre des differences significatives au stade de 7 jours du developpement des racines, mais on remarque que le genotype Tru 131 presente un poids eleve surtout a la concentration de 102 mM de NaCl (voir resultats en annexe 1).

2. Effet du stress salin sur l’activite Gai'acol peroxydase (GPX)

L’activite in vivo de Gai'acol peroxydase, (Fig 33), montre qu’il y a une augmentation de l’activite Guaiacol peroxydase a la concentration minimale de 68 mM de NaCl chez les deux genotypes, alors qu’a la dose de 102 mM, l’activite GPX diminue chez les deux genotypes. A une concentration maximale de 137 mM de NaCl, l’activite GPX augmente significativement chez le genotype tolerant Tru 131, de 2,96 a 6,28 nmols/mg prot/min, par rapport au genotype Jemalong.

II est interessant de noter que lorsqu’il y a augmentation dans le contenu en proteines solubles chez le genotype tolerant Tru 131 a une concentration elevee de 137mM (Fig 34), en parallele, il y a une augmentation dans 1’activite GPX qui est implique dans la tolerance au stress salin. Inversement, l’activite GPX diminue avec le contenu en proteines chez le genotype sensible Jemalong a 102 mM de NaCl.

3. Effet du stress salin sur le contenu racinaire en proteines

Le contenu racinaire en proteines solubles chez le genotype tolerant Tru 131 diminue de 14,92 % jusqu’a la dose de 137 mM de NaCl. Alors que chez Jemalong la diminution du contenu proteique s’observe qu’apres la dose 102 mM c'est-a-dire seulement a la concentration maximale de 137mM (Fig 24). Effet du stress salin sur le contenu racinaire en Ascorbate et en Gluthatione

Nous avons considere les resultats obtenus avec trois traitements (0, 68 et 137 mM) au lieu de quatre, car il n’y a pas de difference de resultat obtenu avec le traitement de 102 mM compare a celui du traitement 68 mM, et ceci afin de simplifier les interpretation des resultats.

Les resultats obtenus a partir de l’analyse de variance sur l’analyse de l’Ascorbate et le Gluthatione (Tab 10), ont montre une difference significative entre les deux genotypes contrastes etudies pour les parametres antioxydants au niveau racinaire (GSH+GSSH) et non significative pour le pool d’Ascorbate. Ces resultats suggerent que tous les parametres relies au Gluthatione (GSH) sont utiles pour discriminer entre les deux genotypes contrastes. Ainsi, le pool GSH+GSSH s’avere un bon critere pour 1’evaluation de la tolerance au stress salin au niveau racinaire chez Medicago truncatula.

La figure 35, montre que la salinite a provoque une augmentation du pool ASC+DHA a une faible concentration de NaCl (68 mM) chez les deux genotypes Tru 131 et Jemalong (6,56 et 6,63 mg / g DW) respectivement (Tab 11). A la concentration plus elevee de 137mM, le pool ASC+DHA augmente beaucoup plus chez le genotype tolerant (7,96 mg / g DW) par rapport au sensible (5,78 mg / g DW).

La figure 36, montre que quelque soit la concentration de NaCl, le pool GSH+GSSH est largement superieur chez le genotype tolerant (Tru 131) par rapport a Jemalong, moins tolerant. Par exemple, a la dose de 137 mM de NaCl, le genotype Tru 131 a un pool de 2,99 mg / g DW, alors que Jemalong exprime seulement 0,16 mg / g DW.

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Fig 30 : Longueur rae inai rc (RL) chez les deux genotypes contrasté!, de M. iruncatula. Tru 131 et Jemalong. exposés, au stress, salin

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Fig 31 : Poids frai* individuel racinairc (RW) chez les deux génotypes contrastés de M. trunixitula. Tru 131 et Jemalong, exposés au salin.

Les Resultats des parametres sont exprimes en moyenne ± S.E (n=3). Peur chaque parunécre. * re príven le elev differences Mÿufiejlnvt tatre le» irtiKS cl I» Wmuiii» pour le meme #represente la différence entres pénotype pour le mime uaiicment à P 0.05.

Tab 10 : Resultats d’analyse de variance a deux facteurs. 1. Effet traitement (stress salin). 2. Effet genotype. 3. Effet interaction sur les parametres morphologiques, physiologiques et biochimiques au niveau racinaire.

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Tab 11: Resultats obtenus de l’effet du stress salin sur les parametres biochimiques (proteines solubles, activite GPX, pools : ASC+DHA et GSH+GSSG) au niveau racinaire.

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Fig 32 : Potentiel hydrique des racines des deux genotypes contrastes de M. truncatula, T 131 et Jemalong, exposes au stress salin. Resultats expnmes en moyenne ± S.E (n = 3)

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Fig 33 : Activite de 1 enzyme Guaiacol peroxydase expnmee en (nmols/mg prot/mm) dans les racines des deux genotypes contrastes de M. truncatula T131 et Jemalong exposes aux differents traitements par NaCI. Resultats expnmes en moyenne ± S.E (n = 3)

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Fig 34 : Contenu en proteines solubles expnmes en mg /g poids sec racmaire des deux genotypes de M truncatula exposes au stress salin. Resultats expnmes en moyenne ± S.E (n = 3)

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Fig 35 : Contenu racinaire en pools d’Ascorbate ASC+DHA chez les deux génotypes contrastés de M. truncaiula TI 31(T) et Jemalmtg (S) exposés aux différents traitements pai NaCI. Résultats exprimés en moyenne ± S.E (n = 3)

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Fig 36 : Contenu racinaire en pool de Gluthatione GSH+GSSG chez les deux génotypes contrastés de M. truncaiula TI3I(T) et Jemalong (S) exposés aux différents traitements par NaCI. Résultats exprimés en moyenne ± S.E (n = 3)

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Fig 37 : Développent des plantulcs des deux génotypes contrastés de M. truncaiula TI3KT) et Jcmalong (S) traités aux différentes concentration de NaCI

Discussion

Les resultats ont montre une que la salinite induit une diminution de la longueur et le poids de la racine chez les deux genotypes. La salinite elevee peut inhiber l’elongation racinaire par la diminution du contenu en eau par la plante (Werner et Finkelstein, 1995).

