Das Gen DmX (Drosophila melanogaster X-chromosomal/Rabconnectin-3/Rbc3) ist ein evolutionär hochkonserviertes Gen. DmX scheint maßgeblich am Überleben des Organismus beteiligt zu sein, da DmX-mutante Drosophila melanogaster die Bewegungen und die Nahrungsaufnahme im ersten Larvenstadium einstellen und sterben. Die genaue Funktion von DMX bisher unbekannt und wird daher in dieser Arbeit systematisch untersucht.
Das Transkriptom DmX-mutanter Individuen von Drosophila melanogaster und des genetischen Hintergrundstamms ywf wurde analysiert. Nicht-mutante Tiere und DmX-mutante Tieren wurden gesammelt und für die Isolierung von Total-RNA verwendet. Diese wurde auf dem Illumina HiSeq2000 mittels eines 51 bp single-end-Laufs sequenziert. Daraus ergaben sich 281 Millionen Rohsequenzen, die durch das Programm CLC Genomics Workbench gekürzt und anschließend einer Kartierung gegen das annotierte Genom von D. melanogaster unterzogen wurden. Die im Vergleich zu ywf überexprimierten Gene (UP), sowie die unterexprimierten Gene (DOWN) der DmX-Mutanten wurden über Literatursuchen mittels bioinformatischer Werkzeuge auf funktionelle Annotationen hin analysiert.
Die Ergebnisse lieferten in DmX-mutanten Tieren eine differentielle Expression von Genen, die an endo- und exozytotischen Prozessen beteiligt ist, sowie an einigen katabolischen und anabolischen Stoffwechselwegen.
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG
1.1 Der Modellorganismus Drosophila melanogaster (Taufliege)
1.2 Das konservierte Gen DmX kodiert für ein WD-Repeat-Protein
1.2.1 Aufbau und Lokalisation des Gens DmX
1.2.2 Erzeugung DmX-mutanter Drosophila-Stämme
1.2.3 Die WD-Wiederholungseinheiten: eine einheitliche Architektur für diverse Funktionen
1.2.4 Das WD-Repeat-Protein DMX
1.2.5 DMX könnte in der Zellmembran eingelagert sein
1.2.6 Ist DmX ein maternales Effektgen?
1.2.7 Ist DMX am vesikulären Transport beteiligt?
1.3 Die Sequenzierung der nächsten Generation erweitert die Analyse kompletter Genome und Transkriptome
1.3.1 Methoden der Sequenzierung der nächsten Generation (NGS)
1.3.2 Genexpressionsanalysen mittels RNA-Seq
1.3.3 Die Illumina (Solexa)-Technologie
1.4 Zielsetzung
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Kreuzungen von Drosophila melanogaster
