Das olfaktorische System der Säugetiere ist in der Lage, eine riesige Zahl von Duftstoffen in geringsten Konzentrationen zu detektieren und diese auch voneinander zu unterscheiden. Diese enorme Kapazität wird von einer sehr großen Zahl an verschiedenen Odorantrezeptoren (OR) in den Sinneszellen des olfaktorischen Epithels (OE) geleistet. Die OR gehören zu den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und stellen in manchen Spezies mit mehr als 1000 Subtypen die größte Genfamilie dar. Bei Vertebraten, die an Land leben, müssen die flüchtigen Duftstoffe dabei aus der Luft die hydrophile Barriere des Mucus passieren, um an die olfaktorischen Sinneszellen (OSZ) mit den Rezeptoren zu gelangen. Dabei binden sogenannte Odorant-Bindeproteine (OBPs) die vorwiegend hydrophoben, organischen Moleküle und transferieren sie zu ihren Rezeptoren. OBPs sind kleine (etwa 20 kDa), wasserlösliche Proteine, die in hohen Konzentrationen vom olfaktorischen Epithel in den nasalen Mucus sekretiert werden; Sie gehören zu den Lipocalinen, welche sich durch eine acht-strängige β-Fassstruktur, die C-terminal von einer α-Helix flankiert wird, auszeichnen. Dabei bildet das β-Fass die zentrale, hydrophobe Bindungstasche. Die Proteinoberfläche ist meist hydrophil.
Für die Bindung tausender unterschiedlicher Duftstoffmoleküle stehen interessanterweise nur sehr wenige verschiedene Odorant-Bindeproteine zur Verfügung. Bei der Maus existieren beispielsweise nur 4 Subtypen; dies impliziert, dass jedes Bindeprotein eine Vielzahl unterschiedlicher Komponenten binden müsste. Das Prinzip, nach dem die Duftmoleküle mit den unterschiedlichen Bindeproteinen interagieren, ist noch nicht vollständig aufgeklärt.
Inzwischen wurden verschiedene OBP-Subtypen aus mehreren Spezies daraufhin untersucht. Dabei wurde die Wechselwirkung zwischen Liganden und OBPs entweder durch Modellierung und Simulationen mit Computerprogrammen oder durch die Verfügbarkeit eines reinen OBPs für direkte Bindungsstudien analysiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde das OBP2b-Bindeprotein der Maus bearbeitet. Für dieses existiert ein orthologes OBP bei der Ratte; Vergleiche speziell solcher Proteine könnten dazu beitragen, das Prinzip der Wechselwirkungen von OBPs mit Liganden einem Verständnis näher zu bringen. Dazu sollte in der vorliegenden Studie das mOBP2b in zwei verschiedenen Varianten heterolog in E.coli exprimiert und produziert werden.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
2. Material und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Versuchstier (Mus musculus familiaris domesticus)
2.1.2 Geräte
2.1.3 Chemikalien
2.1.3.1 Allgemeine Substanzen
2.1.3.2 Spezielle Produkte und Kits für die Molekularbiologie
2.1.3.3 Klonierungsvektoren
2.1.3.4 Oligonukleotide
2.1.3.5 DNA und RNA modifizierende Enzyme
2.1.4 Bakterienstämme
2.2 Methoden
2.2.1 RT- PCR-Analysen
2.2.1.1 Gewebepräparation zur RNA-Isolierung
2.2.1.2 RNA-Isolation mit NucleoSpin® RNA II-Kit (Macherey-Nagel)
2.2.1.3 cDNA-Synthese (Reverse Transkription)
2.2.1.4 Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen mit Hilfe der PCR
2.2.1.5 Agarose-Gelelektrophorese
2.2.1.5.1 Gießen des Agarosegels
2.2.1.5.2 Vorbereitung der RT-PCR-Proben
2.2.1.5.3 Elektrophoretische Auftrennung der DNA-Fragmente
2.2.1.5.4 Sichtbarmachen und Ausschneiden der DNA-Banden
2.2.2 Klonierung amplifizierter DNA-Fragmente
2.2.2.1 Aufreinigung der DNA aus dem Agarose-Gel
2.2.2.2 Restriktionsverdau von Insert und Vektor
2.2.2.2.1 Verdau der Vektoren
2.2.2.2.2 Verdau der Inserts
2.2.2.3 Poly - Adenylierung
2.2.2.4 Ligation
2.2.2.5 Elektrokompetente Bakterienzellen
2.2.2.5.1 Herstellung elektrokompetenter Bakterienzellen
2.2.2.5.2 Transformation elektrokompetenter Bakterienzellen
2.2.2.6 Chemisch kompetente Bakterienzellen