Zahaf et al. (2012) analysent le transcriptome des racines chez deux genotypes de M. truncatula ayant une reponse contrastee vis-a-vis du stress salin; TN 1.11 (Tolerant), echantillonne dans un sol salin tunisien, et le genotype de reference Jemalong A17 qui est sensible et trouvent que les longueurs racinaires chez ces deux genotypes contrastes sont significativement reduit apres 90 - 150 mM NaCl de traitement en comparaison avec les racines non traitees.

Dans notre etude, nous avons observes une reduction significative de la longueur de la racine a partir de 102 mM de NaCl de traitement comparativement aux racines de plantules temoins. D’autres part, nous avons observe que le stress salin a diminue le potentiel hydrique des racines, beaucoup plus chez le genotype juge tolerant Tru 131 compare au genotype sensible Jemalong. On sait qu’une plante peut absorber l’eau du sole si le potentiel hydrique de la racine racine est inferieur a celui du sol (*P w)racine < (T w) sol). Le potentiel hydrique et le potentiel osmotique des plantes deviennent de plus en plus negatifs avec l’augmentation de la salinite ainsi que la pression de la turgescence (Romero-Aranda et al. 2001 ; Parida et Das, 2005). Depuis que le stress salin implique aussi bien le stress osmotique qu'ionique (Hayashi et Murata, 1998), l'arret de la croissance est directement relie a la concentration des sels solubles ou au potentiel osmotique de l'eau du sol (Greenway et Munns, 1980). II est bien etabli qu'une forte concentration de solute dissout dans la zone racinaire abaisse le potentiel hydrique du sol (Amane et al. 1999).

Concemant Tanalyse biochimique, on remarque qu’il y a augmentation dans le contenu en proteines solubles et l’activite GPX qui est implique dans la tolerance au stress salin chez le genotype juge tolerant Tru 131 a une concentration elevee de NaCl (> 68mM) par rapport au genotype sensible Jemalong.

II a ete note que la concentration en proteines solubles chez Medicago sativa est diminuee sous stress salin et cette reduction est reliee a l’inhibition de leurs synthese ou la stimulation de leurs hydrolyse (Irigoyen et al. 1992). Gandonou et al. (2011) montrent que la concentration en proteines solubles diminue dans les racines de la variete sensible au stress salin CP65-357 chez le cultivar (Saccharum sp.) de la canne a sucre. Mittova et al. (2002) ont trouve que chez la tomate cultivee (Lycopersicon esculentum), la meilleure protection des racines de la variete cultivee tolerante (L. pennellii) par 1’induction du stress oxydatif du a la salinite, est correle avec l’augmentation de l’activite GPX.

Zahaf et al. (2012), revelent que l’activite GPX chez M. truncatula augmente significativement dans les nodules des racines en reponse a la salinite du genotype tolerant TN.ll en comparaison avec Jemalong A17 (sensible). Cette enzyme peut etre tres importante pour la defense oxydative dans les nodules racinaires de M. truncatula sous stress salin. Elle est suggeree comme un marqueur biochimique potentiel pour la tolerance au stress salin et hydrique (secheresse). Elle est essentiellement implique dans la lignification et le renforcement de la paroi cellulaire et confere une meilleure protection de l’integrite tissulaire (Mhadhbi et al. 2004, 2008, 2009).

D’apres les resultats obtenus sur le contenu proteique racinaire, on note que Jemalong qui est sensible au stress a une teneur elevee en proteines de racines par rapport genotype tolerant (Tru 131). II a ete note que le contenu en proteines solubles des racines de deux cultivars de ble (Sensible et tolerant) au stress salin, est eleve chez Gemmezal, sensible compare a Sakha 93, tolerant (Radi et al. 2013). Ainsi, une teneur elevee en proteines solubles a ete observee chez des cultivars d’orge, toumesol, millet et de riz sous l’effet du stress salin (Ashraf et Harris 2004).

Cependant, Agastian et al. (2000) ont rapporte que les proteines solubles sont elevees a faible dose de salinite mais diminuent significativement a forte concentration chez des cultivars de muriers, ce qui semble concorder avec nos resultats. L’augmentation dans la carbonylation des proteines a ete utilise comme un indicateur de dommages oxydatifs chez les plantes exposees a de severes stress abiotiques (Ferreira-Silva et al. 2012 ; Moran et al. 1994 ; Miller et al. 2007), ceci explique l’augmentation des proteines des racines chez le genotypes sensible Jemalong avec probablement l’accumulation des composes ROS due au dommages causes par le stress oxydatif lors d’un stress salin.

Les resultats obtenus sur 1’analyse des antioxydants, montrent qu’au niveau racinaire, les deux pools ASC+DHA et GSH+GSSH augmentent a la concentration maximale qui est de 137 mM de NaCl chez le genotype tolerant Tru 131 beaucoup plus par rapport au genotype sensible Jemalong. Khan et Panda (2008) ont affirme que deux varietes de riz (Lunishree et Begunbitchi), ont rnontre une augmentation du contenu en ascorbate (ASC) sous stress salin a des concentration faibles chez la variete Lunishree, permettant une meilleure protection antioxydative. Concemant le pool GSH+GSSH, on remarque une augmentation elevee a la concentration de 137 mM de NaCl chez le genotype tolerant Trul31 par rapport au genotype Jemalong sensible. Gietler et al. (2015) ont montre que le pool total du Glutathione (GSH+GSSH) augmente chez les jeunes plants du Ble (Triticum aestivum L), tolerants au deficit hydrique par rapport aux plantules sensibles, apres 06 jours de germination.

En conclusion, dans cette etude il apparait que le genotype tolerant Tru 131 exprime une meilleure croissance racinaire sous I’efTet du stress salin par rapport a Jemalong qui est sensible au stress. Concernant le contenu proteique des racines des jeunes plants, Jemalong (sensible) semble exprimer plus de proteines par rapport a Trul31 (tolerant) avec toutefois une augmentation de l’activite gayacol peroxydase (GPX) chez le tolerant comparee a Jemalong. Cette enzyme a un role de protecteur des racines contre les ROS lors d’un stress oxydatif.

Enfin, l’analyse des antioxydants a montre qu’a la concentration maximale de NaCl (137 mM), les deux pools d’ascorbate (ASC+DHA) et de glutathion (GSH+GSSH) augmentent significativement chez le genotype Tru 131 juge tolerant par rapport a Jemalong.