2.1.1 Fliegenhaltung
2.1.2 Fliegenkreuzungen
2.1.3 Umbalancierung des DmX-mutierten X-Chromosoms
2.1.4 Absammeln von Larven zur Gewinnung des Rohmaterials
2.2 Molekulargenetische Methoden
2.2.1 Primer-Design
2.2.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
2.2.3 Isolierung von Total-RNA
2.2.4 Konzentrations- und Qualitätsbestimmung der RNA
2.2.5 Gelelektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren
2.2.6 Gewinnung der DNA aus Agarose-Gelen
2.2.7 Exonuklease I/Alkalische Phosphatase- (Exo/SAP-) Behandlung
2.2.8 DNA-Sequenzierung
2.2.9 Auswertung der Sequenzdaten
2.2.10 Herstellung einer cDNA-Bibliothek für die Sequenzierung der nächsten Generation und Erstellung der Cluster
2.2.11 Illumina-Sequenzierung
2.3 Bioinformatische Methoden
2.3.1 Auswertung der Rohdaten
2.3.2 Zusammenstellung der Referenz-Genoms
2.3.3 Entfernung repetitiver Elemente aus den Sequenzdaten
2.3.4 Kartierung/Mapping der Transkriptomdaten an Referenz-Sequenzen
2.3.5 Identifizierung putativer Exons und SNPs
2.3.6 Generierung von Listen differenziell exprimierter Gene und Transkriptvarianten der Expressionsanalyse
2.3.7 SVERWEIS-Formeln
2.3.8 Darstellungen differenzieller Genexpression mittels statistischer Analysen
2.3.9 Funktionelle Annotation
2.3.10 BLAST
2.4 Lösungen und Puffer
3 ERGEBNISSE
3.1 Umbalancierung des DmX-mutierten X-Chromosoms
3.1.1 Geschlechter-Test
3.1.2 Referenzstamm
3.1.3 Kreuzungsergebnisse der Umbalancierung von DmX
3.1.4 Komplementationstest
3.2 Genotypische Untersuchung der Nachfolgegenerationen
3.3 RNA-Seq
3.3.1 Isolierung und Quantifizierung der Total-RNA
3.3.2 Überblick über die verwendete Auswertungsstrategie (Pipeline) der RNA-Seq
3.3.3 Zusammenstellung der Referenz-Genoms
3.3.4 Trimming und Analyse der RNA-Sequenzdaten
3.3.5 Kartierung der RNA-Sequenzdaten
3.4 Analyse des Gens DmX auf die erwartete Punktmutation
3.5 Identifizierung differenzieller Genexpression
3.5.1 Der RPKM-Wert
3.5.2 Hierarchisches Clustern der Datensätze durch Heat Maps
3.5.3 Der Fold Change-Wert
3.5.4 Der Rj-Wert ist ein Maß für signifikant differenziell exprimierte Gene
3.6 Transkriptomischer Vergleich von DmX-mutanten Stämmen zum Hintergrundstamm ywf
3.6.1 Analyse des DmX-Gens
3.6.2 Erstellung von Listen differenziell exprimierter Gene und Transkripte mittels des Rj-Werts
3.6.3 Ausschluss nicht-proteinkodierender Gene
3.6.4 Analyse der differenziell exprimierten Gene und Transkript-varianten
3.6.5 Funktionelle Annotation mit Hilfe von DAVID und GOEAST Gene Ontology
3.6.6 Erweiterte Analyse mit Hilfe der Gen Ontologie
3.6.7 Analyse der differenziell regulierten Gene in KEGG Pathway
3.6.8 Analyse der 50 am stärksten differenziell exprimierten Gene und Transkriptvarianten
3.6.9 Ergänzende Untersuchung mit Ausschluss repetitive Elemente
4 DISKUSSION
4.1 Umbalancierung und genotypische Untersuchung von DmX-mutanten Fliegen
4.2 RNA-Isolierung, -Aufarbeitung und Sequenzierung
4.3 Trimming und Kartierung der RNA-Sequenzdaten
4.4 Bewertung der Expressionsanalyse
4.5 Handelt es sich bei DmX um ein maternales Effektgen?
4.6 Expressionsanalyse des Gens DmX
4.7 Transkriptomischer Vergleich von DmX-mutanten Stämmen zum Hintergrundstamm ywf
4.7.1 Der Phosphatidylinositol-Metabolismus ist in DmX-Mutanten hoch-reguliert
4.7.2 Vermutlich ist DMX an endozytotischen Prozessen beteiligt
4.7.3 DMX könnte in der Regulation der terminalen Schritte der Exozytose beteiligt sein
4.7.4 Die Endo- und Exozytose bedingen sich gegenseitig
4.7.5 Apoptose
4.7.6 Notch und die V-ATPase
