Reinigung von Lysozym durch Ionenaustauschchromatografie

Zusammenfassung

Ziel des Versuches ist es Lysozym aus Hühner-Eiklar zu isolieren und zu reinigen. Dafür wurde die Methode der Kationenaustauschchromatografie aufgrund des hohen isoelektrischen Punkts von Lysozym ausgewählt. Die erhaltenen Fraktionen der Chromatografie wurden auf den Proteingehalt nach Bradford und die Lysozymaktivität durch eine fotometrische Messung untersucht. Der Erfolg der Reinigung und Anreicherung wurde in einer Anreicherungstabelle veranschaulicht und durch eine SDSPage kontrolliert und bestätigt. Die Reinigung und Anreicherung von Lysozym war mit einem Anreicherungsfaktor von 11,8 sehr erfolgreich. Die Ausbeute bezogen auf den Proteingehalt betrug 12% und bezogen auf die Gesamtaktivität von Lysozym 123%.

Einleitung

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Abbildung 1: Proteinstruktur von Lysozym. Die positiven Reste (Arginin, Histidin, Lysin) sind in lila hervorgehoben. Struktur erstellt mit Pymol (Protein Data Bank Kennnummer 5dm9).[1]

Lysozym ist ein Enzym, welches zu einem großen Anteil in dem Eiklar von Hühnereiern vorkommt. Der Anteil beträgt ca. 5-10% des Gesamtproteingehalts.[2] Es gehört zur Familie der Muramidasen und katalysiert die hydrolytische Spaltung des Mureins in bakteriellen Zellwänden. Dabei wird die glykosidische Bindung von N-Acetylmuraminsäure und N-Acetylglucosamin gespalten. Lysozym ist auch ein Bestandteil von Körperflüssigkeiten wie Tränenflüssigkeit oder Speichel und ist ebenso in Pflanzen vorzufinden. Dort wirkt als Schutz vor bakteriellen Infektionen.[3] Der isoelektrische Punkt (pI) liegt bei einem pH von ca. 11 und das Molekulargewicht beträgt 14,3 kDa.[4] In Abb.1 ist die Struktur von Lysozym zu erkennen, wobei die positiven Reste lila hervorgehoben sind.

Lysozym wurde erstmals von E.P. Abraham 1939 isoliert, gereinigt und kristallisiert.[5] In dem folgenden Versuch wurde Lysozym durch Ionenaustauscher Chromatografie isoliert und gereinigt und der Erfolg der Aufreinigung wurde durch eine Konzentrationsbestimmung und einen Aktivitätstest untersucht. Die Ionenaustauschchromatografie beruht auf dem Prinzip der Adsorptionschromatografie. Lysozym liegt bei einem Arbeits-pH von 10 noch weitgehend protoniert vor, während die meisten anderen Enzyme ihren pI an diesem Punkt schon überschritten haben und deswegen keine positiven Ladungen mehr besitzen. Lysozym adsorbiert an Kationenaustauscher-Gruppen, während andere Proteine von der Säule gewaschen werden.

Die Bestimmung des Proteingehalts erfolgte durch die Bradford-Methode und die Enzymaktivität konnte fotometrisch bestimmt werden. Eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese Reinigung von Lysozym Svenja Rotter (SDS-Page) nach Laemmli wurde zusätzlich durchgeführt, um die Reinigung qualitativ zu charakterisieren.

Materialien und Methoden

Zur Reinigung des Lysozyms wurde einen Ionenaustauschchromatografie verwendet. Diese Methode beruht auf dem Prinzip der Adsorptionschromatografie. Carboxymethylgruppen sind in der Matrix der Säule verankert und mit diesen negativ geladenen Gruppen kann das Lysozym, welches positiv geladene Reste besitzt, wechselwirken. Alle anderen Proteine, die keine positiven Ladungen oder weniger als Lysozym tragen, werden von der Säule gewaschen. Durch Erhöhen des pH-Wertes kann die Bindungsaffinität von Lysozym gesenkt werden oder es kann durch einen Puffer mit Ionen höherer Ladungsdichte verdrängt und dadurch eluiert werden.

Die Bradford-Methode zur Bestimmung des Proteingehalts beruht auf einer Anlagerung von Coomassie Brilliant Blue an Proteine, wodurch das Extinktionsmaximum von 465 nm auf 595 nm verschoben wird. Die fotometrisch gemessene Extinktion ist proportional zur Proteinkonzentration. Durch Erstellen einer Kalibrierreihe mit BSA (Bovine Serum Albumin) als Kalibrierstandard kann diese berechnet werden.[6]

Die Enzymaktivität wird ebenfalls durch eine fotometrische Messung bestimmt, jedoch bei 450 nm. Hierbei wird die Abnahme der optischen Dichte durch den Abbau von bakteriellem Zellwandmaterial beobachtet. Durch Anwenden des Lambeert-Beer‘schen-Gesetzes kann die Volumenaktivität berechnet werden.[7]

SDS-Page nach Laemmli ist eine Methode zur Auftrennung von Proteingemischen nach ihrer Größe. SDS denaturiert Proteine und lagert sich im stöchiometrischen Verhältnis an, wodurch die Eigenladung überdeckt wird. Das apparente Molekulargewicht kann durch Bestimmung der relativen Mobilität (Wegstrecke des Proteins im Verhältnis zur Wegstrecke von Bromphenolblau) errechnet werden oder ungefähr anhand der Markerbanden abgeschätzt werden.[8]

Die Durchführung erfolgte anhand des Skripts: Praktikum Proteine und Enzymkinetik, Blockteil Proteine.[9] Die benötigte Menge an Waschpuffer bei der Kationenaustauscherchromatografie vor der Elution betrug die Höchstmenge von ca. 30 ml.

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Abbildung 2: Messung der Bradford Kalibrierreihe, erstellt mit BSA. Durch lineare Regression wurde mit Excel folgende Geradengleichung ermittelt: y=0,019x + 0,023.

Tabelle 1: Übersicht der gemessenen Extinktion der Proben (Mittelwert abzüglich Leer-Wert) für die Proteinbestimmung nach Bradford und die daraus berechnete Proteinmenge und Konzentration. Vom Rohextrakt (RE) wurden die Verdünnungen 1:100 und 1:500 ausgewählt, von Überstand 1 (U1), Überstand 2 (U2) und Eluat (E) jeweils 1:100 und von der Waschfraktion (W) 1:10.

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Die Extinktionswerte aus Tbl.1 wurden aufgrund des linearen Bereiches der Kalibriergeraden aus Abb.1 gewählt. Alle ausgewählten Werte befinden sich in dem linearen Bereich der Extinktion zwischen 0- 0,5. Für das Rohextrakt wurde für weitere Berechnungen der Mittelwert 23 μg/μl verwendet. Die Proteinkonzentration nimmt angefangen vom Rohextrakt bis zur Waschfraktion stetig ab. Das Eluat besitzt wieder eine deutlich höhere Konzentration als die Waschfraktion.

Die Proteinmenge kann aus Umstellen der Kalibriergeraden und Einsetzen der gemessenen Extinktion für den y-Achsenabschnitt berechnet werden. Die Konzentration wurde aus der Masse des Proteins und dem verwendeten Volumen unter Berücksichtigung der Verdünnung (1:100 für Rohextrakt) berechnet.

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