Die Raf-MEK1/2-ERK1/2-Kaskade ist ein wichtiger Signaltransduktionsweg für die Regulation von Zellproliferation, Hypertrophie und Apoptose. Proliferation und Hypertrophie werden durch aktiviertes, dimeres ERK1/2, dessen Translokation in den Zellkern und Phosphorylierung von nukleären Zielproteinen vermittelt, wohingegen anti-apoptotische Effekte durch monomeres ERK1/2 im Zytoplasma ausgelöst werden. Für die Kinaseaktivität ist eine zweifache Phosphorylierung des TEY-Aminosäuremotivs von ERK1/2 durch MEK1/2 vonnöten. Lorenz et al. entdeckten eine Autophosphorylierung am Aminosäurerest Threonin 188 von ERK1/2, die durch Dimerisierung und anschließende Bindung der βγ-Untereinheiten von G-Proteinen ausgelöst wird und für die nukleäre Translokation des Dimers wichtig ist. Sie konnten außerdem zeigen, dass Interferenz mit dieser Autophosphorylierungsstelle die Hypertrophie von Mäuseherzen unterbinden kann. Ruppert et al. fanden heraus, dass diese Interferenz nur die pathologische Herzhypertrophie verhindert, während die physiologische Hypertrophie des Herzens sowie die anti-apoptotischen Effekte von monomerem, zytosolischem ERK1/2 dabei nicht beeinträchtigt wurden. Die hier beschriebenen Versuche zeigen, dass die Strategie, die Dimerisierung von ERK1/2 zu unterbinden, ebenso in der Proliferationshemmung von humanen Colon-Adenokarzinomzellen Anwendung finden kann. Die Zellen wurden mit einem Adenovirus transduziert, das ein Plasmid enthält, auf dem das Gen für ein Peptid liegt, welches an ERK1/2 binden kann. Die Proliferation dieser Zellen war signifikant geringer als die von lacZ-transduzierten Kontrollzellen. Die Proliferationsrate der Zellen wurde mit einem Tritium-Thymidin-Inkorporations-Assay bestimmt. Mithilfe von Western Blot Versuchen konnte nachgewiesen werden, dass die Transduktion mit Peptidoder Kontrollvirus die Phosphorylierung und Aktivierung von ERK1/2 durch MEK1/2 am TEY-Motiv, verglichen mit untransduzierten Zellen, nicht signifikant beeinflusst. Die Substanz PD98059 wurde als Positivkontrolle verwendet, um die ERK1/2-Phosphorylierung durch MEK-Inhibition zu verhindern. Die Ergebnisse dieses Versuchs bestätigen, dass das myc-ERK2309-357-Peptid die zytosolische Kinaseaktivität von ERK1/2 nicht hemmt. In einem präliminären Experiment wurde die Apoptoserate der Virus-transduzierten Zellen bestimmt. Dafür wurde ein lumineszenz-basierter Caspase-Nachweis-Assay durchgeführt.
Inhaltsverzeichnis
- Abstract
- Zusammenfassung
- Einführung
- Die RAF-MAPK-Kaskade
- Fragestellung
- Material und Methoden
- Verbrauchsmaterialien
- Zellen und Zellkultur
- Tester-Lot
- 3H-Thymidin-Inkorporations-Assay
- Caspase-Aktivitätsmessung
- Statistik
- Ergebnisse
- Das Myc-KR2309-357-Peptid kann die Proliferation von Kolon-Karzinomzellen inhibieren.
- Das Myc-KR2309-357-Peptid beeinflusst die Aktivität von MAPK.
- Vorversuche zeigen, dass das Myc-KR2309-357-Peptid den anti-apoptotischen Effekt von MAPK in Colo320 nicht beeinflusst.
- Diskussion
- Referenzen
- Literaturverzeichnis
- Abbildungsverzeichnis
- Anhang
- Puffer und Lösungen
- Abkürzungen
- Anerkennung
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Diese Arbeit untersucht den Einfluss des Myc-KR2309-357-Peptids auf die Proliferation und den anti-apoptotischen Effekt der MAPK-Kaskade in verschiedenen Kolon-Karzinomzellinien.
- Die Hemmung der MAPK-Dimerisierung als potenzielles therapeutisches Ziel in Krebs
- Die Rolle der MAPK-Kaskade bei Proliferation und Apoptose
- Der Einfluss des Myc-KR2309-357-Peptids auf die Proliferation von Kolon-Karzinomzellen
- Der Einfluss des Myc-KR2309-357-Peptids auf die Aktivität der MAPK-Kinase
- Die Untersuchung des anti-apoptotischen Effekts von MAPK in Colo320-Zellen.
Zusammenfassung der Kapitel
Die Einleitung erläutert die Bedeutung der RAF-MAPK-Kaskade als wichtiger Signaltransduktionsweg für die Regulation von Zellproliferation, Hypertrophie und Apoptose. Die Fragestellung der Arbeit liegt darin, ob eine Hemmung der MAPK-Dimerisierung das Wachstum von Kolon-Karzinomzellen selektiv hemmen kann.
Der Abschnitt "Material und Methoden" beschreibt die verwendeten Materialien, Zelltypen, Tests und die Durchführung der 3H-Thymidin-Inkorporations- und Caspase-Aktivitäts-Assays.
Die Ergebnisse des 3H-Thymidin-Inkorporations-Assays zeigen eine signifikante Hemmung der Proliferation von Kolon-Karzinomzellen, die mit dem Myc-KR2309-357-Peptid transduziert wurden, im Vergleich zu Kontrollzellen. Western Blot-Analysen zeigen jedoch keine signifikante Veränderung der Phosphorylierung und Aktivierung von MAPK durch das Myc-KR2309-357-Peptid, während der synthetische MAPK-Inhibitor P98059 die Phosphorylierung von MAPK inhibiert.
Die Ergebnisse der Caspase-Aktivitätsmessung deuten darauf hin, dass der anti-apoptotische Effekt von MAPK in Colo320-Zellen durch das Myc-KR2309-357-Peptid nicht beeinträchtigt wird. Die Schlussfolgerungen müssen jedoch durch weitere Studien bestätigt werden.
Die Diskussion erläutert die Bedeutung der Ergebnisse und mögliche zukünftige Forschungsrichtungen.
Schlüsselwörter
Die wichtigsten Schlüsselwörter der Arbeit sind: MAPK-Kaskade, Kolon-Karzinom, Zellproliferation, Apoptose, Myc-KR2309-357-Peptid, 3H-Thymidin-Inkorporations-Assay, Western Blot, Caspase-Aktivitätsmessung, therapeutisches Ziel.
- Arbeit zitieren
- Caroline Kohnle (Autor:in), 2015, Der Mechanismus der Dimerisierung und nukleären Translokation der extrazellulär regulierten Kinasen im Zusammenhang mit Zellproliferation, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/418171
