Das Gen DmX (Drosophila melanogaster X-chromosomal/Rabconnectin-3/Rbc3) ist ein evolutionär hochkonserviertes Gen. DmX scheint maßgeblich am Überleben des Organismus beteiligt zu sein, da DmX-mutante Drosophila melanogaster die Bewegungen und die Nahrungsaufnahme im ersten Larvenstadium einstellen und sterben. Die genaue Funktion von DMX bisher unbekannt und wird daher in dieser Arbeit systematisch untersucht.
Das Transkriptom DmX-mutanter Individuen von Drosophila melanogaster und des genetischen Hintergrundstamms ywf wurde analysiert. Nicht-mutante Tiere und DmX-mutante Tieren wurden gesammelt und für die Isolierung von Total-RNA verwendet. Diese wurde auf dem Illumina HiSeq2000 mittels eines 51 bp single-end-Laufs sequenziert. Daraus ergaben sich 281 Millionen Rohsequenzen, die durch das Programm CLC Genomics Workbench gekürzt und anschließend einer Kartierung gegen das annotierte Genom von D. melanogaster unterzogen wurden. Die im Vergleich zu ywf überexprimierten Gene (UP), sowie die unterexprimierten Gene (DOWN) der DmX-Mutanten wurden über Literatursuchen mittels bioinformatischer Werkzeuge auf funktionelle Annotationen hin analysiert.
Die Ergebnisse lieferten in DmX-mutanten Tieren eine differentielle Expression von Genen, die an endo- und exozytotischen Prozessen beteiligt ist, sowie an einigen katabolischen und anabolischen Stoffwechselwegen.
Inhaltsverzeichnis
- EINLEITUNG.
- Der Modellorganismus Drosophila melanogaster (Taufliege).
- Das konservierte Gen DmX kodiert für ein WD-Repeat-Protein...
- Aufbau und Lokalisation des Gens DmX..
- Erzeugung DmX-mutanter Drosophila-Stämme.
- Die WD-Wiederholungseinheiten: eine einheitliche Architektur für diverse Funktionen
- Das WD-Repeat-Protein DMX..
- DMX könnte in der Zellmembran eingelagert sein
- Ist DmX ein maternales Effektgen?
- Ist DMX am vesikulären Transport beteiligt?
- Die Sequenzierung der nächsten Generation erweitert die Analyse kompletter Genome und Transkriptome.
- Methoden der Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) ....
- Genexpressionsanalysen mittels RNA-Seq...
- Die Illumina (Solexa)-Technologie
- Zielsetzung....
- MATERIAL UND METHODEN..
- Kreuzungen von Drosophila melanogaster.....
- Fliegenhaltung....
- Fliegenkreuzungen...
- Umbalancierung des DmX-mutierten X-Chromosoms.
- Absammeln von Larven zur Gewinnung des Rohmaterials.
- Molekulargenetische Methoden.
- Primer-Design
- Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
- Isolierung von Total-RNA..
- Konzentrations- und Qualitätsbestimmung der RNA...
- Gelelektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren.
- Gewinnung der DNA aus Agarose-Gelen.........
- Exonuklease I/Alkalische Phosphatase- (Exo/SAP-) Behandlung.
- DNA-Sequenzierung.
- Auswertung der Sequenzdaten.
- Herstellung einer cDNA-Bibliothek für die Sequenzierung der nächsten Generation und Erstellung der Cluster.
- Illumina-Sequenzierung.
- Bioinformatische Methoden
- Auswertung der Rohdaten..
- Zusammenstellung der Referenz-Genoms.
- Entfernung repetitiver Elemente aus den Sequenzdaten. .........
- Kartierung/Mapping der Transkriptomdaten an Referenz-Sequenzen......
- Identifizierung putativer Exons und SNPs.
- Expressionsanalyse...
- Generierung von Listen differenziell exprimierter Gene und Transkriptvarianten der SVERWEIS-Formeln.
- Darstellungen differenzieller Genexpression mittels statistischer Analysen..
- Funktionelle Annotation
- BLAST.
- Lösungen und Puffer.
- ERGEBNISSE.
- Umbalancierung des DmX-mutierten X-Chromosoms.
- Geschlechter-Test.
- Referenzstamm.
- Kreuzungsergebnisse der Umbalancierung von DmX.
- Komplementationstest.
- Genotypische Untersuchung der Nachfolgegenerationen. .......
- RNA-Seq...
- Isolierung und Quantifizierung der Total-RNA.
- Überblick über die verwendete Auswertungsstrategie (Pipeline) der RNA-Seq.
- Zusammenstellung der Referenz-Genoms.
- Trimming und Analyse der RNA-Sequenzdaten..
- Kartierung der RNA-Sequenzdaten ..
- Analyse des Gens DmX auf die erwartete Punktmutation ..........\li>
- Identifizierung differenzieller Genexpression.
- Der RPKM-Wert...........