4.7.7 Einige Komponenten des Wnt-Signalwegs sind in DmX-mutanten Tieren hoch-reguliert
4.7.8 Die DmX-Mutation beeinflusst die Genexpression
4.7.9 Die Replikation wird von DmX beeinflusst
4.7.10 Nervensystem und Muskeln
4.7.11 Die DmX-Mutation wirkt sich auf die Zellatmung aus
4.7.12 Induktion von Stressantworten
4.8 Fazit: DmX-mutante Tiere scheinen zu verhungern
5 ZUSAMMENFASSUNG und AUSBLICK
Zielsetzung & Themen
Das Hauptziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der Funktion des evolutionär hochkonservierten, X-chromosomalen Gens DmX bei Drosophila melanogaster mittels einer Transkriptomanalyse. Da eine DmX-Mutation Letalität im Larvenstadium verursacht, wird durch den Vergleich des Transkriptoms DmX-mutanter Larven mit dem Hintergrundstamm ywf erforscht, welche zellulären Stoffwechselwege und Signalprozesse durch das Fehlen der funktionsfähigen DMX-Proteine beeinflusst werden, um so Aufschluss über die Todesursache und die physiologische Funktion des Gens zu erhalten.
- Genetische Stabilisierung und Charakterisierung DmX-mutanter Fliegenstämme
- Durchführung von RNA-Sequenzierungen mittels Next Generation Sequencing (NGS)
- Bioinformatische Auswertung der Genexpression und Identifizierung differenziell exprimierter Gene
- Funktionelle Annotation der betroffenen Signal- und Stoffwechselwege (z. B. Phosphatidylinositol-Weg, Endozytose, Zellatmung)
- Interpretation der physiologischen Auswirkungen der DmX-Mutation auf die Vitalität der Larven
Auszug aus dem Buch
1.2.7 Ist DMX am vesikulären Transport beteiligt?
Aufgrund einiger Studien wird eine Funktion von DMX an synaptischen Vesikeln vermutet, insbesondere in Verbindung mit dem Rab3A-Protein (Weil 2000). Die Rab-Superfamilie (Ypt in der Hefe) unter den kleinen G-Proteinen besitzen eine wichtige Funktion beim intrazellulären Vesikeltransport (Takai et al. 1996), indem sie die speziellen sekretorischen und endozytotischen Wege regulieren (Darchen und Goud 2000). Der Name Rab leitet sich ab von „Ras related in brain“, hervorgegangen aus Versuchen mit Säugetieren (Touchot et al. 1987). Säugetiere weisen vier Mitglieder der Rab3-Familie auf: Rab3A, Rab3B, Rab3C und Rab3D. Drosophila besitzt hingegen nur ein Rab3-Protein. Im Gegensatz zu dem ubiquitären Vorkommen vieler Rab-Proteine wird Rab3 spezifisch in Neuronen und endokrinen Zellen exprimiert und übt dort seine Funktion als Regulator der Sekretion von Hormonen und Neurotransmittern aus, weshalb es in den sekretorischen Vesikeln (SV) zu finden ist (Darchen und Goud 2000).
Rab-Proteine werden im Allgemeinen mit dem intrazellulären vesikulären Transport in Verbindung gebracht. Dieser kann in vier Teilschritte untergliedert werden, wobei Rab3A v. a an den Schritten von dem Andocken bis zur Fusion vermutet wird (Abb. 1.5 A, B). Rab-GTPasen kontrollieren diese endozytischen und exozytotischen Transportwege, indem sie die Interaktion von Molekülen an der Transportvesikelmembran mit Molekülen der Akzeptormembran regulieren. Unterschiedliche Rab-Proteine scheinen in den verschiedenen Stadien des Vesikelverkehrs spezifische Funktionen in Bezug auf Transport, Targeting und Fusion von Vesikeln innezuhaben (Takai et al. 1996). Weiterhin wird angenommen, dass Rab GTPasen an einer Transportfunktionen entlang des Zytoskelettes beteiligt sind (Nielsen et al. 1999).
Zusammenfassung der Kapitel
1 EINLEITUNG: Einführung in das Forschungsthema der DmX-Mutation bei Drosophila melanogaster und Erläuterung der verwendeten Next-Generation-Sequencing-Technologien zur Analyse der Genexpression.
