Da alle Lebewesen mit anderen Organismen ständig in Kontakt treten, v.a. auch Pathogenen, muss das Immunsystem des Körpers bei einem Übertritt der physikalischen Barriere der Haut und Schleimhäute in den Körper diese als fremd erkennen und zerstören, damit kein Schaden im Organismus entstehen kann. Bei der Immunität werden zwei Arten unterschieden: die zelluläre Immunität und die humorale Immunität.
Für die Betrachtung in diesem Protokoll wird sich auf die humorale Immunität beschränkt. Diese Immunität stellt einen sehr effektiven Schutz vor bakteriellen Infektionen und extrazellulär auftretenden Viren dar. Die Antikörper bzw. Immunglobuline bilden dabei den Träger dieses Vorganges. Die B-Lymphocyten oder B-Zellen, welche im Knochenmark heranreifen, produzieren die Antikörper.
Da als ein wichtiger Bestandteil des Experiments das BSA Serum (Bovine Serum Albumin) genutzt wird, soll darauf kurz eingegangen werden. Es folgen daraufhin für jeden Versuchsteil zunächst allgemeine Angaben zur Funktionsweise und den Prinzipien (u.a. Photometrie und Ouchterlony Doppeldiffusionstest), und anschließend der Bericht der tatsächlichen Durchführung mit Auswertung.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
2 Material & Methoden
2.1 Ammoniumsulfatfällung
2.2 Gelchromatographie
2.3 Affinitätschromatographie
2.4 Photometrische Bestimmung
2.5 Ouchterlony Doppeldiffusionstest
3 Ergebnisse
4 Diskussion
Zielsetzung & Themen
Das primäre Ziel dieser Arbeit ist die Durchführung einer biochemischen Aufreinigung von Immunglobulinen aus einem anti-BSA-Serum sowie deren anschließende Charakterisierung durch verschiedene analytische Methoden, um die Konzentration und Bindungsfähigkeit der Proteine zu bestimmen.
- Grundlagen der humoralen Immunität und Antikörperstruktur
- Proteinaufreinigung mittels Ammoniumsulfatfällung und Gelchromatographie
- Spezifische Isolation von Antikörpern durch Affinitätschromatographie
- Konzentrationsbestimmung durch photometrische Messung (Lambert-Beersches Gesetz)
- Immunologische Analyse mittels Ouchterlony Doppeldiffusionstest
Auszug aus dem Buch
1 Einleitung
Zur Grundlage des inhaltlichen Verständnisses des Praktikumsversuches gehört die Frage nach der Bedeutung von Antikörpern. Daher soll im Folgenden die Frage „Was sind Antikörper?“ erörtert werden.
Da alle Lebewesen mit anderen Organismus ständig in Kontakt treten, v.a. auch Pathogenen, muss das Immunsystem des Körpers, bei einem Übertritt der physikalischen Barriere der Haut und Schleimhäute in den Körper, diese als fremd erkennen und zerstören, damit kein Schaden im Organismus entstehen kann. Bei der Immunität werden zwei Arten unterschieden: die zelluläre Immunität und die humorale Immunität.
Für die Betrachtung in diesem Protokoll wird sich auf die humorale Immunität beschränkt. Diese Immunität stellt einen sehr effektiven „Schutz vor bakteriellen Infektionen und extrazellulär auftretenden Viren“ (Voet/Voet, S. 229) dar. Die Antikörper bzw. Immunglobuline (=Proteine) bilden dabei den Träger diesen Vorganges. Die B-Lymphocyten oder B-Zellen, welche im Knochenmark heranreifen, produzieren die Antikörper.
Zusammenfassung der Kapitel
1 Einleitung: Einführung in die humorale Immunität, die Struktur von Immunglobulinen sowie die Rolle von BSA als Markerprotein in der Biochemie.
2 Material & Methoden: Detaillierte Beschreibung der experimentellen Protokolle für die Proteinaufreinigung und analytische Verfahren.
2.1 Ammoniumsulfatfällung: Darstellung des Verfahrens zur Ausfällung von Proteinen aus dem Serum mittels Erhöhung der Salzkonzentration.
2.2 Gelchromatographie: Erläuterung der größenabhängigen Trennung von Proteinen unter Verwendung einer Sephadex G50-Säule.
2.3 Affinitätschromatographie: Beschreibung der selektiven Isolation von IgG-Antikörpern unter Nutzung der spezifischen Bindung an Protein A.
2.4 Photometrische Bestimmung: Erläuterung der quantitativen Konzentrationsbestimmung basierend auf der UV-Absorption aromatischer Aminosäuren.
2.5 Ouchterlony Doppeldiffusionstest: Beschreibung der immunologischen Methode zur Identifizierung von Antigen-Antikörper-Reaktionen in einem Agarosegel.
3 Ergebnisse: Präsentation der gewonnenen Daten aus der Photometrie inklusive graphischer Auswertung und Darstellung der Beobachtungen beim Diffusionstest.
4 Diskussion: Kritische Auseinandersetzung mit den experimentellen Daten, Fehlersuche hinsichtlich der geringen Ausbeute und Einordnung der gewählten Methoden.
Schlüsselwörter
Antikörper, Immunglobuline, Affinitätschromatographie, Photometrie, Gelchromatographie, Ouchterlony Doppeldiffusionstest, BSA, Proteinaufreinigung, humorale Immunität, Lambert-Beersches Gesetz, IgG, Protein A, Aussalzen, Immunologie, biochemisches Praktikum
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit behandelt die Durchführung und methodische Auswertung biochemischer Standardverfahren zur Aufreinigung und Charakterisierung von Antikörpern aus einem Serum.
Was sind die zentralen Themenfelder der Untersuchung?
Der Fokus liegt auf der proteinbiochemischen Analytik, insbesondere der Isolation und Quantifizierung von Immunglobulinen sowie der immunologischen Prüfung ihrer Bindungsfähigkeit.
Was ist das primäre Ziel oder die Forschungsfrage?
Ziel ist es, die Konzentration von IgG-Antikörpern mittels unterschiedlicher Trenn- und Nachweisverfahren zu isolieren und durch optische Messverfahren quantitativ zu bestimmen.
Welche wissenschaftlichen Methoden werden verwendet?
Es kommen die Ammoniumsulfatfällung, Gelchromatographie, Affinitätschromatographie, Photometrie sowie der Ouchterlony-Diffusionstest zum Einsatz.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in die theoretische Begründung der Methoden, die spezifische Durchführung der Laborversuche und die anschließende mathematische sowie analytische Auswertung der gewonnenen Messergebnisse.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Wichtige Begriffe sind Immunglobuline, Affinitätschromatographie, Photometrie und Ouchterlony-Test.
Warum wird im Versuch Rinderserumalbumin (BSA) verwendet?
BSA dient als Markerprotein bei der Gelelektrophorese sowie zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen, um bei immunologischen Tests präzisere Ergebnisse zu erhalten.
Warum konnten im Ouchterlony-Test keine klaren Ergebnisse erzielt werden?
Die Autorin vermutet, dass die Konzentration des Zielproteins durch die vorangegangenen Aufreinigungsschritte zu stark gesunken ist, um noch sichtbare Präzipitatlinien im Gel zu bilden.
- Arbeit zitieren
- Anita Greinke (Autor:in), 2016, Affinitätschromatographie und Charakterisierung von Immunglobulinen, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/372165