Chapitre 6

Analyse de la Diversite Genetique de Differents Ecotypes de Medicago truncatula Gaertn. par les Marqueurs Moleculaires

Analyse de la Diversity Genetique de Differents Ecotypes de Medicago truncatula Gaertn. par les Marqueurs Moleculaires

Recemment, les methodes moleculaires, fondees sur l’amplification enzymatique in vitro de fragments d’ADN specifiques par la technique PCR, ont ete appliquees chez les « Medics ». L’analyse du polymorphisme genetique par les techniques de la biologie moleculaire s’adresse a l’ensemble du genome, qu’il soit ou non traduit en proteines, et est independante des conditions de l’environnement. En outre, le nombre de marqueurs observables est theoriquement illimite et le genotype d’une plante peut etre determine a un stade tres precoce, aussitot que le materiel est disponible pour l’extraction de l’ADN (Najimi et al. 2003). En ce qui concerne l’interet des microsatellites en genetique, ils sont connus, en plus de leur haut degre de polymorphisme, pour etre des marqueurs neutres, co-dominants et avantageusement bien distribues sur l’ensemble du genome (Powell et al. 1996, Santoni et al. 2000). Un bon marqueur doit etre a heredite simple, multiallelique et co-dominant (Najimi et al. 2003). Les SSR ou « Single sequence repeat» repondent bien a ces criteres et presentent ,en plus de leur reproductibilite, une methode d’etude facile et une definition bien superieure a d’autres marqueurs (Manifesto et al. 1999). Ces marqueurs sont tres polymorphes et hypervariables et constituent donc des outils interessants pour l’etude de la diversite genetique. Dans le present travail, nous avons utilise les etiquettes de sequences exprimees de microsatellites appelees (EST-SSR) qui sont des ressources importantes pour l’investigation de la diversite genetique car ces marqueurs montrent une variation seulement dans la partie exprimee (genes exprimes) dans le genome et qui offrent une opportunite d’exploiter des motifs conserves presents en simple ou peu de copies pour le developpement de microsatellites (SSR).

L’objectif de notre travail est l’analyse moleculaire revelee par les marqueurs EST-SSR de la diversite genetique chez les differentes accessions de l’espece Medicago truncatula Gaertn., afin de determiner les differences et les similitudes qui existent entre elles et, egalement de faire le choix le plus adequat des accessions genetiquement eloignees et complementaires pour la realisation des croisements de depart, dans les programmes d’amelioration varietale sous stress salin. Dans cette etude, nous avons essaye de caracteriser les marqueurs « EST-SSR », sur de nouvelles accessions de M. truncatula, en provenance du pourtour mediterraneen et du proche orient dans le but d’obtenir des informations sur leur diversite genetique en les comparant aux deux genotypes contrastes au stress salin afin de determiner celles qui sont associees au genotype juge tolerant. Ceci necessite une analyse phenotypique sur le comportement de l’ensemble de ces ecotypes sous l’effet du stress salin afin d’affiner les associations marqueurs EST-SSR phenotype pour la tolerance au stress salin.

Materiel et methodes

1. Materiel vegetal

Les graines des differentes accessions (ICARDA) provenant du pourtour mediterraneen et du proche orient (Tableau 12) ainsi celles des deux genotypes contrastes au stress salin, Tru 131, Tolerant et Jemalong, sensible, ont ete utilises dans cette etude pour la caracterisation moleculaire en utilisant quatre marqueurs EST SSR (MTIC 044, MTIC 124, MTIC 077 et MTIC 335) (Tableau 13).

2. Methodes

2.1. Caracterisation moleculaire

2.1.1. Extraction d’ADN et amplification par PCR

L’ADN genomique est extrait pour chaque genotype, a partir de jeunes plants (plantules) obtenus apres 7 jours de germination (10 graines par genotype). L’ADN est isole en utilisant la methode (CTAB) adapte par Udupa et al. (1999). Les trois loci EST-SSR (MTIC 044, MTIC 077 et MTIC 124) sont localises sur le chromosome 3 (LG 3) et MTIC 335 sur le chromosome 7 (LG7) (Tab13). Ils ont ete choisis, a partir d’une serie de microsatellites, developpee par Journet et al (2001), chez Medicago truncatula (2n=16) via la base de donnee « GenBankEST » disponible sur le web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/.

L’amplification de l’ADN genomique a ete faite, selon la technique adoptee par Udupa et al. (1999) dans une reaction PCR (miniprep) de 10 ul contenant 50 ng d’echantillon d’ADN, tampon PCR 1x, 0.2 mM dNTPs, 10 pmole pour chaque amorce et 1 unite de la Taq polymerase. Le programme d’amplification comprend une periode initiale de la denaturation de l’ADN et l’activation de la Taq polymerase a 94°C pendant 2mn, suivie de 35 cycles avec 3 phases : 94 °C durant 30 s, 55°C durant 30 s, et 72°C durant 45 s. L’extension finale est faite a 72°C durant 7 mn. Les produits PCR sont analyses en gel continu de polyacrylamide 6 % denaturant. Apres electrophorese, les bandes d’ADN sont colorees avec le bromure d’ethidium (BET) et visualisees sous UV.

Pour chaque locus, la composition des alleles SSR est determine pour chaque genotype. Les valeurs du contenu d’information sur le polymorphisme (PIC) ou «polymorphism Information Content » est calcule selon la formule suivante (Anderson et al. 1993): [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] est la frequence de l’allele i revelee utilisant l’amorce j]. La diversite genetique pour chaque locus est calcule comme suit: [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten], avec Hi (l’index de la variation genetique) et Pi (la frequence d’allele a chaque locus) (Nei, 1973).

2.1.2. Analyse de donnees

L’analyse des profils electrophoretiques des differents produits de la PCR a ete effectuee par un simple examen visuel des pistes d’electrophorese. La presence des fragments a ete determinee visuellement et introduite dans une matrice de donnees binaires (0/1) presence (1) ou absence de la bande (0). A partir de ces donnees nous avons calcule la matrice de similarite en utilisant le coefficient de Jaccard par «Simple Matching». ensuite le dendrogramme de similarite a ete etabli en utilisant la methode UPGMA (Unweighted Pair group Method using arithmetic Averages).

Ces analyses ont ete effectuees par l’intermediaire du programme d’analyses en utilisant le logiciel Statistica version 6.1.