2 MATERIAL UND METHODEN: Detaillierte Beschreibung der genetischen Kreuzungsschemata zur Stammentwicklung sowie der molekularbiologischen und bioinformatischen Protokolle zur Isolierung, Sequenzierung und Auswertung der RNA-Daten.
3 ERGEBNISSE: Präsentation der experimentellen Daten zur Umbalancierung, der molekulargenetischen Validierung der Mutanten und der umfassenden Analyse der differenziellen Genexpression mittels RPKM- und Rj-Werten sowie funktioneller Annotationen.
4 DISKUSSION: Interpretative Einordnung der Ergebnisse, insbesondere der Beteiligung von DmX an zellulären Signalwegen, Endozytose und Stoffwechselprozessen, mit dem Fazit, dass die Letalität der DmX-Mutanten durch eine Beeinträchtigung der Zellatmung und ein Verhungern der Larven bedingt ist.
5 ZUSAMMENFASSUNG und AUSBLICK: Zusammenfassende Darstellung der gewonnenen Erkenntnisse über die physiologische Funktion von DmX und Vorschläge für weiterführende Analysen.
Schlüsselwörter
Drosophila melanogaster, DmX, Genexpression, RNA-Seq, Next Generation Sequencing, WD-Repeat-Protein, Endozytose, Exozytose, Rab3, Signaltransduktion, Zellatmung, oxidative Phosphorylierung, Letalmutation, Stoffwechsel, Genomik
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit untersucht die molekulargenetischen und transkriptionellen Folgen einer DmX-Mutation im Modellorganismus Drosophila melanogaster, die zum Absterben der Larven führt.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Die Schwerpunkte liegen auf der Transkriptomanalyse mittels RNA-Seq, der Untersuchung von vesikulären Transportmechanismen (Endo-/Exozytose) und der Aufklärung von Stoffwechseldefekten.
Was ist das primäre Ziel oder die Forschungsfrage?
Das Ziel ist die Identifizierung von Genen und Signalwegen, deren veränderte Expression in DmX-mutanten Tieren die Letalität begründet, um so eine Funktion für das Gen DmX abzuleiten.
Welche wissenschaftliche Methode wird verwendet?
Es kommen genetische Kreuzungsmethoden zur Linienpflege sowie molekularbiologische Standardverfahren (PCR, RNA-Isolierung) und moderne Hochdurchsatz-Sequenzierung (Illumina RNA-Seq) mit anschließender bioinformatischer Datenverarbeitung zum Einsatz.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil analysiert detailliert die Kartierung der Sequenzdaten, die Identifizierung differenziell exprimierter Gene und die funktionelle Einordnung dieser Ergebnisse in den Kontext bekannter Stoffwechsel- und Signalwege wie den Phosphatidylinositol-Metabolismus.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Wichtige Begriffe sind DmX, Drosophila, Transkriptomanalyse, Next Generation Sequencing, vesikulärer Transport, Signaltransduktion und Zellatmung.
Warum ist das Gen DmX für die Forschung interessant?
DmX kodiert für ein WD-Repeat-Protein, das evolutionär hochkonserviert ist, was auf eine fundamentale, aber bisher nicht vollständig verstandene Rolle bei der Entwicklung und Zellfunktion hindeutet.
Welche Schlussfolgerung zieht die Autorin über das Absterben der DmX-Mutanten?
Das Fazit der Arbeit lautet, dass die DmX-Mutanten wahrscheinlich nicht an Apoptose sterben, sondern aufgrund einer massiven Beeinträchtigung der Zellatmung und der oxidativen Phosphorylierung letztlich verhungern.
- Quote paper
- Sarah Aurora Heß (Author), 2012, Analyse des Transkriptoms mutanter Drosophila melanogaster Stämme des Gens DmX, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/464066