2.2.2.6.1 Herstellung chemisch kompetenter Bakterienzellen
2.2.2.6.2 Transformation chemisch kompetenter Bakterienzellen
2.2.2.7 Ausplattieren der transformierten Bakterien
2.2.2.8 Selektion der Bakterienkolonien
2.2.3 Isolierung und Restriktionsanalyse rekombinanter Plasmide
2.2.3.1 Minipräparation
2.2.3.2 Midipräparation
2.2.3.3 Restriktionsanalyse
2.2.4 Sequenzierung klonierter DNA
2.2.4.1 Sequenzierung
2.2.4.2 Analyse der Sequenzdaten
2.2.5 Expression und Aufreinigung von mOBP2b
2.2.5.1 Expression und Aufreinigung über das Vektorsystem pET22b
2.2.5.1.1 Überprüfung der Proteinexpression über IPTG-Induktion
2.2.5.1.2 Expression des mOBP2b in E. coli BL21 (pET22b)
2.2.5.1.3 Periplasmatische Aufreinigung
2.2.5.2 Expression und Aufreinigung über das Vektorsystem pQE-32
2.2.5.2.1 Überprüfung der Proteinexpression
2.2.5.2.2 Expression des mOBP2b in E. coli BL21 (pQE-32)
2.2.5.2.3 His-Tag Aufreinigung über Ni-Affinitätschromatografie
2.2.5.3 Charakterisierung der Proteine mit der SDS-PAGE
2.2.5.3.1 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
2.2.5.3.2 Färbung der Gele mit Coomassie-Brilliant-blue (CBb)
3. Ergebnisse
3.1 Identifizierung des OBP2b Gens der Maus in der NCBI Gen- Datenbank
3.1.1 Identifizierung der Signalsequenz
3.2 Oligonukleotid - Primer für die PCR
3.2.1 Klonierung in den Vektor pQE-30
3.2.1.1 PCR-pQE-30-forward-Primer (G324)
3.2.1.2 PCR-pQE-32-reverse-Primer (G325)
3.2.2 Klonierung in den Vektor pET-22b (+)
3.2.2.1 PCR-pET22b-forward-Primer (G340)
3.2.2.2 PCR-pET22b-reverse-Primer (G323)
3.3 PCR - Amplifikation der mOBP2b - Gensequenz aus der cDNA
3.4 Klonierung in Vektor pGEM-T
3.5 Klonierung der Expressionskonstrukte
3.5.1 Klonierung in pQE-32
3.5.2 Klonierung in pET22b
3.6 Expression von mOBP2b in E.coli BL-21
3.6.1 Expression über das pET22b-Vektorsystem
3.6.1.1 Überprüfung der Expression in E.coli BL21 (pET22b)
3.6.1.2 Proteinaufreinigung aus dem pET22b-Expressionssystems
3.6.1.2.1 Periplasmatische Aufreinigung
3.6.2 Expression über das pQE-32-Vektorsystem
3.6.2.1 Überprüfung der Expression in pQE-32
3.6.2.2 Proteinaufreinigung aus dem pQE-32-Expressionssystems
3.6.2.2.1 Aufreinigung der Bakterienkultur
3.6.2.2.2 His-Tag-Proteinaufreinigung über Affinitätschromatografie
4. Diskussion
4.1 Expressionssystem E.coli BL21 (DE3)
4.2 Expressionsvektoren
4.2.1 Expression über das pQE32-Vektorsystem
4.2.2 Expression über das pET22b-Vektorsystem
4.3 Ausblick zum Maus Odorant-Bindeprotein 2b
5. Zusammenfassung
6. Summary
Zielsetzung & Themen
Die vorliegende Arbeit hat das Ziel, das Odorant-Bindeprotein 2b der Maus (mOBP2b) heterolog in E. coli zu exprimieren und zu produzieren, um durch die Verfügbarkeit reiner Proteinproben ein tieferes Verständnis der Prinzipien der Liganden-Wechselwirkung bei Odorant-Bindeproteinen zu erlangen.
- Identifizierung der mOBP2b-Gensequenz und Signalsequenzanalyse
- Klonierung des Zielgens in geeignete Expressionsvektoren (pQE-32, pET22b)
- Etablierung von Expressionsprotokollen in E. coli BL21 (DE3)
- Vergleich verschiedener Proteinaufreinigungsverfahren (periplasmatisch vs. Affinitätschromatographie)
- Evaluation der Proteinexpression mittels SDS-PAGE und Sequenzanalysen
Auszug aus dem Buch
1. EINLEITUNG
Das olfaktorische System der Säugetiere ist in der Lage, eine riesige Zahl von Duftstoffen in geringsten Konzentrationen zu detektieren und diese auch voneinander zu unterscheiden (Beets, 1970; Polak, 1973; Kirner et al., 2003). Diese enorme Kapazität wird von einer sehr großen Zahl an verschiedenen Odorantrezeptoren (OR) in den Sinneszellen des olfaktorischen Epithels (OE) geleistet. Die OR gehören zu den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und stellen in manchen Spezies mit mehr als 1000 Subtypen die größte Genfamilie dar (Zhang und Firestein, 2002).