La matrice de donnees a ete aussi employee pour calculer comme precedemment, le (PIC) ainsi que la diversite genetique (Hi) revele par chaque marqueur EST-SSR. En complement, d’autres parametres ont ete analyses et ou calcules (nombre de repetitions de motif EST-SSR, nombre d’alleles, nombre total de bandes et le taux de bandes polymorphes) afin de trouver des correlations et d’en deduire des conclusions sur une eventuelle association entre ces parametres en relation avec le polymorphisme genetique.

Cette partie experimental a ete effectuee au sein du Laboratoire de Biologie Moleculaire a l’INRA de Rabat.

Tab 12 : Informations sur les llecotypes de Medicago truncatula etudiees.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

N : Nombre d’individu, S : sensible (stress salin), T : tolerant (stress salin), - : pas d’information (stress salin)

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Schema 10 : Protocole experimental pour l’analyse moleculaire de la diversite genetique dell ecotypes de M. truncatula utilisant lesmarqueursEST-SSR

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Schema 11 : Extraction et Amplification d’ADN par apartir dejeunes plants des dififierentes accessions de M. truncatula

Resultats et interpretation

1. Analyse de la diversite moleculaire revelee par les marqueurs EST-SSR

Pour la collection analysee, les marqueurs EST-SSR utilises, se sont reveles polymorphes a l’exception du marqueur MTIC 044 qui a montre un tres faible polymorphisme (PIC = 0,12 et Hi = 0,13), alors que par exemple le marqueur MTIC 124 a montre un polymorphisme modere (PIC = 0,36 et Hi = 0,47) (Tab 13). Le PIC donne une estimation sur le polymorphisme au sein d’un locus en tenant compte du nombre d’alleles, des frequences de ces alleles (Smith et al. 1997). Le nombre total d'alleles enregistres pour les quatre marqueurs est de 24, donnant une moyenne de 6 alleles par locus et un taux de polymorphisme de 32,58 %. Senior et al. (1998) ont reporte que le PIC est synonyme du terme « diversite genetique : Hi » comme decrit par Weir (1996). La valeur du PIC, calculee pour chaque paire d’amorces (locus) varie de 0,12 a 0,49 avec une moyenne de 0,33 et la valeur de Hi varie de 0,13 a 0,37, avec une moyenne de 0,36. Parmi ces marqueurs, les MTIC 124, MTIC 077 et MTIC 335 sont les plus informatifs alors que le MTIC 044 a une faible informativite. Pour les quatre amorces, une moyenne de 65,5 bandes reproductibles ont ete obtenues avec un nombre moyen de 20,5 bandes polymorphes (Tab 14).

En effet, plusieurs facteurs peuvent affecter le nombre de bandes par paire d’amorces a savoir le genotype, les sequences des amorces ainsi que les variations mineures dans les protocoles d’amplification. La majorite des bandes se situent entre 100 et 300 pb, comme l’indique la Figure 41 par exemple.

2. Correlation entre les differents donnees moleculaires etudies et les marqueurs (EST-SSR) :

La figure (38), montre les differents parametres etudies en relation avec le polymorphisme par rapport a l’ensemble des amorces analysees : (NR : Nombre de repetitions du motif SSR, NA : Nombre d’alleles, Hi: diversite genetique, PIC : potentiel en information du polymorphisme, NTB : nombre totale de bandes, Poly % : taux de bandes polymorphes comme le montre le tableau (14), ceci afin de trouver une eventuelle correlation entre les differents donnees moleculaires. Les resultats montrent des correlations positives entre les valeurs PIC, Hi, le % de bandes polymorphes (Poly %) et le nombre d’alleles (NA) (les coefficients de correlations (r) qui varient entre 0,75 et 0,99) (Tab 15).

3. Relations genetiques (Similarites / Dissimilarites) et classification des accessions par rapport au deux genotypes contrastes au stress salin :

3.1 Analyse basee sur chaque marqueur EST SSR :

- MTIC 044 :

L’analyse du dendrogramme (Figure 40) montre que les accessions etudies se repartissent en deux groupes distincts Glet G2. Le groupe Glse divise en 2 sous groupes (SG 1.1 et SG 1.2), le premier sous groupe contient les deux genotypes T131 et Jemalong qui semblent similaires pour ce locus (explique par un PIC=0,12 tres faible) proches aux accessions Tru 1(DZA), Tru 3.1 (DZA), Tru 8 (TUN) et Tru 9 (JOR), alors que le deuxieme sous groupe contient les deux accessions Tru 2.1 et Tru 3.3 avec un coefficient de similarite de (0,667) d’apres la matrice de similarite represente par le tableau 16 dont les coefficients de similarites varient entre (0,33 et 1,00). Les coefficients les plus faibles (0,33) sont obtenus par exemple avec la combinaison de Tru 2.1 avec toutes les accessions represente sur le tableau 16 et la figure 40 sauf avec Tru 3.2 (pourcentage de similarite = 66,7%). Le deuxieme groupe G2 homogene comporte les accessions (Tru 2.2 (DZA), Tru 3.2 (DZA), Tru 4 (DZA), Tru 5 (SYR), Tru 6 (LBN) et Tru 7 (MAR) qui sont similaires entre eux.

- MTIC 124 :

Le dendrogramme (Fig 42) montre que les accessions etudiees se repartissent en deux groupes distincts G1et G2. La matrice de similarite represente par le tableau 17, montre que les coefficients de similarites varient entre (0,33 et 1,00). Les coefficients les plus faibles sont obtenus par exemple avec la combinaison de T131.2 avec Tru 2.1 (coefficient de 0,33) et avec Tru 2.3 (coefficient nul). Concernant les deux ecotypes contrastes au stress salin, on remarque que le genotype tolerant T131 est polymorphe et situe dans G1 et G2, tandis que Jemalong sensible se situe seulement dans le groupe G1 et qui est a son tour proche surtout aux accessions a majorite d’origine algerienne (DZA) : Tru 1, Tru 2, Tru 3, Tru 4, Tru 5 (SYR), Tru 6 (LBN) et Tru 9 (JOR). Le groupe G1 est plus homogene, alors que le deuxieme groupe G2 est tres diversifie, se divise en deux sous groupes SG2.1(diversifie) et SG2.2 (homogene), le premier sous groupe se divise en deux autres sous groupes SG 2.1.1 et SG 2.2.2. On remarque que l’ecotype T131 se presente en deux genotypes, l’un se trouve dans le groupe G1 avec Jemalong et sont donc similaires pour ce locus (meme genotype), alors que le deuxieme genotype (T131.1) se trouve dans le sous groupe :SG1.12 avec quatre ecotypes (DZA): Tru 2.3, Tru 3.4, Tru 4.2, et Tru 5.1 (SYR), Tru 8.2 (TUN) et Tru 9.3 (JOR).