- Hierarchisches Clustern der Datensätze durch Heat Maps........
- Der Fold Change-Wert.
- Der Ri-Wert ist ein Maß für signifikant differenziell exprimierte Gene.
- Transkriptomischer Vergleich von DmX-mutanten Stämmen zum Hintergrundstamm ywf..\li>
- Analyse des DmX-Gens.
- Erstellung von Listen differenziell exprimierter Gene und Transkripte mittels des R;- Werts
- Ausschluss nicht-proteinkodierender Gene.
- Analyse der differenziell exprimierten Gene und Transkript-varianten.
- Funktionelle Annotation mit Hilfe von DAVID und GOEAST Gene Ontology. _
- Erweiterte Analyse mit Hilfe der Gen Ontologie.....
- Analyse der differenziell regulierten Gene in KEGG Pathway ...
- Analyse der 50 am stärksten differenziell exprimierten Gene und Transkriptvarianten
- Ergänzende Untersuchung mit Ausschluss repetitive Elemente...
- DISKUSSION.
- RNA-Isolierung, -Aufarbeitung und Sequenzierung.
- Umbalancierung und genotypische Untersuchung von DmX-mutanten Fliegen
- Trimming und Kartierung der RNA-Sequenzdaten.
- Bewertung der Expressionsanalyse.
- Handelt es sich bei DmX um ein maternales Effektgen?..\li>
- Expressionsanalyse des Gens DmX.
- Transkriptomischer Vergleich von DmX-mutanten Stämmen zum Hintergrundstamm ywf.......
- Der Phosphatidylinositol-Metabolismus ist in DmX-Mutanten hoch-reguliert ..........\li>
- Vermutlich ist DMX an endozytotischen Prozessen beteiligt
- DMX könnte in der Regulation der terminalen Schritte der Exozytose beteiligt sein
- Die Endo- und Exozytose bedingen sich gegenseitig.
- Apoptose....
- Notch und die V-ATPase.
- Einige Komponenten des Wnt-Signalwegs sind in DmX-mutanten Tieren hoch- reguliert............
- Die DmX-Mutation beeinflusst die Genexpression.........
- Die Replikation wird von DmX beeinflusst..\li>
- Nervensystem und Muskeln
- Die DmX-Mutation wirkt sich auf die Zellatmung aus.
- Induktion von Stressantworten
- Fazit: DmX-mutante Tiere scheinen zu verhungern
- Funktion des DmX-Gens
- Auswirkungen der DmX-Mutation auf die Genexpression
- Rolle des DmX-Gens bei verschiedenen zellulären Prozessen
- Analyse des Transkriptoms mithilfe von RNA-Seq
- Identifizierung von differentiell exprimierten Genen
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Diese Arbeit befasst sich mit der Analyse des Transkriptoms von DmX-mutanten Drosophila melanogaster Stämmen. Die Zielsetzung ist es, die Auswirkungen der DmX-Mutation auf die Genexpression in Drosophila Larven zu untersuchen und die Rolle des DmX-Gens bei verschiedenen zellulären Prozessen zu verstehen. Diese Arbeit soll dazu beitragen, das Wissen über die Funktion des DmX-Gens zu erweitern und die Auswirkungen der Mutation auf das gesamte Transkriptom zu beleuchten.
Zusammenfassung der Kapitel
Die Einleitung gibt einen Überblick über den Modellorganismus Drosophila melanogaster und das konservierte Gen DmX, das für ein WD-Repeat-Protein kodiert. Des Weiteren werden die Methoden der Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) und die Genexpressionsanalysen mittels RNA-Seq vorgestellt. Die Zielsetzung der Arbeit wird im letzten Abschnitt der Einleitung erläutert. Das Kapitel "Material und Methoden" beschreibt detailliert die in dieser Arbeit angewandten Methoden, einschließlich der Kreuzungen von Drosophila melanogaster, der molekulargenetischen Methoden und der bioinformatischen Verfahren. Die Ergebnisse werden im Kapitel "Ergebnisse" präsentiert, wobei die Umbalancierung des DmX-mutierten X-Chromosoms, die RNA-Seq-Analysen und die Identifizierung differenzieller Genexpression im Fokus stehen. Die Diskussion des Kapitels "Ergebnisse" erfolgt im Kapitel "Diskussion", in dem die Erkenntnisse aus den RNA-Seq-Daten interpretiert und die möglichen Auswirkungen der DmX-Mutation auf verschiedene zelluläre Prozesse erläutert werden.
Schlüsselwörter
Drosophila melanogaster, DmX-Gen, WD-Repeat-Protein, RNA-Sequenzierung, Transkriptom, Genexpression, differentielle Genexpression, RNA-Seq, bioinformatische Analyse, Funktionelle Annotation, zelluläre Prozesse.
- Quote paper
- Sarah Aurora Heß (Author), 2012, Analyse des Transkriptoms mutanter Drosophila melanogaster Stämme des Gens DmX, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/464066