Bei Vertebraten, die an Land leben, müssen die flüchtigen Duftstoffe dabei aus der Luft die hydrophile Barriere des Mucus passieren, um an die olfaktorischen Sinneszellen (OSZ) mit den Rezeptoren zu gelangen. Dabei binden sogenannte Odorant-Bindeproteine (OBPs) die vorwiegend hydrophoben, organischen Moleküle und transferieren sie zu ihren Rezeptoren (Bignetti et al., 1985; Pevsner and Snyder, 1990; Pelosi, 1994, 1996). OBPs sind kleine (etwa 20 kDa), wasserlösliche Proteine, die in hohen Konzentrationen vom olfaktorischen Epithel in den nasalen Mucus sekretiert werden (Pelosi, 1994); Sie gehören zu den Lipocalinen, welche sich durch eine acht-strängige β-Fassstruktur, die C-terminal von einer α-Helix flankiert wird, auszeichnen (Pelosi, 1994; Flower et al., 1993, 1996; Tegoni et al., 2000). Dabei bildet das β-Fass die zentrale, hydrophobe Bindungstasche. Die Proteinoberfläche ist meist hydrophil (Flower, 1996; Bianchet et al., 1996; Tegoni et al., 1996; Spinelli et al., 1998).
Für die Bindung tausender unterschiedlicher Duftstoffmoleküle stehen interessanterweise nur sehr wenige verschiedene Odorant-Bindeproteine zur Verfügung. Bei der Maus existieren beispielsweise nur 4 Subtypen; dies impliziert, dass jedes Bindeprotein eine Vielzahl unterschiedlicher Komponenten binden müsste. Das Prinzip, nach dem die Duftmoleküle mit den unterschiedlichen Bindeproteinen interagieren, ist noch nicht vollständig aufgeklärt.
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Beschreibt das olfaktorische System und die Funktion von Odorant-Bindeproteinen bei Säugetieren sowie die Zielsetzung, mOBP2b zur Untersuchung der Ligandeninteraktion zu produzieren.
2. Material und Methoden: Detailliert die verwendeten biologischen Materialien, Geräte, Chemikalien sowie die molekularbiologischen Verfahren wie RNA-Isolation, PCR, Klonierung und Proteinaufreinigung.
3. Ergebnisse: Dokumentiert die Identifizierung der Gensequenz, die erfolgreiche Klonierung in die Vektoren pQE-32 und pET22b sowie die Überprüfung der Proteinexpression in E. coli.
4. Diskussion: Erörtert die Wahl des Expressionssystems, die Herausforderungen der Proteinaufreinigung und gibt einen Ausblick auf künftige Bindungsstudien.
5. Zusammenfassung: Fasst das Vorgehen und die wesentlichen Erkenntnisse der Studie zusammen.
6. Summary: Englische Zusammenfassung der Arbeit.
Schlüsselwörter
Maus, Odorant-Bindeprotein, mOBP2b, Heterologe Expression, E. coli BL21, Klonierung, PCR, Lipocalin, Proteinaufreinigung, Affinitätschromatographie, SDS-PAGE, Sequenzanalyse, Signalpeptid, Periplasma, Ligandenbindung
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit befasst sich mit der heterologen Expression des Odorant-Bindeproteins 2b der Maus in E. coli-Bakterien.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Die zentralen Felder sind die Molekularbiologie, speziell die Klonierung von Genen, die Proteinexpression in bakteriellen Systemen und die biochemische Aufreinigung von Proteinen.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Das primäre Ziel ist es, das OBP2b-Protein der Maus in reiner Form herzustellen, um zukünftige Untersuchungen zur Bindungsspezifität von Duftmolekülen zu ermöglichen.
Welche wissenschaftlichen Methoden wurden verwendet?
Es wurden Verfahren wie die RNA-Isolation, reverse Transkription, PCR-Amplifikation, Vektorklonierung (pQE-32, pET22b), bakterielle Transformation, SDS-PAGE und Protein-Aufreinigung mittels Affinitätschromatographie eingesetzt.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil dokumentiert das methodische Vorgehen bei der Klonierung, die experimentelle Durchführung der Expression in verschiedenen Vektorsystemen und die anschließende Analyse der Ergebnisse durch Gelelektrophorese.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Wichtige Begriffe sind unter anderem OBP2b, Maus, heterologe Expression, Klonierung, Expressionsvektoren und Affinitätschromatographie.
Warum wurde das E. coli-System für die Expression gewählt?
E. coli wurde aufgrund seiner hohen Wachstumsrate, der kostengünstigen Kultivierung und der etablierten Protokolle für die Produktion rekombinanter Proteine als Wirtssystem ausgewählt.
Welche Rolle spielt die Signalsequenz für die Klonierung?
Die natürliche Signalsequenz des Proteins muss entfernt werden, damit eine korrekte Expression des reifen Bindeproteins in den E. coli-Bakterien möglich ist.
Welche Bedeutung hat das pET22b-System in dieser Studie?
Das pET22b-System dient der periplasmatischen Produktion des Proteins, was bei erfolgreicher Umsetzung zu einem höheren Reinheitsgrad des isolierten Proteins führen kann.
Was ist das Hauptergebnis bezüglich der Proteinproduktion?
Es konnte erfolgreich ein Protein mit der passenden apparenen Molekülgröße von etwa 22 kDa exprimiert werden, was die Basis für weiterführende Bindungsstudien bildet.
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- Anonym (Author), 2014, Heterologe Expression des Maus Odorant-Bindeproteins 2b, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/468100