- MTIC 077 :

Le dendrogramme (Figure 44) montre aussi que les accessions etudiees se repartissent en deux groupes distincts Glet G2. La matrice de similarite represente par le Tableau 18, montre que les coefficients de similarites varient entre (0,33 et 1,00). Les coefficients les plus faibles sont obtenus par exemple avec la combinaison de T 131 et Jemalong avec les ecotypes Tru 3.3 et Tru 4.3 pour une similarite de 33% et avec Tru 7.2 pour une similarite nul (0%). Le groupe G2 homogene avec la presence de T131 et Jemalong qui representent un meme genotype pour le locus (MTIC077), ils sont proches aux accessions algeriennes Tru 2.2, Tru 3.2, Tru 4.2, Tru 5 (SYR), Tru 6 (LBN), Tru 7.1(MAR) et Tru 8.2 (TUN). Le premier groupe G1, semble tres diversifie avec deux sous groupes SG 1.1 et SG 1.2, ce dernier est homogene et presente les 4 ecotypes (Tru 2.3 (DZA), Tru 3.1 (DZA), Tru 8.1(TUN) et Tru 9 (JOR).

- MTIC 335 :

Le dendrogramme (Figure 46) montre que les accessions analysees se repartissent en deux groupes varies distincts G1et G2. La matrice de similarite represente par le Tableau 19, montre que les coefficients de similarites varient entre (0,25 et 1,00). Les coefficients les plus faibles sont obtenus par exemple avec la combinaison de T131 avec Tru 1.1 (coef = 0) et avec Tru 3.4 (0,25)

Le G2 presente plus de diversification que le groupe G1. On remarque que l’ecotype juge tolerant T131, presente un seul genotype pour ce locus et se trouve dans le sous groupe SG 2.2 proche aux ecotypes (Tru 4.2 (DZA), Tru 5.2 (SYR) et Tru 6.2 (LBN). Cependant, l’ecotype Jemalong juge sensible au stress salin par rapport au T 131, presente deux genotypes, l’un situe dans le SG 1.1 (Jemalong.1) proche aux ecotypes (Tru 1.1 DZA, Tru 2.2 DZA, Tru 4.3 DZA, Tru 7 MAR, Tru 8 TUN et Tru 9 JOR), alors que le deuxieme genotype (Jemalong.2) se trouve dans sous groupe (SG 2.1.1.1) etroitement proche et similaire a Tru 2.1 DZA. Analyse globale de classification basee sur les quatre marqueurs EST SSR etudies

La matrice de similarity representee par le Tableau 20, montre que les coefficients de similarites varient entre (0,33 et 1,00). Les coefficients les plus faibles sont obtenus avec la combinaison du genotype Tru 2.6 avec les genotypes (Tru 1.1, Tru 1.2, Tru 1.4, Tru 2.2 et Tru 2.3), qui sont tous des accessions algeriennes (DZA), avec un coefficient de similarite de (0,25). A titre d’exemple, les genotypes T131.2 et Tru 1.1 ont un coefficient de similarite, qui est nul. Le dendrogramme represente par la (Figure 47), base sur l’analyse globale des 4 loci EST-SSR etudiees, montre que les ecotypes etudies se repartissent en deux groupes : G1 (avec seulement deux sous groupes), moins diversify et le groupe G2, tres diversify (avec plusieurs sous groupes). On remarque que l’ecotype T 131 se presente en trois genotypes differents et Jemalong en quatre genotypes distincts. Les deux genotypes Jemalong.1 et T131.1 sont similaires et se trouvent dans le sous groupe (SG1.1), meme resultats obtenus pour Jemalong.2 et T131.3, situes dans le sous groupe (SG 1.2). L’individu T131.2 se trouvant dans le sous groupe (SG 2.2.2) se presente comme un genotype different par rapport a Jemalong.3 (SG 2.1.2) et Jemalong.4 (SG 2.2.1.1.4), ces derniers distincts par rapport au genotype T131.2 qui estjuge comme un genotype tolerant au stress salin, ce dernier est proche et similaire aux ecotypes (Tru 2.4 DZA, Tru 3.5 DZA, Tru 5.2 SYR, Tru 8.3 TUN, Tru 9.3 JOR).

Discussion

D’apres les resultats obtenus sur le polymorphisme de chaque marqueur EST-SSR utilise sur les differents ecotypes etudies de M. truncatula et a la lecture du Tableau 14, on remarque que quel que soit le marqueur utilise, les accessions Tru 2 (DZA) et Tru 3 (DZA) presentent toujours le plus de polymorphisme (bandes polymorphes).

D’apres l’analyse globale de classification basee sur l’ensemble des EST-SSR, on trouve toujours que les accessions Tru 2 (DZA) , Tru 3 (DZA) et Tru 4 (DZA) expriment plus d’alleles: 8, 10 et 7 respectivement (Tableau 14). Ces ecotypes qui presentent plus de polymorphisme allelique et qui ont une meme origine geographique (DZA), peuvent etre exploites pour l’etude de lavariabilite genetique. Ils sontproches et similaires a d’autres accessions d’origine differente comme ceux du Liban (LBN) et de la Syrie (SYR). Notant que le marqueur EST-SSR (MTIC124) est polymorphe. Les resultats obtenus sur la recherche de similitudes de sequences proteiques et nucleiques via les bases de donnees « Unigene et Uniprot » a montre que ce locus code pour l’inhibiteur de la cysteine proteinase exprimee principalement dans les racines et impliquee dans la tolerance au stress salin (Amouri et Hadjadj, 2016). Ceci ouvre un autre volet d’etude sur l’analyse du transcriptome au niveau racinaire.

En general, les resultats ont montre un taux moyen de polymorphisme modere (32,58 % avec un PIC = 0,33). Le dendrogramme global, etabli a partir de la matrice de similarite des marqueurs EST - SSR, a montre une phylogenie qui correspond a une differentiation des ecotypes selon la distribution geographique. Ces resultats indiquent que la distribution geographique joue un role majeur dans le regroupement (clustering) des ecotypes avec des similarites et des differences qui dependent de l’adaptation, la pression selective et les conditions environnementales. Une etude phenotypique preliminaire sur la croissance racinaire de l’ensemble des ecotypes etudies, a montre que Tru 131, est l’ecotype le plus tolerant et avec un meilleur developpement racinaire (Amouri, 2015)

En conclusion, ces resultats donnent une vision generale sur la diversite genetique au niveau moleculaire chez les differentes accessions de Medicago truncatula. Ceci montre que les marqueurs EST-SSR utilises dans notre travail sont appropries pour distinguer le polymorphisme moleculaire entre les ecotypes selon leur pedigree. Ainsi, l’analyse moleculaire a donne une meilleure observation des regroupements genetiques entre les onze ecotypes de Medicago truncatula et, qu’en general les accessions d’origine algerienne sont plus proches (forte similarite) aux populations syriennes et jordaniennes (Tru 1, Tru 2, Tru 3, Tru 4) avec Tru 5 (SYR) et T131 DZA avec Tru 8 (TUN) et Tru 9 (JOR)).

Le regroupement utilisant les donnees EST-SSR, suggere que cette methode d’analyse pourrait etre utile pour revaluation genetique qui est tres pratique pour l’amelioration de cette legumineuse, mais une analyse morphologique approfondie sur le comportement de ces ecotypes, est necessaire pour trouver des associations entre marqueurs EST-SSR / phenotype correspondant pour la tolerance au stress salin. Tab 13 : Caracteristiques et resultats obtenus sur le polymorphisme des marqueurs microsatellites EST-SSR utilises pour l’analyse genetique des 11 ecotypes de M. tnmcatula.

Tab 13 : Caractéristiques et résultats obtenus sur le polymorphisme des marqueurs microsatellites EST-SSR utilisés pour l'analyse générique des 11 écotypesde M. trimaitula.

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Tab 14 : Resultats obtenus sur le polymorphisme des bandes amplifies pour chaque marqueur EST-SSR utilises chez les differentes accessions de M. tnmcatula.

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Tab 15 : Correlation entre les differents parametres etudies sur l’ensemble des amorces (loci EST-SSR)

NR : Nombre de repetitions du motif SSR, NA : Nombre d’alleles, Hi: diversity genetique, PIC : potentiel en information du polymorphisme, NTB : nombre totale de bandes, Poly % : taux de bandes polymorphes. Correlation significatives marquees a *: p< 0,005.

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Fig 38 . Representation generate des parametres etudies pour chaque amorce (primer) / locus EST-SSR.

NR : Nombre de repetitions(motifs) , NA : Nombre d’alleles, Hi: diversity genetique, PIC : potentiel en information du polymorphisme, NTB : nombre totale de bandes, Poly % : polymorphisme (bandes polymorphes)

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Fig 39 : Profiles des marqueurs EST-SSR des differents ecotypes de M. truncatula generes par l’amorce MTIC 044.

Tru 1[2...7]; Tru 2 [8... 15]; Tru3 [16...23]; Tru 4 [23...31]; Tru 5 [32...38]; Tru 6 [39...44]; Tru 7 [45 ...47]; Tru 8 [48...51, 54, 55 et 61]; Tru 9 [53, 56 ...60 et 62]; Jemalong [63...72] et T131 [73...82],

M : marqueur de poids moleculaire. X : pas d’ADN ou pas d’amplification.

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Tab 16 : Mitrice de scniUr« gcxúqjc potrle locus F.ST-SSR (MTK 044) cuse sor Vc coeftaen;de ¿iccardentre les Afferente.-.acoe.vnccKde M.tisatgouMwaaifo

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Fig 40 : Dendrogramme UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic means) chez les differents ecotypes de M. Tnmcatula base sur le marqueur EST- SSR (MTIC 044)

Tab 17 : Mitrice de similarite genetique pour le locus EST-SSR (MTIC 124) base sur le coefficient de jaccard entre les differentes accession de medicago Truncatula

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Fig 42 : Dendrogramme UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic means) chez les differents ecotypes de M. Truncatula base sur le marqueur EST-SSR (MTIC 124)

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Fig 43 : Profiles des marqueurs EST-SSR des différents écotypes de M. truncatula générés par l'amorce MTIC 077. Tru 1[1...4]; Tru 2 [8... 14]; Tru 3 [16. ..23]; Tru 4 [24...31]; Tru 5 [32,35et 37]; Tru 6 [40...43];Tru 7 [45 ...47]; Tru 8 [49...51, 55 et 61 ]; Tru 9 [ 57...60 et 62]; Jemalong [65...69 et 72] et T131 [73...76],M : marqueur de poids moléculaire. X : pas d'ADN ou pas d'amplification.

Tab 18 : Matrice de similarité génétique pour le locus EST-SSR (MTIC 077) basé sur le coefficient de Jaccard entre les différentes accessions de Medicago truncatula

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Fig 44 : Dendrogramme UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic means) chez les differents ecotypes de M. Tnmcatula base sur le marqueur EST-SSR (MTIC 077)

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Fig 45 : Profiles des marqueurs EST-SSR des différents écotypes de M. truncatula générés par l’amorce MTIC 335. Tru 1[1....7]; Tru 2 [8... 15]; Tru 3 [16...23]; Tru 4 [24...31]; Tru 5 [32...38]; Tru 6 [39...44]; Tru 7 [49 ...]; Tru 8 [50..52,54 ,55 et 61]; Tru 9 [ 53, 56...601; Jemalong [63...72] et T131 [73...79],M : marqueur de poids moléculaire. X : pas d’ADN ou pas d’amplification.

Tab 19 : Matrice de similarité génétique pour le locus EST-SSR (MTIC 335) basé sur le coefficient de Jaccard entre les différentes accessions de Medicago truncatula

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Fig 46 : Dendrogramme UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic means) chez les différents écotypes de M. Truncatula basé sur le marqueur EST-SSR (MTIC335)

Tab 20 : Matrice de similarity genetique pour les quatre loci EST-SSR base sur le coefficient de Jaccard entre les differentes accessions de Medicago truncatula

Tru 1,1 (DZA Trul.2(DZ^Tru 1.3(DZ Tru l,4(DZTru 2,1 (D1 Tru 2,2 (DlTru 2,3 (K Tru 2,4 (DlTru 2,5 (K Tru 2.6 (DlTru 2,7 (K Tru 2.8 (DlTru 3,1(DZ Tru 3.2(DZTru3.3(DZ Tru 3.4(DZTru3.5(DZ Tru 3.6(DZTru3.7(DZTru 3.8(DZTru3.9(DZTru 3,10(DTru4,l (D5Tru4.2 (K Tru4.3 (D5Tru4.4 (K Tru4,5 (KTru4.6 (K Tru4,7 (DlTru 5,1 (ft Tru 5,2 (SYTru 5,3 (SI Tru 5,4 (SYTru 5,5 (ft Tru 6,1 (LETru 6,2 (L! Tru 6,3 (LETru 7,1 (ft Tru 7,2 (UTru 7,3 (ft Tru 8,1 (TITru 8,2 (Tl Tru 8,3 (TITru 8,4 (TITni 8,5 (TITru 9,1 (|0 Tru 9,2 (|OTru 9,3 (JO Tru 9,4 (|0/«Mbf I jmshifl jemh^ ,41131,1 (T) T131.2 (1] 1131,3 (!)

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Fig 47 : Dendrogramme UPGMA chez les differents ecotypes de M. Tnmcatula
base sur les quatre marqueurs EST-SSR.

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

L'etude de la salinite sur la croissance des jeunes plants chez quatre genotypes differents de M. truncatula, a permis de selectionner les genotypes tolerants et sensibles base sur la resistance racinaire par rapport a la tige et afin d’utiliser des genotypes contrastes pour l’etude biochimique et moleculaire. Les resultats ont montre que le genotype T131 est tolerant, avec une quantite elevee en proteines de reserves par rapport a Jemalong (sensible) qui est le genotype de reference. Cette etude a montre aussi l'influence de des graines agees du genotype (Tru 673) sur le developpement de la racine.

L’analyse des resultats par la technique SDS-PAGE des proteines de reserves des graines des quatre genotypes etudies chez Medicago truncatula, a revelee une variation qualitative moderee entre les genotypes avec des bandes specifiques des genotypes tolerants comme Tru 131 et des variations quantitatives base sur l’intensite des bandes proteiques.

L’etude de la variation des capacites germinatives des graines chez les deux genotypes contrastes au stress salin (T131 et Jemalong) ont permis de bien discriminer les genotypes quant a leur tolerance ou sensibilite au sel au cours de la germination. Le genotype Tru 131, a presente une meilleure capacite en conditions de stress salin et une teneur elevee en proteines synthetises par rapport a Jemalong. De ce fait, il est interessant d’etudier les mecanismes biochimiques et moleculaires qui expliquent la tolerance au stress salin au cours de la germination.

L’etude et l’analyse de la partie racinaire chez ces deux genotypes contrastes a montre que le genotype tolerant T131 exprime une meilleure croissance racinaire, une activite gayacol peroxydase (GPX) elevee et un contenu proteique moins eleve par rapport a Jemalong. La gayacol peroxydase est une enzyme qui a un role protecteur contre les molecules (ROS) accumulees lors d’un stress oxydatif. En outre, l’analyse des antioxydants dans le cas d’une concentration elevee en sel, montre une augmentation des quantites d’ascorbate et de glutathion chez le genotype tolerant (T131) au niveau racinaire.

Afin de positionner 9 nouvelles accessions appartenant a l’espece modele Medicago truncatula par rapport aux deux genotypes contrastes au stress salin (Tru 131 et Jemalong), une analyse moleculaire en utilisant des marqueurs de genes exprimes EST-SSR a ete effectuee. Les resultats ont montre une diversite genetique moderee chez les differentes accessions de Medicago truncatula. Ceci, indique que la distribution geographique joue un role majeur dans le regroupement des accessions selon les conditions environnementales. Ces resultats demontrent que les marqueurs de genes exprimes EST-SSR utilises dans notre travail sont appropries pour distinguer les ecotypes selon leur pedigree. En general les accessions d’origine algerienne sont plus proches aux populations syriennes etjordaniennes.

Le clustering utilisant les donnees EST-SSR, suggere que cette methode d’analyse pourrait etre utile pour revaluation genetique qui est tres pratique pour l’amelioration de cette legumineuse. L’analyse morphologique et agronomique sur le comportement de ces ecotypes vis-a-vis de la salinite est necessaire pour trouver des associations marqueurs EST-SSR phenotype pour la tolerance au stress salin.

Durant notre travail experimental, nous avons rencontre quelques problemes :

Le manque de produits chimiques, coupure frequente de courant electrique et d’eau, manque d’appareillage comme la centrifugeuse refrigeree, contamination des plantes par les champignons au niveau de la serre et probleme de disponibilite de la semence.

Malgre cela, nous esperons continuer cette recherche.

En effet,

L’etude du transcriptome au niveau racinaire ouvre une perspective dans la comprehension et l’analyse de l’expression differentielle des genes impliques dans ce type de stress.

En fait, a partir du transcriptome, on peut remonter aux genes via les cDNA (ADN complementaire) qui contiennent seulement les genes exprimes dans la racine a un stade de developpement precis et dans un environnement bien defini, au cours du stress salin.

Le sequenfage des extremites des cDNA, appelees EST representant les etiquetes de genes exprimes, peut nous fournir des informations precises sur les genes qui s’expriment par le biais du sequenfage de ces extremites.

L’outil bioinformatique est un atout pour la recherche de similitude de ces sequence qui permet de predire la fonction des genes exprimes sous un stress specifique, en utilisant les bases de donnees moleculaires disponible dans le Web (NCBI et EMBL-EBI).

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Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Fig 48 : Courbe d’etalon utilisee lors du dosage des proteines solubles

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Fig 49 : Spectrophotometre a UV visibles utilise pour le dosage des proteines.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Fig 50 : Principales etapes de l’electrophorese SDS-PAGE

Protocole d’extraction d’ADN

1. Chauffer le mortier et le pilon a 65 °C.
2. Chauffer la solution CTAB 2x jusqu’a 65 °C
3. Ecraser 20-30 mg dejeunes plants ou feuilles. Ensuite, ajouter 750 pl de la solution CTAB 2 x. Continuer a broyer.
4. Ajouterencore 750 pldela solutionCTAB2x.Continuer abroyer.
5. Transferer le contenu dans un tube de 2 ml. Incubation a 65 °C durant 45 - 60 min. Adjuster le volumejusqu’a 1.5 ml par l’addition de la solution CTAB 2 x . Agiter en douceur, chaque 15-20 min.
6. Apres incubation, ajouter 500 pl dechloroform:isoamylalcohol. Agiter vigoureusement pendant 15 min.
7. Centrifuger a 13000 g durant 15 min (a temperature ambiante)
8. Prenez 1 ml de surnageant et le mettre dans un nouveau tube de 2 ml.
9. Ajouter 666 pl d’isopropanol et melanger convenablement. Incubation a temperature ambiante durant 30 min. l’ADN precipite a cette etape.
10. Prelever l’ADN par centrifugation a 13000 g durant 10 min.
11. Recuperer le surnageant.
12. Laver le culot avec 1 ml d’ ethanol a 70% durant minimum 5 min.
13. Centrifuger a 13000 g durant 5 min. recuperer le surnageant. Faites un autre lavage avec l’ ethanol si le culot est de couleur fonce.
14. Secher le culot d’ADN a temperature ambiante.
15. Dissoudre le culot d’ADN dans 100 pl du tampon TE 0.5 x durant une nuit a 4 °C.
16. Le lendemain, dissoudre le culot par de petites tapes.
17. Centrifuge r a 13000 g durant 5 min afin de collecter les debris.
18. Recuperer le surnageant et transferer vers un nouveau tube de 1.5 ml.
19. Etiqueter l’DNA avec un numero et mentionner le tube comme “ADN Stock ”.

Test de qualite par l’electrophorese en gel d’Agarose

1. Preparer les echantillons comme suit:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2. Preparation du gel d’agarose

Prendre 0.6 g d’agarose, chauffer dans 60 ml de TBE 1X . Refroidir au dessous de 65 °C sous agitation.

3. Electrophorese : Au debut 60 V et apres a 80V.

4. Coloration et visualisation sous UV.

Apres electrophorese, colorer le gel avec le BET (Bromure d’ethidium) durant 30 min, suivie d'un lavage avec de l'eau distillee durant 20 min. apres prendre une photo en utilisant« Image Analyzer ».

Solution: 2 x CTAB buffer

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tableau 21 : Resume de resultats de 87 echantillons d’ADN a partir de jeunes plants de M. truncatula

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Figure 51 : Test de qualite d’ADN a partir de jeunes plants des differentes accessions

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Fig. 52 : Potentiel hydrique (H'w) des différentes solutions d’NaCl employé pour imposer le stress hydrique sur les jeunes plants de M truncatiila

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Fig. 53 : Poids sec (matière sèche) des jeunes plants des deux génotypes de M. truncatula sous différents traitements de NaCl.

Tableau 22 : Concentrations de ASC, DHA, GSH, GSSH, (ASC+DHA) et (GSH+GSSH) Pools, ASC/ASC+DHA et GSH/GSH+GSSH Ratios au niveau racinaire chez les deux genotypes contrastes de M. truncatula sous differents traitements de NaCl.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Figure 54 : Materiel vegetal et germination des differentes graines de Medicago truncatula Gaertner

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Figure 55 : Semis des differentes graines d’accessions de Medicago truncatula Gaertner

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Jemalong

Figure 56 : Differences Agro-morphologiques entre T131 and Jemalong

Principe de l’electrophorese capillaire

L’electrophorese capillaire se definit comme une technique de separation electrophoretique effectuee dans un tube de diametre interne < a 100 pm, rempli d’un milieu electrolyte. Cette nouvelle technique permet la separation rapide de molecule tres variee, avec une grande resolution.

La separation des molecules se fait par leur propre mobilite electrophoretique sur laquelle vient s’ajouter le flux electro-osmotique, plus ou moins important, engendre par le capillaire de silice qui attire les charges positives de l’electrolyte.

En effet, les molecules sont soumises a 2 flux :

- Le flux electrophoretique qui entraine les cations vers la cathode et les anions vers l’anode : Dans une solution on a deux types de molecules : les neutres et les chargees. Les molecules neutres ne sont pas concernees par ce phenomene. En revanche, les molecules chargees lorsqu’elles sont soumises a un champs electrique se deplacent a une vitesse caracteristique constante qui est fonction de leur taille et de leur charge.

- Le flux electro-osmotique : c’est un phenomene particulier au capillaire de silice, en effet les groupements Silanol sont tres acide et donnent facilement S-O-, ce qui donne une charge interne negative. Dans le tampon on a des molecules chargees positivement, celles-ci vont venir s’adsorber a la paroi interne, et lorsqu’on impose un courant dans le capillaire « la gaine positive » va etre entrainee vers la cathode. Cette migration cree un flux que l’on peut assimiler a un courant ou a «un tapis roulant ». Ce flux s’applique a toutes les molecules, qu’elles soient chargees ou non.

La somme de ces deux phenomenes va donner la vitesse caracteristique de la molecule etudiee. On a:

Vitesse de migration = Vitesse electrophoretique + Vitesse electro-osmotique.

La migration se fait dans un capillaire constitue de polymeres de silicate d’un diametre inferieur a 100 pm. Il est rempli d’une solution tampon; on injecte a l’anode et on detecte a la cathode. On applique une tension aux bornes du capillaire et le deplacement des especes est regi par les deux phenomenes que sont l’electromigration et l’electro-osmose.

En regle generale, la migration se fait de l’anode a la cathode quel que soit le pH.

En effet soit Ve la vitesse electrphoretique du solute et V0 la vitesse du flux electro- osmotique.

A pH faible :

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

A pH fort

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Vo>Ve donc la migration se fait de l’anode vers la cathode.

D’apres ces 2 schemas on remarque bien que la migration du solute se fasse de l’anode vers la cathode independamment du pH.

L’appareillage :

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Fig 57 : Principe de l’electrophorese capillaire

ANNEXE 2

Travaux personnels

1. Amouri Adel Amar, Fyad Lameche Fatima Zohra and Yahia Noureddine. 2014. Early seedling development of Medicago truncatula genotypes under salt stress in relationship with seed dry weight and storage protein content. African Journal of Biotechnology. 13 (2): 322-331

2. Amouri A.A. 2015. Effect of Salinity Stress on Seedling Development of Different Ecotypes of the Model Legume Medicago truncatula. Asian Journal of Crop Science, 7: 154-159.

3. Amouri Adel Amar et Hadjadj Aoul Seghir. 2016. Analyse moleculaire de deux genotypes de Medicago truncatula Gaertn. par le marqueur de sequence exprimee EST-SSR (MTIC 124) en reponse a la salinite. International Journal of Innovation and Applied Studies. Vol. 17 No. 2 Jul. 2016, pp. 627-631TABLE DES MATIERES